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方法文章

荧光磁性纳米颗粒的摄取用于测定昆虫的液体吸收能力

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DOI：

10.3791/56619

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2017年12月20日

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1Department of Biological Sciences, Kent State University at Stark, 2Department of Mathematical Sciences, Clemson University, 3Liquid Crystal Institute, Kent State University, 4Brookhaven National Laboratory

本文内容

摘要

吸液性昆虫能够从多孔表面获取微量液体。本实验方案描述了一种利用含荧光磁性纳米颗粒的喂养溶液，直接测定昆虫从多孔表面摄取液体能力的方法。

摘要

吸食液体的昆虫会摄取多种液体，这些液体在环境中以液滴、液膜形式存在，或局限于微小孔隙中。研究液体摄取过程需要评估口器结构与功能之间的关系；然而，以往对液体摄取机制的推断主要基于结构形态的观察，有时缺乏实验验证。本文报道了一种利用少量液体评估蝴蝶（鳞翅目）和蝇类（双翅目）液体摄取能力的新方法。将昆虫喂食含有荧光磁性纳米颗粒的20%蔗糖溶液，溶液置于特定孔径的滤纸上。随后取出昆虫的嗉囊（用于储存液体的内部结构），置于共聚焦显微镜下观察。用磁铁在嗉囊附近移动，检测其中是否存在纳米颗粒，从而判断昆虫是否能够摄入液体。该方法揭示了一种在鳞翅目和双翅目昆虫从多孔表面取食时可能普遍存在的摄食机制（毛细作用和液桥形成）。此外，该方法还可用于研究多种吸液昆虫的取食机制，包括在疾病传播和仿生学中具有重要意义的种类，以及可能涉及纳米或微米级通道、需要验证液体运输过程的其他研究。

引言

许多昆虫类群具有适应摄取液体食物的口器（喙），例如花蜜、腐烂果实、树液（例如 双翅目1、鳞翅目2、膜翅目3）、木质部汁液（半翅目4）、眼泪（鳞翅目5）以及血液（虱毛目6、蚤目7、双翅目7、半翅目8、鳞翅目9）。昆虫摄取液体的能力与生态系统健康（例如 传粉作用10）、疾病传播4,11、生物多样性形成2,12以及趋同进化研究13密切相关。尽管食物来源多种多样，某些液食性昆虫的共同特征是能够获取微量液体，这些液体可能局限于微米或纳米级液滴、液膜或孔隙表面。

鉴于吸食液体的昆虫种类繁多（占所有动物物种的20%以上14,15），且能够以多种食物来源为食，理解它们的取食行为和液体摄取机制在许多领域中具有重要意义。例如，昆虫口器的功能在仿生技术的发展中发挥了作用，如微流控装置，这类装置能够通过类似于昆虫摄食的方法实现微量液体的采集16。然而，研究液体摄取机制的一个基本问题在于，不仅需要了解昆虫如何摄取液体，还需获得支持该机制的实验证据。仅以行为（如使用喙器探触12,17）作为摄食的指标是不够的，因为这并不能确认液体是否成功被摄取，也无法确定液体在昆虫体内输送的路径。此外，在液体量较少的条件下开展实验更能模拟自然摄食情境，因为在自然界中液体资源通常是有限的2,12。

利用X射线相位衬度成像技术研究了君主斑蝶（Danaus plexippus L.）如何从多孔表面摄取少量液体12。君主斑蝶通过喙部表面角质突起（背侧 legulae）之间的间隙，利用毛细作用将局限于微小孔隙中的液体引入食物通道。进入的液体在食物通道壁上形成液膜，随后因Plateau不稳定性而增长并坍缩成液桥12,18，再由头部的吸泵作用将液桥输送至蝴蝶的消化道。尽管X射线相位衬度成像技术是观察昆虫体内液体流动的理想工具12,19,20,21，但该技术并不普及，因此亟需一种更为便捷的方法，以快速评估昆虫摄取和吞咽液体的能力。

确定进食机制是否 D. plexippus 适用于其他鳞翅目昆虫以及双翅目昆虫（这两类群均从多孔表面摄取液体），Lehnert 等13 应用了一种用于评估昆虫从多孔表面摄取少量液体能力的技术，该技术在此详细报道。尽管本文所述方案针对使用湿润多孔表面的研究，但该方法可经调整用于其他研究，例如涉及积液取食机制的研究。此外，该技术的应用还可拓展至微流控和仿生技术等其他领域。

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方案

1. 昆虫种类、溶液制备及饲喂装置设置

注意：选择菜粉蝶（Pieris rapae L.，粉蝶科）作为鳞翅目的代表性物种，是因为其在先前关于液体摄取能力及口器形态的研究中已被广泛使用22,23。家蝇（Musca domestica L.，蝇科）和蓝瓶蝇（Calliphora vomitoria L.，丽蝇科）则因其常被观察到在多孔表面取食而被采用13。

