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休眠 Daphnia magna 的复苏：方案与应用

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DOI：

10.3791/56637

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2018年1月19日

 , 
1Environmental Genomics Group, School of Biosciences, University of Birmingham

本文内容

摘要

长期研究对于理解进化过程和适应机制至关重要。通常，这些研究需要超越研究人员生命周期的持续投入。本文描述了一种强大的方法，可显著提升现有技术的数据采集能力，从而在自然系统中生成纵向数据。

摘要

长期研究能够揭示在较长时间尺度上发生的生态进化过程。此外，这些研究还能提供关键的实证数据，可用于预测建模，以预估自然生态系统对未来环境变化的进化响应。然而，除少数例外情况外，由于在获取时间序列样本方面存在后勤困难，长期研究仍然十分稀缺。时间动态通常在实验室或受控的中型生态系统实验中进行研究，而能够重建野生自然种群进化历程的研究则极为罕见。

本文提供了一种标准操作流程（SOP），用于复苏或复活休眠的Daphnia magna——一种在水生生态系统中广泛分布的浮游动物关键物种，以显著推动自然系统中纵向数据采集的前沿发展。尽管孵化滞育浮游动物卵的最早尝试可追溯至20世纪80年代末，但“复活生态学”这一领域直到1999年才由Kerfoot及其同事正式定义。自Kerfoot的开创性论文发表以来，复活浮游动物物种的方法被越来越频繁地应用，但其传播仅通过实验室之间的直接知识传递实现。本文描述了一种SOP，提供了复活休眠Daphnia magna卵的逐步操作方案。

提供了两项关键研究，通过利用在相同条件下研究历史种群和现代种群的能力，测量了复活的Daphnia magna种群对升温的适应性反应。最后，讨论了将下一代测序技术应用于复苏或仍处于休眠阶段的个体。若将这些技术应用于随时间经历选择压力变化的种群，将前所未有地增强我们解析进化过程与机制的能力。

引言

长期研究对于理解自然界的生态与进化过程，以及评估物种如何响应环境变化并在此类变化中持续生存至关重要1。这是因为生态-进化过程跨越多个世代，而环境变化也发生在较长的时间尺度上。此外，长期研究提供了关键的实证数据，有助于提高预测模型的准确性，从而预测自然生态系统对环境变化的进化响应2。这些模型的准确性对于制定管理和保护策略、维护生物多样性及生态系统服务至关重要。

除了少数例外情况（例如，加拉帕戈斯达尔文雀3和藻类4），长期研究主要局限于那些可在实验室中繁殖且世代时间较短的物种5,6,7,8。因此，驱动进化动态的过程仍不明确。由于获取时间序列样本存在实际困难，实证数据更多地被置于空间而非时间背景下进行研究，而时间尺度上的生态进化过程则往往通过空间数据推断或建模得出。这种方法被称为“以空间代时间”替代法9，即利用空间作为替代手段来研究时间上的进化动态。该方法的主要局限在于，不同空间尺度下的适应速率与同一群体随时间发生的变化存在差异；因此，以空间代替时间所做出的推论存在偏差10。

一种强大的替代方法是分析产生休眠阶段的物种在生态和遗传上的变化，从而研究自然生态系统中随时间推移的进化动态11。这些休眠阶段会逐渐积累，形成可精确定年并进行古湖沼学表征的分层生物档案12,13。重要的是，这些休眠阶段可以被复苏并用于实验室实验，从而直接测量其对环境变化的进化响应。通过将历史种群与其现代进化后代进行竞争实验，可研究适合度的变化以及与环境变化同步进化的基因功能14,15,16。

休眠阶段包括种子、包囊、孢子以及休眠卵库。尽管关于复苏休眠卵的最早研究可追溯至20世纪80年代末17，且少数研究在20世纪90年代初已应用该技术18,19，但“复活生态学”这一领域直到1999年Kerfoot及其同事发表的开创性论文才被正式确立20。该方法主要应用于淡水物种的古湖沼学重建研究17,21,22。然而，目前尚无标准化操作流程（SOP）。本文提供了针对枝角类物种Daphnia magna休眠卵的复活实验方案的逐步描述，内容涵盖从沉积物采样到从孵化幼体建立克隆培养系的全过程。文中还讨论了该SOP中可直接适用于其他Daphnia物种的操作步骤，以及可能需要进一步优化的步骤。

