本文描述了在葡萄中鉴定和表征基因家族的方法，该方法应用于拟南芥酵母毒性（Arabidopsis Tóxicos in Levadura，ATL）E3泛素连接酶家族。
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方法文章
葡萄树ATL E3泛素连接酶基因家族的全基因组鉴定与表达荟萃分析的综合工作流程
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
基因家族的分类与命名可显著促进对编码蛋白多样性的描述，并基于多个特征（如序列基序的存在、特定翻译后修饰位点以及家族成员在不同条件下的表达谱）预测家族功能。本文描述了一种用于基因家族表征的详细实验方案。此处，该方法应用于葡萄中Arabidopsis Tóxicos in Levadura（ATL）E3泛素连接酶家族的表征。该方法包括全基因组范围内鉴定家族成员，分析基因定位、结构与复制事件，保守蛋白基序分析，蛋白亚细胞定位与磷酸化位点预测，以及在不同数据集中对家族成员进行基因表达谱分析。此流程可根据实验目的进一步扩展，适用于任何具有基因组数据的植物物种中的任意基因家族，为功能研究筛选出有价值的候选基因，并为植物适应环境的分子机制提供见解。
引言
在过去十年中，葡萄基因组学的研究取得了大量进展。葡萄是一种具有重要经济价值的作物，已成为研究果实发育以及木本植物对生物和非生物胁迫响应的模式植物。在此背景下，2007年发布的Vitis vinifera cv. PN40024基因组序列1及其2011年的更新版本2，推动了"组学"规模数据的快速积累，并促进了高通量研究的蓬勃发展。基于已发表的序列数据，现在可以对特定基因家族（通常由具有保守基序、结构和/或功能相似性以及进化关系的蛋白质组成）进行系统分析，以揭示其分子功能、进化历程以及基因表达模式。这些分析有助于理解基因家族如何在全基因组水平上调控生理过程。
植物生命周期的许多方面受到泛素介导的关键蛋白降解的调控，这一过程需要精确调控蛋白质的周转，以确保正常的细胞活动。泛素介导的降解过程中的重要组分是E3泛素连接酶，它们通过招募特定底物赋予系统灵活性3。因此，E3连接酶构成一个庞大的基因家族，在Arabidopsis thaliana基因组中预测约有1,400个编码E3泛素连接酶的基因4，每个E3泛素连接酶负责特定靶蛋白的泛素化。尽管底物特异性的泛素化在植物细胞调控中具有重要意义，但关于泛素化通路如何被调控以及靶蛋白的识别，目前仅在少数情况....
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方案
1. 鉴定候选 ATL 基因家族成员
- PSI-BLAST 网络版
- 打开 BLAST 网页13 并点击蛋白质BLAST部分。
- 在 "输入查询序列" 在字段中输入将用作探针以鉴定其他家族成员的蛋白的氨基酸序列（此处为 VIT_05s0077g01970）。
注意：应使用具有良好代表性的蛋白（即呈现该家族所有重要特征的蛋白）。 - 在田间 "选择搜索集合"，选择 "参考蛋白" 数据库（refseq_protein）和目标生物（V. vinifera - taxid:29760)
- 在田间 "程序选择"，选择 PSI-BLAST 算法，然后点击 BLAST 按钮以运行分析。
注意：单击下方的 "算法参数" 可以调整一些高级参数（最大目标序列数、评分矩阵、PSI-BLAST 阈值， 等等。). - 第一轮 BLAST 检索出所有与查询序列具有显著匹配的序列（e 值高于选定阈值——默认为 0.005；本实验中为 0.001）。通过点击复选框，取消选择明显不属于待研究家族的所有条目 "选择 PSI-BLAST" 柱并点击BLAST按钮运行第二次PSI-BLAST迭代，操作同步骤1....
