电生理学测量在研究电中性转运蛋白活性中的应用

摘要

本文描述了使用质子选择性电极和膜片钳技术来测量质子转运系统活性的方法。这些方法克服了常用于研究质子转运活性的技术中存在的一些局限性，例如灵敏度中等、时间分辨率不足以及对细胞内环境控制不充分。

摘要

离子通过细胞膜的转运确保了细胞内外离子含量的精细调控，这是细胞存活所不可或缺的。这些转运机制由特化的转运蛋白介导。具体而言，细胞质膜上的质子（H⁺）外排系统（如Na⁺/H⁺交换体（NHE）蛋白家族）对pH动态进行精确调控。尽管已有大量研究致力于探索NHE调控的机制，但由于缺乏有效测量NHE活性的方法，目前对NHE家族的生物物理和分子特性的理解仍不充分。在本研究中，我们结合全细胞膜片钳记录技术，使用H⁺选择性电极来测量NHE介导的H⁺流。我们提出该方法以克服传统测量NHE活性方法（如放射性摄取和荧光膜通透性探针）的一些局限性。采用所述方法测量NHE活性具有高灵敏度和高时间分辨率，并能更有效地控制细胞内H⁺浓度。H⁺选择性电极的原理在于，转运蛋白的活性会在细胞膜附近形成离子梯度。通过使H⁺选择性电极以重复振荡的方式靠近或远离细胞膜，可记录到依赖于H⁺流的电压差。H⁺选择性电极用于检测从细胞内向外的H⁺流，而全细胞构型的膜片钳技术则用于控制细胞内离子组成。此外，应用巨膜片钳技术不仅可改变细胞内离子组成，还可调控脂质组成。我们利用该技术手段测量了NHE3亚型（NHE3）的转运活性，以研究磷脂酰肌醇对NHE3调控作用的分子基础。

引言

离子和溶质跨质膜的运输对细胞的存活至关重要，因此也对生物体的存活至关重要¹。离子和溶质的选择性运输由一系列特化的通道蛋白和转运蛋白实现。这些蛋白的突变常导致多种临床疾病，使得通道蛋白和转运蛋白成为潜在的药物治疗靶点¹。然而，由于研究其活性可用的方法有限，对通道蛋白和转运蛋白功能及其调控机制的理解常常受到限制^2,3,4。

具体而言，转运蛋白可根据其在溶质转运过程中是否改变细胞膜电位，大致分为两大类：改变膜电位的生电性离子转运蛋白[例如， 钠-磷酸盐共转运蛋白2a（NaPi2a），钠-钙交换体（NCX）， 等等.] 或不改变电荷的电中性离子转运蛋白 [例如， 钠-质子交换体（NHE），钠-氯共转运体，NaPi2c 等等]. 已通过放射性同位素摄取和荧光膜通透性染料的方法对这两类转运蛋白的活性进行了广泛研究²两种方法均通过测量特定胞质离子总体浓度的变化来估算转运蛋白的活性，但都存在一定的局限性，例如灵敏度和时间分辨率中等，以及对细胞内环境的控制不足。事实上，许多转运蛋白的活性依赖于其所....

方案

注意：使用自参考离子选择性电极（ISE）结合膜片钳技术记录电中性转运体活性时，需要两个放大器——一个膜片钳放大器用于维持细胞的全细胞构型，以及一个高阻抗放大器（电位计）用于通过ISE记录转运体活性（见材料表）。膜片钳放大器直接连接至数据采集板端口。电位计则连接至差分放大器，用于对信号进行滤波和放大。差分放大器再连接至数据采集板端口。在先前的研究中已使用Capmeter（一种监测细胞电容的膜片钳软件）²⁰（见材料表）。记录室和灌流溶液均维持在37 °C。

1. 离子选择性电极用移液管的制备

1. 使用拉针仪从硼硅酸盐玻璃毛细管（见材料表）中拉制移液管，使其外径达到 1.2 mm²。
2. 使用微加工仪对移液管尖端进行抛光，使其尖端直径为 2–3 µm。
3. 将移液管放入移液管架中，尖端朝上放置（见材料表）。
   注意：步骤 1.4–1.6 应在通风良好的化学通风橱中进行。
4. 配制硅烷化混合液，包含 1 滴（约 150 µL）双(二甲氨基)二甲基硅烷和 10 滴四氯化碳（见材料表）。
5. 将硅烷化混合液倒入容器中，并紧密盖上盖子。
6. 在室温下，将装有硅烷化混合液的容器置于化学通风橱....