Daphnia 是广泛存在于大多数流水生境中的淡水浮游动物23。Daphnia 物种为专性无性生殖或周期性孤雌生殖。D. magna 属于周期性孤雌生殖物种，在环境条件适宜时通过克隆方式进行繁殖24。当环境条件恶化时，会产生雄性个体，并通过有性重组形成受精卵，这些受精卵被一种称为卵鞍（ephippium）的几丁质结构包裹，进入休眠状态以抵御不良环境。当环境条件再次变得适宜时，部分休眠卵会孵化。然而，大部分休眠卵库中的卵从未有机会孵化，因而随时间推移形成了生物档案库。这些休眠阶段的个体长期埋藏于湖泊和池塘的沉积物中，可用于研究长时间尺度上的进化动态。由于D. magna 的休眠卵是有性重组的产物，因此能够很好地代表该物种的自然遗传多样性25。此外，这些个体可在实验室中通过克隆繁殖方式进行维持。这些特性使其兼具同基因型模式生物的独特优势，同时保留了自然的遗传多样性。

本研究展示了两项关键实验，用以说明直接比较同一 D. magna 种群在长期环境选择压力下历史世代与现代后裔的优势。D. magna 样本来自丹麦的林格湖（Lake Ring），该湖为浅水混合型池塘（水深5米，表面积22公顷），其平均温度和热浪发生频率随时间持续上升。研究人员沿60年（1960–2005年）的时间梯度复苏了该湖中 D. magna 的（亚）种群，以探究其对温度升高的进化响应。在第一项共同花园实验中，研究人员测量了与适合度相关的生活史性状在温度升高+6 °C条件下的变化，该升温幅度与政府间气候变化专门委员会（IPCC）对未来100年的预测一致26。在第二项研究中，通过中宇宙实验评估了三个（亚）种群在升温条件下的竞争能力。综合这两项实验结果表明，在仅存在升温这一胁迫因素的情况下，所有生活史性状和种群均表现出高度的表型可塑性，且竞争能力相当。这些发现提示，至少在本研究所涉及的种群中，升温作为单一胁迫因素并未造成显著的适合度代价。

方案

以下标准操作流程逐步描述了复苏Daphnia magna休眠卵的实验方案，包括采样、从沉积物中分离孤雌生殖壳（ephippia）以及建立克隆培养物的详细步骤（图1）。

沉积物岩心采样；示意图；年代分析；地层分层；生态学研究；工作流程。
图1：Daphnia magna 复活实验的逐步操作指南。 从天然淡水生境中（A）使用活塞式采样器采集沉积物（B）。将沉积物岩心（C）按1 cm或0.5 cm的厚度逐层切割（D）。每层沉积物均置于自封袋中（E），并在避光低温（4 °C）条件下保存。将每层沉积物称重后，使用地质筛（筛网孔径分别为1 mm和125 µm，F）进行筛分。使用白色背景托盘分离Daphnia magna的休眠卵囊（G）。将去壳的休眠卵（H）转移至培养皿中，并施加光照和温度刺激以诱导孵化。将孵化出的幼体转移至独立的容器中（I），以建立同克隆品系。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 沉积物岩心取样

  1. 使用活塞取芯器从湖泊或池塘中采集沉积物样品。本方案采用 Big Ben27，其为长约 1.5 m、内管直径约 14 cm 的取芯管。Big Ben 由绳索连接的活塞和取芯头组成，取芯头上可连接杆件，用于将取芯管压入沉积物中。当取芯管充满沉积物时，芯捕集器有助于支撑取芯管。为推出沉积物，需使用支架使取芯管保持直立和固定，同时使用改装的液压千斤顶在推出过程中将活塞向上推动（补充视频 1）。
    1. 对于深度小于 1 m 的浅水池塘，可使用直径不超过 6 cm 的有机玻璃重力取芯器，手动将其压入沉积物中。
    2. 对于深水湖泊（深度 >6 m），可在锚定的浮筒船辅助下使用 Livingston 活塞取芯器28 或单冲程 Griffith 沉积物取芯器。Livingstone 型驱动杆活塞取芯器可用于水深约 30 m 以内的水域，连续采集长度为一米的软质至固结湖泊沉积物样品。单冲程 Griffith 取芯器由一个简单而坚固的取芯头组成，可将标准聚碳酸酯管连接至 Livingstone 驱动杆。取芯器通过驱动杆压入沉积物中，活塞提供抽取沉积物所需的吸力（图 2）。
    3. 为获取连续且未受扰动的岩芯，可采用振动取芯法。此类取芯器适用于多种水深条件，可采集不同长度的岩芯样品，具体取决于沉积物岩性。振动取芯头产生的低振幅振动通过连接的套管或取芯管向下传递，使沉积物液化，从而使连接在振动取芯装置上的取芯管得以穿透液化沉积物。部分振动取芯器体积小、重量轻且便于携带，而另一些则为大型重型设备，只能从大型船只上部署。取芯器的选择取决于沉积物的岩性。
  2. 使用平坦的金属表面将岩芯按水平方向逐层切割，每层厚度为 1 cm 或更薄（补充视频 1）。本实验所用的沉积物取芯器设计可减少推出过程中的静水压力，从而降低对沉积层的扰动。当使用其他类型取芯器时，可用类似饼干切割器的刀片去除每层沉积物的外层表皮，以减少层间污染。
  3. 将每一层沉积物分别收集至独立的采样袋中（补充视频 1），并在避光、低温（4 °C）条件下保存。
  4. 从每一层中至少采集 5 g 沉积物用于放射性测年。由于放射性测年是一项成熟的技术，有关测年分析的详细描述请参考已有文献12,13。