  1. 从昆虫供应商处订购P. rapae的幼虫，并在人工饲料（见材料表）上饲养，置于环境培养箱中，条件设置为23 °C、光周期18小时光照:6小时黑暗，直至其化蛹并羽化为成虫。订购M. domestica和C. vomitoria的蛹，在与P. rapae相同的环境条件下进行饲养。在取食实验前，成虫自蛹羽化后不再喂食。
  2. 配制20%蔗糖溶液（对照）和20%含纳米颗粒的蔗糖溶液，用于检测液体摄取情况。通过将荧光磁性纳米颗粒（氧化铁，表面包被聚丙烯酸，直径约20 nm）24加入20%蔗糖溶液中（终浓度为1 mg/mL dH2O纳米颗粒与20%蔗糖溶液按1:1混合）来制备纳米颗粒溶液。配制1×磷酸盐缓冲液（PBS）（将10× PBS用dH2O稀释至1×，pH 7.4），用于解剖操作。
  3. 设置一个取食装置，包括带夹具的手动操作器和独立的取食平台（平坦的基座）（图1）。在取食平台上放置凹面载玻片，并在附近准备好孔径分别为11、20、30、41或60 µm的尼龙网滤膜，以及孔径为1、5、8或10 µm的膜滤器，用于后续取食实验。

2. 喂养方案

  1. 将昆虫的身体、足和翅膀包裹在折叠的纸巾中，调整昆虫位置，使其头部和口器暴露在外。将昆虫的翅膀置于两片显微镜载玻片之间，并用操作器上的夹具固定载玻片，使昆虫悬置于 feeding stage 上方。图1).
  2. 使用移液器将30 µL的20%蔗糖溶液或20%蔗糖纳米颗粒溶液滴加到凹面载玻片的中央。将一张特定孔径的滤纸置于凹面载玻片上，使滤纸中心与纳米颗粒溶液液滴对齐。液滴与滤纸接触后，溶液将沿滤纸扩散并填充滤纸孔隙（图1).
    注意：将滤纸置于液滴上方，而非相反，以尽量减少昆虫取食区域滤纸表面可能存在的纳米颗粒。
  3. 使用操纵器将昆虫定位，使其口器的远端区域仅能接触取食装置上湿润的滤纸图1用昆虫针将口器伸展到滤纸上，让昆虫取食45秒。
  4. 为尽量减少昆虫取食滤纸表面可能存在的液膜，应将口器置于与载玻片平坦部分接触的滤纸区域上即，而不是载玻片凹陷部分的正上方）。如果昆虫没有表现出取食兴趣，可用昆虫针将口器固定在滤纸上，持续整个取食时间。

3. 解剖步骤

  1. 将 PBS 溶液置于 50 mm 的表面皿中，确保溶液量足以覆盖昆虫身体。将表面皿置于体视显微镜下，并将昆虫解剖器械（弹簧式显微解剖剪、昆虫针、尖头解剖镊）放置在体视显微镜旁。
  2. 饲喂后，将昆虫从滤纸上取出，闭合双翅并用手持住。使用弹簧式显微解剖剪去除昆虫的头部、足和翅膀，并将昆虫放入表面皿中的 PBS 溶液内（图 2）。
  3. 如有需要，可在解剖前对昆虫进行麻醉。用镊子夹住昆虫腹部远端附近的体壁外骨骼。主手持弹簧式显微解剖剪，从腹部后端开始，沿腹部侧面朝前方向剪开外骨骼，直至到达胸部。操作时需特别注意仅剪开外骨骼，避免损伤昆虫体内的消化道（图 2）。
  4. 继续使用解剖剪对外骨骼进行额外剪切，打开腹部以暴露内部的消化道（图 2）。借助昆虫针移除腹部外骨骼、脂肪体及其他组织，并将其移出表面皿以便后续处理，仅保留胸部和消化道在表面皿中。
    注意：解剖后将暴露出嗉囊，该结构为囊状（消化道的延伸部分），位于胸部与腹部交界处附近。
  5. 若嗉囊未暴露，可用剪刀对胸部进行额外切口，直至显露出嗉囊。一旦可见嗉囊，即剪除昆虫其余部分，仅在表面皿中保留带有嗉囊的消化道（图 2）。
    注意：鳞翅目昆虫的嗉囊几乎透明，质地类似玻璃纸；若未充满液体或未扩张，或在解剖过程中被剪破，则可能难以辨认。
  6. 使用尖头解剖镊将嗉囊转移至盖玻片（24 mm × 24 mm）上，用于后续成像（图 2）。

4. 摄入纳米颗粒的测定

  1. 使用精细尖头解剖镊子小心地将嗉囊放置在盖玻片上，注意避免破损。在倒置共聚焦显微镜下使用CY3通道（或相差模式）以20倍放大倍数进行成像。解剖后应立即对嗉囊成像，以防其干燥。
  2. 将一根磁力搅拌子（长度41.3 mm，直径8 mm）握在非操作显微镜载物台的手掌中。将磁力搅拌子在嗉囊附近来回摆动（距离嗉囊约10 mm），每次来回摆动持续约1秒（图2）。
  3. 摆动磁力搅拌子的同时，观察嗉囊内纳米颗粒的存在情况。一边缓慢前后移动载物台，一边通过显微镜目镜观察近乎透明的嗉囊内部是否有纳米颗粒的运动。若嗉囊中存在纳米颗粒，表明已成功摄食，这些颗粒将随磁力搅拌子的摆动而同步波动（图2）。