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结果
VIT_05s0077g01970 基因被鉴定为最相似的 A. thaliana ATL2 (At3g16720) 通过 BLASTp 搜索获得，用作探针以筛选葡萄基因组中的 ATL 家族成员V. vinifera cv Pinot Noir PN40024）。PSI-BLAST 分析经过数个循环后收敛，揭示出一组属于葡萄 ATL 基因家族的候选基因列表（图1A）。通过目视检查分析中鉴定出的所有条目的MUSCLE比对结果，评估每个候选序列是否存在典型的RING-H2结构域。图1B）。根据原始 ATL 定义，只有包含正确间距的保守氨基酸（即两个组氨酸残基以及第三个半胱氨酸之前的脯氨酸残基）的基因才被视为 ATLs。 拟南芥5共有96个葡萄基因满足要求，被选作进一步表征。对每个ATL家族成员进行分析，以确定其基因及相应编码蛋白的特异性特征。 即
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讨论
在基因组时代，许多基因家族已在多个植物物种中得到深入表征。这些信息为功能研究奠定了基础，并为进一步探究家族中不同成员的作用提供了框架。在此背景下，还需要建立一种命名系统，能够唯一地标识家族中的每个成员，避免因不同研究团队独立为不同基因赋予名称而可能产生的重复和混淆。
经过慎重考虑，葡萄科学界同意根据与拟南芥（Arabidopsis）基因的相似性，将葡萄基因归入相应基因家族，并制定了一系列规则，用于描述葡萄中新基因家族的命名，其基本流程始于葡萄与拟南芥家族成员之间的核苷酸序列系统发育比较8。因此，只有在拟南芥中已正确注释并命名的基因，方可用于葡萄基因家族的命名。本文所述鉴定拟南芥中葡萄ATL同源基因的方法，正是为了满足葡萄基因家族正确命名的要求而进行的。然而，对于其他植物物种，也可考虑采用替代性方法。例如，可通过双向BLAST比对（BBH）推断同源关系，即两个物种中彼此之间序列相似性最高（即比对得分最高）、且高于各自与其他任何基因相似性的基因对被定义为同源基因44<.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作由维罗纳大学在2014年联合项目（葡萄中ATL基因家族的表征及其在抵抗霜霉菌Plasmopara viticola中的作用）框架内资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 个人计算机 | |||
| 基本局部比对搜索工具（BLAST） | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi | ||
| 分子进化遗传学分析软件（MEGA） | http://www.megasoftware.net/ | ||
| 基于基序的序列分析工具（MEME） | http://meme-suite.org/ | ||
| Geneious | Biomatters Limited | http://www.geneious.com/ | |
| ProtParam 工具 | http://web.expasy.org/protparam/ | ||
| ngLOC | http://genome.unmc.edu/ngLOC/index.html | ||
| TargetP v1.1 服务器 | http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/ | ||
| Protein Prowler | http://bioinf.scmb.uq.edu.au:8080/pprowler_webapp_1-2/ | ||
| MUsite | http://musite.sourceforge.net/ | ||
| Pfam | http://pfam.xfam.org/ | ||
| TMHMM 服务器 v. 2.0 | http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ | ||
| ProtScale | http://web.expasy.org/protscale/ | ||
| 葡萄基因组数据库（CRIBI） | http://genomes.cribi.unipd.it/grape/ | ||
| PhenoGram | http://visualization.ritchielab.psu.edu/phenograms/plot | ||
| MCScanX | http://chibba.pgml.uga.edu/mcscan2/ | ||
| 交互式生命之树（iTOL） | http://itol.embl.de/ | ||
| UniProt | http://www.uniprot.org/ | ||
| Phylogeny.fr | http://www.phylogeny.fr/index.cgi | ||
| MUSCLE | http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/ | ||
| Gblocks 服务器 | http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks_server.html | ||
| Vitis vinifera cv. Corvina 基因表达图谱数据矩阵 | https://www.researchgate.net/publication/273383414_54sample_ datamatrix_geneIDs_Fasoli2012 | ||
| 多实验查看器（MeV） | http://mev.tm4.org/#/welcome | ||
| 序列读取归档库（SRA） | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra | ||
| R | https://www.r-project.org/ | ||
| EMBOSS Needle（EMBL-EBI） | http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/ |
参考文献
- Jaillon, O., et al. The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla. Nature. 449 (7161), 463-467 (2007).
- Adam-Blondon, A. -F., et al. Genetics, Genomics, and Breeding of Grapes. , Science Publishers. 211-234 (2011).<....
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重印与许可