结果

在全细胞膜片钳记录过程中应用自参照离子选择性电极（ISE）研究磷脂酰肌醇对NHE3活性的调控。实验采用PS120成纤维细胞样细胞²⁴，该细胞不表达内源性质膜NHE。稳定表达NHE3野生型（NHE3-wt）或不能结合磷脂酰肌醇的NHE3突变体[酪氨酸501、精氨酸503和赖氨酸505均被丙氨酸取代，Y501A/R503A/K505A（NHE3-YRK）]的PS120成纤维细胞样细胞被用于实验¹⁸。

结果如图2所示。采用膜片钳全细胞构型的移液管固定细胞，同时将离子选择性电极（ISE）置于细胞前方。在此位置，ISE记录靠近细胞膜表面的游离H⁺浓度（图1A）；随后，手动将ISE（或膜片钳移液管）横向移动50 µm，记录溶液中游.......

讨论

尽管转运蛋白具有至关重要的功能，但目前可用于研究其活性的方法却低效且不足。其中一个局限在于，现有方法在测量由转运蛋白活性介导的离子移动时，未考虑实验过程中细胞内离子组成的波动⁴。本文所述方法可精确控制细胞外和细胞内的离子组成，并为调控细胞内离子、蛋白质及脂质组成提供了一种强有力的工具^3,4,5。

本方案中最重要的步骤是制备一支在较长时间内保持稳定的离子选择性电极（ISE）²⁵。根据我们的经验，不稳定的ISE通常硅烷化不充分（e.g., 离子选择性树脂在ISE移液管壁上发生再分布），这会表现为ISE信号持续且无法控制的漂移。此外，在实验过程中应密切监测ISE内树脂的分布情况。灌流液可能将离子选择性树脂推入ISE移液管内部，导致树脂前方形成一段灌流液柱^2.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
膜片钳放大器	Molecular Devices
双通道差分静电计（HiZ-223）	Warner Instruments	64-1650
差分放大器（DP-301）	Warner Instruments	64-0044
基于MatLab的膜片钳软件	带有采集工具箱的MatLab		建议使用 capmeter 软件
ThermoClamp-1 温度控制系统	AutoMate Scientific	03-11-LL	在线加热器
单通道温度控制器（TC-324C）	Warner Instruments	64-2400
单通道标准硼硅酸盐玻璃管	世界精密仪器公司	1B120F-3	用于离子选择性电极
微量移液器储存罐	World Precision Instruments	E212
双(二甲氨基)二甲基硅烷	Sigma-Aldrich	14755-100ML
四氯化碳	Sigma-Aldrich	319961-500ML
氢离子载体 I - 混合液 B	Sigma-Aldrich	95293
薄壁硼硅酸盐玻璃管	Sutter Instrument	B200-156-15	用于膜片钳电极
软质玻璃（Corning 8161 Patch Glass）	华纳仪器	64-0815
二氧化硅毛细管（150 μm外径/75 μm内径）	Molex（Polymicro Technologies）	106815-0018	用于细胞内灌流系统
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9333
天冬氨酸钾	Sigma-Aldrich	A6558
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
氯化镁	Sigma-Aldrich	M4880
Mg-ATP	Sigma-Aldrich	A9187
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
MES	Sigma-Aldrich	M3671
氯化钙	Sigma-Aldrich	C5670
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
盐酸	Sigma-Aldrich	H1758
腺苷三磷酸双磷酸酶	Sigma-Aldrich	A6535
二油酰磷脂酰肌醇(4,5)二磷酸（diC8）	Echelon Biosciences	P-4508
磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸 diC8	Echelon Biosciences	P-3908