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结果

研究流体取食昆虫在取食能力上的模式差异，需要明确取食发生的时间。本文所述方案用于检验鳞翅目和双翅目昆虫中的限孔径假说13。限孔径假说认为，若孔隙的直径小于取食通道的直径，流体取食昆虫便无法从充满液体的孔隙中取食12。来自多孔表面的液体必须通过Plateau不稳定性18形成稳定的液桥，以克服将液体保留在孔隙中的毛细压力，并为吸泵作用提供可接触的液面。具有不同取食通道尺寸的昆虫（图3）预计在能够取食的最小孔径上存在差异。

每种生物的限制性孔径根据其个体在滤纸上摄食特定孔径时，有50%的受试个体能够摄食的能力来计算。13. 以20%蔗糖溶液（对照）饲喂的昆虫，其嗉囊中未发现纳米颗粒。解剖昆虫以检测纳米颗粒是否被...

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讨论

昆虫口器功能的传统研究主要基于宏观形态学分析（例如，鳞翅目昆虫的喙被认为功能类似于吸管25,26）；然而，近年来结合实验证据的研究已促使人们对昆虫口器的复杂性及其结构-功能关系的理解发生了范式转变2,12,13,22,27。尽管现代成像技术（如扫描电子显微镜23、共聚焦显微镜22、显微计算机断层扫描（micro-CT）28以及激光消融断层成像（图3））为形态学的精细研究提供了可能，...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究工作由美国国家科学基金会（NSF）资助，项目编号为 IOS 1354956。我们感谢佛罗里达大学佛罗里达自然历史博物馆麦克圭尔鳞翅目与生物多样性研究中心的 Andrew D. Warren 博士允许使用蝴蝶图像。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
20% 蔗糖溶液Domino Sugar用于与 dH2O 配制蔗糖溶液的糖
磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma-AldrichP549310X 浓缩液用 dH2O 稀释至 1X，用于昆虫解剖
单凹载玻片AmScopeBS-C6进食阶段设置所必需的载玻片
滤纸EMD MilliporeNY6004700 (60 µm)需要尼龙网滤膜和 Isopore 滤膜以形成昆虫进食用的多孔表面
滤纸EMD MilliporeNY4104700 (41 µm)需要尼龙网滤膜和 Isopore 滤膜以形成昆虫进食用的多孔表面
滤纸EMD MilliporeNY3004700 (30 µm)需要尼龙网滤膜和 Isopore 滤膜以形成昆虫进食用的多孔表面
滤纸EMD MilliporeNY2004700 (20 µm)需要尼龙网滤膜和 Isopore 滤膜以形成昆虫进食用的多孔表面
滤纸EMD MilliporeNY1104700 (11 µm)需要尼龙网滤膜和 Isopore 滤膜以形成昆虫进食用的多孔表面
滤纸EMD MilliporeTCTP04700 (10 µm)需要尼龙网滤膜和 Isopore 滤膜以形成昆虫进食用的多孔表面
滤纸EMD MilliporeTETP04700 (8 µm)需要尼龙网滤膜和 Isopore 滤膜以形成昆虫进食用的多孔表面
滤纸EMD MilliporeTMTP04700 (5 µm)需要尼龙网滤膜和 Isopore 滤膜以形成昆虫进食用的多孔表面
滤纸EMD MilliporeRTTP04700 (1 µm)需要尼龙网滤膜和 Isopore 滤膜以形成昆虫进食用的多孔表面
虹膜显微解剖剪Carolina Biological Supply Company623555用于解剖的剪刀
昆虫针（#1）Bioquip Products1208B1解剖和进食试验中使用的针
超细头解剖镊Carolina Biological Supply Company624684解剖器械
Leica M205 C 体视显微镜Leica MicrosystemsM205 C用于解剖的体视显微镜
倒置共聚焦显微镜OlympusIX81用于检测磁性纳米颗粒的荧光显微镜
Fisherbrand PTFE 一次性搅拌子FisherscientificS68067用于检测纳米颗粒的磁体
Kimtech Science Kimwipes 擦镜纸Kimberly-Clark Professional34155用于在进食试验中固定昆虫的纸巾
家蝇（Musca domestica）蛹Mantisplace.com实验用昆虫
蓝瓶蝇（Calliphora vomitoria）蛹Mantisplace.com实验用昆虫
菜粉蝶（Pieris rapae）幼虫Carolina Biological Supply Company144102实验用昆虫
Finnpipette F1 ThermoFisher Scientific4641080N用于分配液体的微量移液器
Finntip 250 移液器吸头ThermoFisher Scientific9400250微量移液器吸头
显微镜玻璃盖玻片（=盖片）（24 x 24 mm）AmScopeCS-S24-100用于在共聚焦显微镜下观察昆虫嗉囊的盖玻片

参考文献

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