沉积物岩心提取示意图，活塞机制，真空法，环境采样。
图 2：活塞取芯过程示意图。 活塞取芯器是一种中空管，内部带有可滑动的密封装置（活塞），可产生微弱的真空。当活塞接触沉积物-水界面时，其重量将取芯管压入沉积物中，同时真空作用使被采集的沉积物进入管内并沿管上升，且不扰动沉积物层序。请点击此处查看此图的放大版本。

2. 沉积层筛分

  1. 使用精密天平称量每层沉积物，以供后续参考。利用表面积和重量计算湖泊中物种的密度。
  2. 使用两个叠放的地质筛网对每层沉积物进行筛分。第一个筛网的孔径为1 mm，用于分离黏土、大型无脊椎动物和颗粒物 例如 种子、植物和昆虫与其余沉积物分离。第二个筛网的孔径为 125 µm 并分离 D. manga 休眠卵和细小颗粒物与其余沉积物的分离（补充视频 2).
  3. 将收集的小份沉淀组分转移至 125 µm 将筛网置于白色背景托盘上。根据沉积物类型，每次可转移较小或较大的沉积物样品量。
    1. 向采样白盘中加入少量培养基（最多200 mL），重新悬浮已转移的沉积物组分，以便肉眼观察溞的休眠卵（ephippia）图3）。用于重悬沉淀物的培养基可以是脱氯自来水、钻孔水或 COMBO29，或ADaM培养基（Aachener Daphnien）30此后，“培养基”一词将用于指代上述任一或全部溶液。

种子解剖结构示意图；显示放大后的种子横切面A、B、C，比例尺为500 μm。
图3： 大型溞 休眠卵鞍 休眠的 大型溞 脱胶后立即取出的卵。休眠壳（ephippium）（A），内层卵膜（B），以及休眠卵（C显示了）. 比例尺 = 500 µm.

3. 休眠卵的去壳与孵化

  1. 使用一次性巴斯德吸管或解剖镊子，将单个休眠卵（ephippia）转移至盛有10 mL培养基的培养皿中。每层沉积物至少使用一个培养皿。
  2. 在体视显微镜下，用解剖镊子将每个休眠卵的几丁质外壳强行打开以进行脱壳处理（补充视频3）。小心去除休眠卵的内膜，注意不要损伤卵本身，并用巴斯德吸管将其转移至盛有培养基的培养皿中。脱壳可提高大型溞（D. magna）的孵化成功率；但对于产生较小休眠卵的其他溞属（Daphnia）物种，脱壳可能并非必需，或操作上较为困难。
  3. 将脱壳后的卵置于全光谱长日照光周期（16:8 光:暗）和高温（20 ± 1 °C）条件下，在恒温设备（如培养箱）或控温房间中诱导孵化。孵化时间介于48小时至数周之间（最长可达四周；补充视频4）。若未进行脱壳处理，则直接将休眠卵暴露于孵化刺激条件（长日照光周期（16:8 光:暗）和高温（20 ± 1 °C））下。

