电生理学测量在研究电中性转运蛋白活性中的应用

摘要

本文描述了使用质子选择性电极和膜片钳技术来测量质子转运系统活性的方法。这些方法克服了常用于研究质子转运活性的技术中存在的一些局限性，例如灵敏度中等、时间分辨率不足以及对细胞内环境控制不充分。

摘要

离子通过细胞膜的转运确保了细胞内外离子含量的精细调控，这是细胞存活所不可或缺的。这些转运机制由特化的转运蛋白介导。具体而言，细胞质膜上的质子（H⁺）外排系统（如Na⁺/H⁺交换体（NHE）蛋白家族）对pH动态进行精确调控。尽管已有大量研究致力于探索NHE调控的机制，但由于缺乏有效测量NHE活性的方法，目前对NHE家族的生物物理和分子特性的理解仍不充分。在本研究中，我们结合全细胞膜片钳记录技术，使用H⁺选择性电极来测量NHE介导的H⁺流。我们提出该方法以克服传统测量NHE活性方法（如放射性摄取和荧光膜通透性探针）的一些局限性。采用所述方法测量NHE活性具有高灵敏度和高时间分辨率，并能更有效地控制细胞内H⁺浓度。H⁺选择性电极的原理在于，转运蛋白的活性会在细胞膜附近形成离子梯度。通过使H⁺选择性电极以重复振荡的方式靠近或远离细胞膜，可记录到依赖于H⁺流的电压差。H⁺选择性电极用于检测从细胞内向外的H⁺流，而全细胞构型的膜片钳技术则用于控制细胞内离子组成。此外，应用巨膜片钳技术不仅可改变细胞内离子组成，还可调控脂质组成。我们利用该技术手段测量了NHE3亚型（NHE3）的转运活性，以研究磷脂酰肌醇对NHE3调控作用的分子基础。

引言

离子和溶质跨质膜的运输对细胞的存活至关重要，因此也对生物体的存活至关重要¹。离子和溶质的选择性运输由一系列特化的通道蛋白和转运蛋白实现。这些蛋白的突变常导致多种临床疾病，使得通道蛋白和转运蛋白成为潜在的药物治疗靶点¹。然而，由于研究其活性可用的方法有限，对通道蛋白和转运蛋白功能及其调控机制的理解常常受到限制^2,3,4。

具体而言，转运蛋白可根据其在溶质转运过程中是否改变细胞膜电位，大致分为两大类：改变膜电位的生电性离子转运蛋白[例如， 钠-磷酸盐共转运蛋白2a（NaPi2a），钠-钙交换体（NCX）， 等等.] 或不改变电荷的电中性离子转运蛋白 [例如， 钠-质子交换体（NHE），钠-氯共转运体，NaPi2c 等等]. 已通过放射性同位素摄取和荧光膜通透性染料的方法对这两类转运蛋白的活性进行了广泛研究²两种方法均通过测量特定胞质离子总体浓度的变化来估算转运蛋白的活性，但都存在一定的局限性，例如灵敏度和时间分辨率中等，以及对细胞内环境的控制不足。事实上，许多转运蛋白的活性依赖于其所转运离子的胞质浓度例如， NHE3、NCX）的活性，这些离子浓度的变化预计在调控转运蛋白活性中发挥重要作用^2,3,5传统方法在精确测量这些调控机制方面存在局限性。

为了克服这些局限性，通常采用膜片钳技术来研究转运蛋白的活性^2,6。特别是，近年来将自参照离子选择性电极（ISEs）^7,8 与膜片钳系统相结合，已能够测量电中性转运蛋白的活性^3,4,5。ISEs 的原理在于，转运蛋白的活性会在细胞膜附近形成离子梯度。通过使 ISE 以重复振荡的方式靠近和远离细胞膜，可记录到电压差（µV）。利用基于菲克扩散第一定律的校准方法，可将电压差转换为离子流值^2,9。ISEs 用于检测离子从细胞内向外流动的情况，而膜片钳技术则可在全细胞或内面向外构型下用于控制膜电位和细胞内离子组成。此外，应用巨膜片钳技术还可改变细胞内不仅离子，还包括脂质和蛋白质的组成^3,5。

总之，与研究转运体活性的其他方法相比，膜片钳技术的多功能性使其能够克服这些方法常见的局限性。自参照离子选择性电极（ISE）与膜片钳技术的结合，提供了在严格控制的实验环境中测量电中性转运体活性的独特可能性，并有助于发现细胞膜转运过程中的新生物物理与分子特性^3,4,5。该方法已成功用于研究钠氢交换体（NHE）的活性。哺乳动物NHE蛋白家族催化细胞外钠离子（Na⁺）与细胞内质子（H⁺）之间的电中性净交换^10,11，并利用向内的Na⁺浓度梯度驱动该过程。在哺乳动物中，NHE蛋白家族包括11种相关蛋白（NHE1-9和NHA1-2），以及一种精子特异性NHE^10,12,13。