4. 建立大型溞（Daphnia magna）的同克隆系

  1. 使用一次性巴斯德吸管，将步骤3.3中得到的单个刚孵化的D. magna转移至装有200 mL培养液的独立烧杯中，以建立同克隆系。每个个体均为性重组的结果，具有独特的遗传组成。
  2. 在保存条件下长期维持同克隆系，保存条件为10 ± 1 °C，16:8光暗周期，每周添加0.2 mg C/L的Chlorella vulgaris或其他绿藻（例如，Scenedesmus obliquus），每三周更换一次培养液。保存条件可根据温度、喂养方式和物种的不同而调整。

5. 关键研究

注意：本文提供了两项关键研究的描述，这些研究利用从丹麦灵湖（Lake Ring）沉积物档案中复活的D. magna（亚）种群，评估其对变暖的进化响应。共从以下三个时期复活了三个（亚）种群：1960–1970年、1970–1985年以及>1999年。从沉积物档案中复活的D. magna孵化成功率介于11%至58%之间（图4）。从每个时期获得的孵化个体中随机选取子集，用于本文所述的两项关键研究。这些研究旨在评估：沿温度梯度不同时期复活的（亚）种群是否在与适合度相关的生活史性状上存在差异（5.1），以及在经历变暖暴露后是否具有不同的竞争能力（5.2）。

1958-2004年孵化率历史数据柱状图，种群趋势分析。
图 4：来自林格湖沉积物档案的孵化成功率。 关键研究中所用林格湖沉积物档案中成功孵化的幼体比例。请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 公共花园实验
    1. 从各（亚）种群的培养物中转移10只初孵幼体至公共花园条件下：16 °C；长光周期（16:8 光照:黑暗）；每天以0.8 mg C/L的Chlorella vulgaris喂养，并每隔一天更换培养基。在公共花园条件下维持幼体至少两代（约 45天）。公共花园条件可减少母体效应的干扰，并使幼体间的繁殖同步化。
    2. 当第二代成年雌性释放第二胎幼体进入育幼室后，将其转移至盛有培养基的500 mL广口瓶中，直至其释放第二代幼体。
    3. 从第二代的第二胎中随机选取24–48小时龄的个体幼体，转移至盛有培养基的100 mL广口瓶中，并暴露于以下实验条件：18 °C（湖泊当前温度）和24 °C（变暖条件，IPCC26预测未来100年的温度），16:8 光照:黑暗周期，每天以0.8 mg C/L的Chlorella vulgaris喂养。
    4. 使用体视显微镜测量每个实验个体的成熟体型，即头部至尾刺基部的距离（图5）。对每个个体拍照，并使用合适的图像分析软件进行体型分析。
    5. 测量成熟年龄：首次在育幼室中观察到卵的日期。
    6. 测量死亡率：实验期间死亡个体的数量。
    7. 测量繁殖力：第一次和第二次克隆繁殖所释放的后代总数。
    8. 测量种群增长率，使用欧拉方程（1）估算：
      群体遗传学公式 Σe^(-rx)lxbx=1，静态平衡方程，数学概念。 (1)
      其中lx表示在年龄x时的存活比例，bx表示在年龄x时每个存活个体产生的新生儿数量，r为自然增长率的内禀速率。
    9. 使用商业软件进行统计分析。此处使用R31软件包ggplot2绘制每种生活史性状的反应规范（单个基因型在不同环境中的表型表达）。通过生存分析（R软件包rms；https://cran.r-project.org/web/packages/rms/rms.pdf）计算各群体的死亡率。最后，在R31中进行方差分析（ANOVA，表2），以评估温度对性状的影响是否可归因于进化（种群间差异）、表型可塑性（对处理的响应）或可塑性的进化（种群×处理交互作用）。
  2. 竞争实验
    1. 从各群体的培养物中转移10只初孵幼体至公共花园条件下：20 °C，长光周期（16:8 光照:黑暗），每天以0.8 mg C/L的Chlorella vulgaris喂养，并每隔一天更换培养基。维持公共花园条件至少两代（约 45天），以减少母体效应的干扰。
    2. 从每批初孵个体的第二代第二胎中随机选取24至48小时龄的5只幼体，分别放入实验中型系统（盛有培养基的20 L塑料水族箱）中，每组设三个重复，密度为10只/升。
    3. 将中型系统置于控温培养室或培养箱中，暴露于24 °C、16:8 光照:黑暗周期，并每天以0.8 mg C/L的Chlorella vulgaris喂养，持续至少四周（>3个克隆世代）。
    4. 每周对每个中型系统进行一次淘汰处理，更换10%的培养基，以模拟Daphnia在自然环境中可能遇到的种群动态。通过从每个水族箱中移除已知体积的培养基和个体（本实验中为1.2 L）并补充新鲜培养基来实施淘汰。在实验个体达到成熟后（第10天）开始淘汰处理。
    5. 第四周末，从每个中型系统中取样32只个体，以评估与初始接种物相比基因型组成的改变。
      1. 将单个Daphnia放入微量离心管中，并用巴斯德移液管去除多余液体。
      2. 在液氮中快速冷冻各管，并于-80 °C保存。
      3. 根据现有方案并遵循制造商说明，从单个个体中提取基因组DNA。
      4. 使用足够数量的遗传标记扩增提取的DNA，以确保每只初孵个体具有唯一的多位点基因型。本实验采用8个微卫星位点组成单重多重PCR（M01，表1），操作依据已建立的方案32,33。
      5. 在片段分析仪上对扩增片段进行基因分型。
      6. 使用商业或免费软件，结合合适大小标准进行片段分析。
      7. 通过所述方法33，使用一组微卫星位点对32个个体进行基因分型，评估实验结束时的基因型组成，并计算各基因型在实验结束时相对于初始接种物的频率。

水蚤解剖图，带有红线、显微镜图像、水生生物学研究。
图 5：成年雌性 Daphnia magna。 含有孤雌生殖卵的成年雌性 Daphnia magna，其头部与尾刺基部之间的距离用于测量个体大小。红线表示测量尺寸的位置。比例尺 = 500 µm。

结果

长期的实证数据对于理解自然种群的进化动态及其持续性至关重要。由于在获取时间序列样本方面存在后勤困难，以及需要长期投入数据收集工作，这类数据通常难以获得。本文所介绍的两项关键研究提供了关于淡水生态系统中一种核心浮游动物对温度变化响应的实证证据，时间尺度涵盖进化过程。这一研究得以实现，得益于分层休眠卵库的应用，使得研究人员能够在相同的实验条件下，比较历史种群及其现代后代对环境胁迫的响应。

公共花园实验
共同花园实验表明，所有生活史性状均对温度产生响应（图6 和 图7）。方差分析（ANOVA）结果显示，所有（亚）群体均通过表型可塑性对温度产生响应（表2），但死亡率除外，因其无响应。仅在种群增长率中观察到进化变化（（亚）种群间的差异）的证据表 2），在三个（亚）群体中的两个群体中显著增加 24 °C (图6).

生长速率、体型、繁殖力、年龄与温度的散点图；生物学数据分析。
图6：共同花园实验。 显示了在温度升高（24 °C）条件下，各（亚）种群相对于共同花园及当前温度条件（18 °C）下的生活史性状（繁殖力、体型和成熟年龄）以及种群增长率（r）的反应规范。种群增长率“r”通过欧拉方程（1）计算得出，并展示了置信区间。（亚）种群以颜色编码：（i）蓝色：1960–1970年；（ii）绿色：1970–1985年；（iii）红色：>1999年。请点击此处查看该图的放大版本。

1960-1999 年间灭绝率随时间变化的图表，显示 20 天内灭绝个体的百分比。
图 7：死亡率。在升温条件（24 °C）下与现代温度条件（18 °C）相比，各（亚）种群在不同时期（1960–1970 年；1970–1985 年；>1999 年）的死亡率如图所示。请点击此处查看该图的放大版本。

中型生态系统实验
经过四周的筛选（以24 °C升温表示），与初始接种物相比，三个（亚）种群的频率未发生显著变化（χ2 = 0.55，P = 0.76）（图8）。在中型生态系统实验中接种的30种基因型中，大部分在经过四周筛选后被鉴定出来（图9）。具体而言，70%的接种基因型被成功回收，符合泊松分布预期，即在32个个体的样本中至少回收每种基因型一个代表个体。

柱状图，比较不同实验条件下各年代组（1960–1999年）的人群频率
图8：竞争实验——种群频率。 群体平均中位数及四分位数（25th 和 75th），在三个（亚）群组中的情况如图所示 D. magna 经过四周期间中型生态系统竞争实验的选择后（24 °C)，与初始频率相等时（开始时）相比。（亚）群体现以不同颜色编码，如图所示 图6. 请点击此处以查看此图的放大版本。