NHE（SLC9a家族）广泛存在于从简单原核生物到高等真核生物的大多数生物体中，参与多种重要的细胞功能^10,11，包括调控原核生物的细胞盐度防御、维持酸碱平衡和细胞体积，以及调节多种特化上皮组织对盐和水的吸收^10,12,14,15。尽管已有多个研究明确了NHE的关键生物学作用及其功能的重要性，但由于方法学上的限制，针对哺乳动物NHE的生物物理和分子特性的研究仍较少⁴。近年来，在全细胞膜片钳实验中应用自参照离子选择性电极（ISEs），揭示了由细胞内离子、蛋白质和磷脂浓度变化所调控的NHE亚型的新分子机制^3,4。

本文提供的实验方案详细阐述了研究NHE3亚型（NHE3）活性及其调控机制的方法，NHE3在肾和肠上皮细胞刷状缘膜对Na⁺、Cl^-、HCO₃^-及液体的吸收过程中发挥关键作用^14,16。本研究报道了关于NHE3活性对细胞内磷脂酰肌醇类分子（包括磷脂酰肌醇4,5-二磷酸[PI(4,5)P2]和磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸[PI(3,4,5)P3]）敏感性差异的新发现。细胞转运蛋白（如离子通道和转运体）受磷脂酰肌醇类分子的调控¹⁷，而NHE3可直接结合PI(4,5)P2和PI(3,4,5)P3¹⁸。根据现有文献，这两种磷脂酰肌醇分子均可能参与NHE3生理或病理生理条件下的调控过程^5,18,19。我们的研究结果支持PI(4,5)P2与PI(3,4,5)P3在调控NHE3活性中具有不同的功能。这一区分得以实现，得益于离子选择性电极（ISE）技术与全细胞膜片钳记录技术的联合应用。该方法还可在测定NHE3活性的同时，通过细胞内灌注不同类型的磷脂酰肌醇，实现对细胞内磷脂酰肌醇含量的精确控制。

方案

注意：使用自参考离子选择性电极（ISE）结合膜片钳技术记录电中性转运体活性时，需要两个放大器——一个膜片钳放大器用于维持细胞的全细胞构型，以及一个高阻抗放大器（电位计）用于通过ISE记录转运体活性（见材料表）。膜片钳放大器直接连接至数据采集板端口。电位计则连接至差分放大器，用于对信号进行滤波和放大。差分放大器再连接至数据采集板端口。在先前的研究中已使用Capmeter（一种监测细胞电容的膜片钳软件）²⁰（见材料表）。记录室和灌流溶液均维持在37 °C。

1. 离子选择性电极用移液管的制备

1. 使用拉针仪从硼硅酸盐玻璃毛细管（见材料表）中拉制移液管，使其外径达到 1.2 mm²。
2. 使用微加工仪对移液管尖端进行抛光，使其尖端直径为 2–3 µm。
3. 将移液管放入移液管架中，尖端朝上放置（见材料表）。
   注意：步骤 1.4–1.6 应在通风良好的化学通风橱中进行。
4. 配制硅烷化混合液，包含 1 滴（约 150 µL）双(二甲氨基)二甲基硅烷和 10 滴四氯化碳（见材料表）。
5. 将硅烷化混合液倒入容器中，并紧密盖上盖子。
6. 在室温下，将装有硅烷化混合液的容器置于化学通风橱中孵育 24–48 小时，直至混合液完全蒸发。
7. 用适当的离子选择性树脂反向填充移液管，形成约 2–4 mm 的树脂柱。
   注：氢离子载体 I 混合液 B 可用于记录 NHE 活性（见材料表）。
8. 轻敲移液管尖端，使离子选择性树脂分布至尖端，然后将移液管垂直放入移液管架中，尖端朝下。
9. 在解剖显微镜下检查，确认树脂混合液已到达尖端末端。如有需要，施加正压将树脂推至末端。
10. 用适当的溶液（约 100 μL）反向填充半支移液管。若使用离子载体 I 混合液 B，则此处使用 pH 7.0 的 100 mM KCl 和 10 mM HEPES 溶液。
11. 将离子选择性电极（ISE）连接至静电计，并将电极尖端插入用于记录的浴液中，对静电计进行调零。
12. 通过改变浴液的 pH 值测试 H⁺-选择性 ISE 的响应。H⁺-选择性 ISE 的平均响应约为每 pH 单位 58 mV。
13. 定期评估 ISE 对校准的响应情况。