按时期和编号绘制的基因型频率柱状图；突出显示数十年间的遗传变异趋势。
图9：竞争实验——基因型频率。 基因型频率——平均中位数及四分位数（25th 和 75th），在经历四周的升温暴露后显示24 °C) 与初始基因型频率相等的情况（虚线）相比。x轴上的名称为接种的基因型ID，按（亚）群体分组（蓝色，1960–1970年；绿色，1970–1985年；红色， >1999). 请点击此处以查看此图的放大版本。

位点等位基因编号 (AN)大小范围 (bp)引物序列 (5’-3’)荧光染料标记重复基序退火温度 (Tm)
B008HQ234154150–170F: TGGGATCACAACGTTACACAAVIC(TC)956
R: GCTGCTCGAGTCCTGAAATC
B030HQ234160154–172F: CCAGCACACAAAGACGAAPET(GA)1156
R: ACCATTTCTCTCCCCCAACT
B045HQ234168118–126F: GCTCATCATCCCTCTGCTTCNED(TG)856
R: ATAGTTTCAGCAACGCGTCA
B050HQ234170234–248F: TTTCAAAAATCGCTCCCATC6FAM(GAA)656
R: TATGGCGTGGAATGTTTCAG
B064HQ234172135–151F: CTCCTTAGCAACCGAATCCA6FAM(TC)856
R: CAAACGCGTTCGATTAAAGA
B074HQ234174196–204F: TCTTTCAGCGCACAATGAATNED(GT)956
R: TGTGTTCCTTGTCAACTGTCG
B096HQ234181234–240F: GGATCTGGCAGGAAGTGGTAVIC(AC)1556
R: TTGAACCACGTCGAGGATTT
B107HQ234184250–274F: GGGGTGAAGCATCAAAGAAAPET(CT)856
R: TGTGACCAGGATAAGAGAAGAGG

表1：微卫星多重扩增信息。 显示了NCBI登录号（AN）、多重扩增信息、PCR引物序列、PCR产物大小范围、重复序列基序、用于标记正向引物的荧光染料以及退火温度（Tm）。

种群增长率（r）DfFP
进化（种群）230.309<0.001
表型可塑性（温度）1531.546<0.001
进化×可塑性交互作用（种群 × 温度）265.137<0.001
死亡率DfFP
进化（种群）22.2340.1162
表型可塑性（温度）12.6790.1071
进化×可塑性交互作用（种群 × 温度）21.86570.164
繁殖力DfFP
进化（种群）21.88520.1633
表型可塑性（温度）16.89340.0117
进化×可塑性交互作用（种群 × 温度）21.65110.203
成熟时体型DfFP
进化（种群）20.2110.8106
表型可塑性（温度）111.13610.0017
进化×可塑性交互作用（种群 × 温度）20.65860.5225
成熟时年龄DfFP
进化（种群）20.78110.4637
表型可塑性（温度）18.07640.0066
进化×可塑性交互作用（种群 × 温度）20.0880.9159

表2：方差分析(ANOVA)。 方差分析用于检验复活的（亚）种群在变暖条件下生活史性状和种群增长率的变化是否由进化适应（种群）、表型可塑性（温度处理）及其交互项（可塑性的进化）所解释。显著的p值（p<0.05）以粗体显示。

补充视频 1：沉积物岩心的采样。 视频展示了使用 Big Ben 采样器的过程。Big Ben 是一种长约 1.5 m、内管直径为 14 cm 的岩心管。它由连接绳索的活塞和采样头组成，并通过连接杆将岩心管压入沉积物中。采样时使用岩心捕集器支撑岩心管，整个装置从一艘小型船只上部署。活塞依靠重力作用被压入沉积物中。在后续的岩心挤出过程中，使用一个支架固定岩心管，并通过改装的千斤顶将活塞向上推动以完成挤出。每层沉积物被收集在平坦的金属表面上，随后转移至透明采样袋中，于避光、低温（4 °C）条件下长期保存。请点击此处下载该文件。

补充视频 2：沉积物筛分。 沉积物筛分所需的设备包括精密天平、白色采样托盘和地质筛。从每一层沉积物中至少保留 5 g 用于放射性测年。剩余的沉积物用于分离溞休眠卵（ephippia）。沉积物依次通过两个叠放的地质筛进行筛分，上方筛网孔径为 1 mm，下方为 125 µm。将介质倒入 1 mm 筛网中，以分离黏土、大型无脊椎动物和颗粒物质。倒入下方 125 µm 筛网的介质则用于分离 D. magna 的休眠卵及细小颗粒物。随后将部分筛后沉积物转移至白色采样托盘中。在白色背景的托盘中，通过肉眼识别 D. magna 的休眠卵。将来自每一层的休眠卵分别收集于不同的培养皿中。请点击此处下载该文件。

补充视频3：脱壳。 在体视显微镜下，使用显微解剖镊对D. magna休眠卵的几丁质外壳脊部施加压力，将其打开。小心去除内层卵膜，并用巴斯德吸管将休眠卵轻柔转移至含有10 mL培养基的培养皿中。请点击此处下载该文件。

补充视频4：孵化。在长光照周期和20 °C条件下暴露后，胚胎发育在48小时至数周内恢复。当发育完成后，胚胎从卵壳中孵出，并在培养基中自由游动。请点击此处下载该文件。

讨论

由于水的高导热性，在全球变暖背景下，淡水生态系统比陆地生态系统面临更高的生物多样性丧失风险34。因此，了解这些生态系统中关键物种的响应机制，并确定应对热胁迫的生存策略至关重要。在物种和群落水平上理解这些机制，有助于预测全球变暖对物种的影响，以及单个物种所受影响如何级联至其他营养级。最终，理解对全球变暖的响应机制有助于确定减缓物种灭绝的修复策略。

D. magna 对温度升高的响应在很大程度上由其生活史性状的可塑性所介导，且仅温度升高本身在此研究所涉及的种群中并未带来明显的适合度代价。生活史性状的高可塑性得到了支持，因为在变暖条件下，（亚）种群之间的竞争能力差异并不显著。然而，要推广这些发现，可能需要针对多个种群开展更长期的竞争实验。

休眠阶段的复苏为研究物种适应机制及其随时间推移的进化轨迹提供了前所未有的资源10浮游动物物种具有较短的世代周期（约两周），以及休眠阶段的存活能力，这使得祖先个体能够与其后代直接竞争，或“重演”从不同历史状态开始的进化过程。复活生态学本质上能够探究特定的进化结果是否依赖于某些先前发生的事件。目前，在利用微生物开展的实验室实验中，通过将“祖先谱系”冷冻保存并在后续复苏，进而与进化后的后代进行比较分析，已有可能鉴定出进化的遗传基础。6然而，使用实验室生物进行研究的一个主要局限在于，“祖先状态”实际上是一个已经发生偏移的基线。对休眠阶段的研究使得研究人员能够采集到早于任何胁迫事件发生时间的样本例如，原始的环境条件）并测量从未受干扰的环境条件到各个历史时期直至现代的进化轨迹。近年来，对复活或仍处于休眠状态的浮游动物阶段的DNA多态性研究，为过去的种群动态和适应性过程提供了重要见解，这些过程影响了当今种群的遗传构成14,16,25,33,35,36随着高通量测序技术的普及，可以对复苏或仍处于休眠阶段的生物进行基因组和转录组测序，从而测定在时间推移中进化群体所积累的遗传变异类型和数量。

本文所展示的复苏标准操作程序在多组学领域具有两个层面的重要应用。多组学技术可应用于复苏的样本，从而对适应环境选择压力过程中涉及的分子要素进行全面分析。此外，组学技术也可应用于脱壳但仍处于休眠状态的发育阶段。迄今为止，高通量测序技术在休眠阶段中的应用一直受限于所需起始材料的数量较大。这些限制正在逐步消除37。随着对起始材料需求量的降低以及纳米流控技术的进步，全基因组测序（WGS）现已可在仅需1 ng甚至几皮克（pg）起始材料的情况下完成38。全基因组扩增（WGA）和全转录组扩增（WTA）技术的应用，使得从极少量组织中富集DNA和RNA成为可能，从而彻底改变了宏基因组学39,40和医学研究41。将这些技术应用于脱壳后的休眠卵，可突破休眠阶段存活能力的限制，进而研究更长时间尺度（例如，数个世纪）的生物学过程。

复苏产生休眠阶段的无脊椎动物群落，能够将群落的历史与已知的自然景观变化，或与通过沉积物或土壤分析推断出的环境变化相对应2。分析群落对环境变化的响应，使我们能够量化具有重大影响的生态-进化反馈机制42，这些反馈对种群的持续存在43、营养级相互作用44、群落构建过程45以及生态系统功能和服务的变化46具有重要作用。最后，准确预测生物对环境变化的响应对于指导生物多样性保护至关重要47。目前的预测模型在这一方面尚不准确，因为它们未充分考虑诸如种群动态、扩散、进化以及物种间相互作用等关键生物学机制。理解这些过程如何随时间变化，并将这些信息作为先验知识纳入预测模型，将有助于提升我们在环境变化背景下预测物种和群落持续性的能力2。