2. 记录用膜片钳电极的制备

注意：建议采用 Donald Hilgemann 在其关于单通道记录的文章中所描述的方法²¹。

1. 使用拉针仪从硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 2.0 mm / 内径 1.5 mm）上拉制巨斑片记录用玻璃微电极^2,22,23。
2. 将显微成型仪安装在倒置显微镜的载物台上，用于制作宽口径微电极尖端（10 - 22 μm）²³。在显微成型仪的粗铂丝上熔融一个软玻璃珠（约 0.5 mL）。
   注意：制作巨斑片微电极需要相对较粗的铂丝（约 0.5 mm）。
3. 将记录微电极靠近软玻璃珠，并施加全功率加热，直至尖端开始回缩。加热过程中，铂丝会略微向中心移动。
4. 关闭加热，将微电极尖端推入软化的玻璃珠中。冷却时铂丝回缩，从而使微电极尖端断裂。
5. 重新加热以修整微电极尖端，形成所需直径的尖端。尖端直径取决于待记录细胞的大小（本研究中为 8 - 10 μm）。

3. 细胞的制备

1. 将不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的磷酸盐缓冲液（PBS）、胰蛋白酶-EDTA 溶液和培养基预热至 37 °C。
2. 用 PBS 清洗细胞两次。每 35 mm 直径的细胞培养皿使用 1 mL 缓冲液。
3. 向 35 mm 直径的细胞培养皿中的细胞加入 0.5 mL 胰蛋白酶。
   注意：当细胞开始变圆时，轻轻摇动培养皿以使细胞脱落。
4. 加入 5 mL（适用于 35 mm 直径细胞培养皿）含 10% 胎牛血清的完全培养基，以终止胰蛋白酶作用。
   注意：胰蛋白酶消化时间因细胞类型而异。
5. 将细胞置于摇床上轻轻摇动，以防止细胞聚集成团。
6. 胰蛋白酶消化后，细胞应在 2 小时内使用。
   注意：具体时间可能因细胞系不同而有所变化。

4. 细胞内灌流系统的制备

1. 裁剪适当长度的石英管（外径 150 µm / 内径 75 µm），用于制备管内灌流管线。
2. 将石英管的一端插入 200 µL 移液器吸头中。用胶水将石英管固定在吸头上，并用锋利的剃刀片切割吸头末端。
3. 将灌流管线（即固定在吸头上的石英管）连接至一段小型硅胶管，该硅胶管将作为管内灌流液的储液端。
4. 将硅胶管连接至注射器，以产生正压。
5. 将石英管的自由端穿过灌流口移液器夹持器的聚乙烯管（见材料表）。
6. 使用移液器溶液评估灌流管线的通畅性。

5. 溶液的配制

1. 准备一种缓冲能力较强的记录钠氢交换体（NHE）的移液管溶液（115 mM 天冬氨酸钾（KAsp）、1 mM EGTA、0.5 mM MgCl₂、10 mM Mg-ATP、12.5 mM HEPES、12.5 mM PIPES、12.5 mM MOPS 和 12.5 mM MES，用天冬氨酸调节 pH 至 6.0）。
   注意：配制移液管溶液母液并进行过滤，记录前加入 Mg-ATP。
2. 每次实验均需配制新鲜的灌流液（140 mM NaCl、2 mM CaCl₂、2 mM MgCl₂ 和 0.1 mM Tris-HCl，pH 8.2）。

6. 转运体活性的记录

1. 将记录室和所有溶液保持在 37 °C，因为转运体活性具有温度依赖性。
2. 将细胞放入记录室中。等待细胞沉降至室底，但不要让其附着在室壁上。
3. 选择一个合适的细胞，使用目镜测微尺测量细胞直径，并选择直径相近的细胞。
   注意：通常情况下，较大的细胞具有更大的细胞表面积，可能在其质膜上表达更多的转运体，因而可能表现出更高的转运体活性。然而，这并不绝对成立，因为转运体活性取决于所研究的具体转运体类型和细胞类型。
4. 将离子选择性微电极移液管安装到显微操作器上，用细胞内液反向填充膜片钳移液管，并确保溶液到达移液管尖端²。
   注意：可能需要轻柔敲击数次，以消除移液管尖端的气泡。
5. 将膜片钳移液管安装至电生理实验装置的前置放大器头stage^2,22,23。
   注意：应将头stage保持在与水平轴约 45 度的角度，以确保移液管进入角度适合形成高阻封接。
6. 对膜片钳移液管施加轻微正压（约 5 cm H₂O），以减少堵塞尖端的可能性，并将其置入浴液中。
7. 当移液管尖端接近细胞时，停止移动膜片钳移液管。
8. 当移液管接触细胞时释放正压，并施加轻微负压（约 5 cm H₂O），以在移液管与细胞膜之间形成>1000 MΩ（吉欧姆）的封接²³。
9. 将带有细胞的膜片钳移液管与离子选择性电极（ISE）置于同一焦平面，并缓慢左右或上下移动移液管，使细胞靠近 ISE（约 5 - 10 µm）^2,5，但避免细胞与 ISE 接触（图 1A）。
10. 确保保持电位为 0 mV。
11. 通过一系列短暂的抽吸破坏封接，以获得全细胞构型。
12. 缓慢左右或上下移动 ISE（或膜片钳移液管），以记录转运体的活性（图 1B）。
13. 记录至少 5–8 个峰（图 1C，从 A 到 B）。
14. 在记录过程中施加方波扰动，以监测封接质量和细胞膜电容（图 1）。
15. 根据细胞表面与体相溶液之间游离 H⁺ 浓度的差异（ΔH⁺）估算 H⁺ 流量（）
    