本文所述标准操作程序的应用并非没有挑战。复苏休眠阶段的主要局限在于需要使用专门的采样设备。此外，从沉积物筛分到建立克隆培养的整个过程都需要大量的人工操作时间。

本文所述的部分标准操作步骤可轻松转移应用于其他 水蚤 物种。这些步骤包括：取样、克隆系的建立和实验设计。然而，该标准操作程序的其他步骤可能需要根据所研究的物种进行进一步的优化。脱壳通常应用于 D. magna 通过改善孵化刺激来提高孵化成功率。然而，这种方法可能不适用于较小的标本。不同物种间的孵化刺激也可能存在差异48 同种标本之间49因此，一个 特设的 在将标准操作流程的孵化步骤应用于其他甲壳类动物之前，可能需要对其进行优化。尽管该方案的孵化成功率 D. magna 从湖泊沉积物档案中复活的种群（占沉积记录的30.5%）与先前的研究结果一致49，孵化成功率因沉积物的保存状态和物种而异50,51，以及沉积物的地理来源48未来需要开展针对调控滞育各阶段进入与进程的机制研究，以确定针对不同物种的最佳孵化刺激条件。

最后，了解研究系统的背景知识，特别是目标物种在时间上的存在情况，是十分必要的。这可以通过查阅历史记录来实现。如果无法获得历史记录，则建议在钻取岩芯之前，对湖泊沉积物表层进行采样和筛查，尽管这种方法可能仅能提供最近时期的信息。

披露

作者无任何利益冲突需要披露

致谢

本工作由英国自然环境研究委员会重点资助项目（NE/N016777/1）资助。Ensis有限公司、环境科学服务中心、伦敦大学学院环境变化研究中心负责采集并测定沉积物岩心的年代。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
采样袋Fisher Scientific11542783采样袋采用绕线式封口系统，带安全扣，无菌聚乙烯材质，带书写区域，透明，厚度为89µm，尺寸为140 mm × 229 mm，容量720 mL，Fisherbrand
活塞取芯器ENSIS ltdna一种长而重的管状设备，插入海洋、湖泊或池塘底部以提取泥质沉积物样品。活塞取芯器直径可变，通常由PVC材料制成
精密天平Veritas-M124ATLP-50分析天平
地质筛UKGE limitedSV7521直径200 mm地质筛，筛网孔径1 mm
地质筛UKGE limitedSV7525直径200 mm地质筛，筛网孔径0.125 mm
白色采样托盘nhbshttp://www.nhbs.com/title/view/159614?ad_id=1509标准多功能实验托盘
巴斯德移液管Globe Scientific inc.138020B转移移液管，容量1.7 mL，通用型，长度87 mm，带吸头，可吸取0.9 mL液体
体视显微镜nikonsmz800放大倍数范围为1×–8×的显微镜，连接有相机控制单元
培养皿EduLab153-533无菌塑料培养皿，直径90 mm
玻璃广口瓶compakRound Jam Jars 4oz100 mL广口瓶
玻璃广口瓶compakAtum Jars/ Bonta Jar 10oz200 mL广口瓶
玻璃广口瓶bottlecompanysouth500ml Food Jam Jar With Twist Off Lid500 mL广口瓶
统计软件Rhttps://cran.r-project.org/na免费在线GNU 语言与环境，用于统计计算与图形处理
显微解剖镊Fisher Scientific41122405用于显微解剖的细尖不锈钢镊子
图像处理软件https://imagej.nih.gov/ij/index.htmlna开源ImageJ图像处理工具包，使用Java语言编写
中型生态系统实验装置amazonnaNobby Fauna-Box III，尺寸41 cm × 23 cm × 29 cm，容量20.0 L
微量离心管Sigma_Aldrick - MerckZ606340优质微量离心管，容量1.5 mL
AGENCOURT DNAdvanceBeckman CoulterA48705DNA提取试剂盒
片段大小标准品Thermo Fisher Scientific4322682LIZ500 — 与ABI测序仪兼容的片段大小标准品
ABI3032测序仪ABIna用于进行片段分析或桑格测序的测序仪

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休眠 Daphnia magna 的复苏：方案与应用
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