    
    注意： 和 分别为 H⁺ 和缓冲剂的扩散系数，B_T 为总缓冲剂浓度，K_D 为缓冲剂的解离常数，r 为细胞半径， 表示游离 H⁺ 发生微小变化时，结合态 H⁺ 浓度的稳态变化。H⁺ 表示溶液中的游离质子。为与先前研究保持一致，通过计算流量的电流当量（/法拉第常数）将 H⁺ 流量转换为电生理流量单位（pA）^3,5。
16. 将质子流量归一化至可通过细胞大小或膜电容计算得到的细胞表面积。

结果

在全细胞膜片钳记录过程中应用自参照离子选择性电极（ISE）研究磷脂酰肌醇对NHE3活性的调控。实验采用PS120成纤维细胞样细胞²⁴，该细胞不表达内源性质膜NHE。稳定表达NHE3野生型（NHE3-wt）或不能结合磷脂酰肌醇的NHE3突变体[酪氨酸501、精氨酸503和赖氨酸505均被丙氨酸取代，Y501A/R503A/K505A（NHE3-YRK）]的PS120成纤维细胞样细胞被用于实验¹⁸。

结果如图2所示。采用膜片钳全细胞构型的移液管固定细胞，同时将离子选择性电极（ISE）置于细胞前方。在此位置，ISE记录靠近细胞膜表面的游离H⁺浓度（图1A）；随后，手动将ISE（或膜片钳移液管）横向移动50 µm，记录溶液中游...

讨论

尽管转运蛋白具有至关重要的功能，但目前可用于研究其活性的方法却低效且不足。其中一个局限在于，现有方法在测量由转运蛋白活性介导的离子移动时，未考虑实验过程中细胞内离子组成的波动⁴。本文所述方法可精确控制细胞外和细胞内的离子组成，并为调控细胞内离子、蛋白质及脂质组成提供了一种强有力的工具^3,4,5。

本方案中最重要的步骤是制备一支在较长时间内保持稳定的离子选择性电极（ISE）²⁵。根据我们的经验，不稳定的ISE通常硅烷化不充分（e.g., 离子选择性树脂在ISE移液管壁上发生再分布），这会表现为ISE信号持续且无法控制的漂移。此外，在实验过程中应密切监测ISE内树脂的分布情况。灌流液可能将离子选择性树脂推入ISE移液管内部，导致树脂前方形成一段灌流液柱^2...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
膜片钳放大器	Molecular Devices
双通道差分静电计（HiZ-223）	Warner Instruments	64-1650
差分放大器（DP-301）	Warner Instruments	64-0044
基于MatLab的膜片钳软件	带有采集工具箱的MatLab		建议使用 capmeter 软件
ThermoClamp-1 温度控制系统	AutoMate Scientific	03-11-LL	在线加热器
单通道温度控制器（TC-324C）	Warner Instruments	64-2400
单通道标准硼硅酸盐玻璃管	世界精密仪器公司	1B120F-3	用于离子选择性电极
微量移液器储存罐	World Precision Instruments	E212
双(二甲氨基)二甲基硅烷	Sigma-Aldrich	14755-100ML
四氯化碳	Sigma-Aldrich	319961-500ML
氢离子载体 I - 混合液 B	Sigma-Aldrich	95293
薄壁硼硅酸盐玻璃管	Sutter Instrument	B200-156-15	用于膜片钳电极
软质玻璃（Corning 8161 Patch Glass）	华纳仪器	64-0815
二氧化硅毛细管（150 μm外径/75 μm内径）	Molex（Polymicro Technologies）	106815-0018	用于细胞内灌流系统
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9333
天冬氨酸钾	Sigma-Aldrich	A6558
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
氯化镁	Sigma-Aldrich	M4880
Mg-ATP	Sigma-Aldrich	A9187
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
MES	Sigma-Aldrich	M3671
氯化钙	Sigma-Aldrich	C5670
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
盐酸	Sigma-Aldrich	H1758
腺苷三磷酸双磷酸酶	Sigma-Aldrich	A6535
二油酰磷脂酰肌醇(4,5)二磷酸（diC8）	Echelon Biosciences	P-4508
磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸 diC8	Echelon Biosciences	P-3908