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方法文章

利用神经递质谷氨酸对大鼠视网膜进行仿生化学神经调节的方法学 体外

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DOI：

10.3791/56645

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2017年12月19日

 ,  , 
1Department of Mechanical and Industrial Engineering, University of Illinois at Chicago, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University

本文内容

摘要

本方案描述了一种利用神经递质谷氨酸在体外对大鼠全层视网膜进行化学神经刺激研究的新方法。in vitro（体外）化学神经刺激是一种有前景的新型手段，可作为传统电刺激视网膜神经元的替代方案，用于治疗由光感受器变性疾病引起的不可逆性失明。

摘要

光感受器变性疾病通过视网膜中光感受器细胞的进行性丧失导致不可逆的失明。视网膜假体是一种新兴的治疗光感受器变性疾病的手段，旨在通过人工刺激视网膜中幸存的神经元，从而在患者中诱发可理解的视觉感知。目前的视网膜假体已证明可通过电极阵列对视网膜进行电刺激，成功恢复患者的有限视力，但在恢复高分辨力、自然视觉方面仍面临显著的物理障碍。利用内源性神经递质进行化学神经刺激是电刺激的一种仿生替代方案，有望克服基于电神经刺激的视网膜假体所固有的基本局限性。具体而言，化学神经刺激通过在比现有电假体精细得多的空间分辨率下，注射极微量的神经递质——即视网膜化学突触所使用的天然信号传递分子——有望为患者恢复更自然的视觉，达到与现有技术相当甚至更优的视觉敏锐度。然而，作为一种相对未被充分探索的刺激范式，目前尚无成熟的方案用于实现视网膜的化学刺激。 体外本研究旨在为希望探索视网膜或类似神经组织化学神经调控潜力的研究人员，提供一套完成视网膜化学刺激的详细操作框架。 体外在本研究中，我们描述了一种实验装置与方法，通过使用玻璃微移液管和定制的多通道微流控装置，将可控体积的神经递质谷氨酸注入视网膜下腔，从而在野生型及感光细胞退化的完整大鼠视网膜中诱发视网膜神经节细胞（RGC）的动作电位反应，模拟视觉光反应。该方法与实验方案具有通用性，可适用于其他神经递质的神经调节，甚至可推广至其他神经组织。

引言

视网膜感光细胞退行性疾病，例如视网膜色素变性（retinitis pigmentosa）和年龄相关性黄斑变性，是导致视力丧失的主要遗传性病因，目前尚无治愈手段1,2。尽管这些疾病由多种特定的基因突变引发，但作为一类疾病，其共同特征是视网膜中感光细胞进行性丧失，最终导致失明。感光细胞的丢失会引发视网膜广泛的结构重塑，但在感光细胞退变的晚期阶段，仍有部分视网膜神经元（包括双极细胞和RGCs）保持存活且具备相对正常的功能3,4,5,6,7。

这些疾病的机制和病理特征已被充分阐明3,4,5,6,7 但有效的治疗方法仍然难以实现。在过去三十年中，全球研究人员已探索了多种治疗方案，旨在恢复因光感受器退行性疾病而受损的视力，包括基因治疗8干细胞治疗9视网膜移植10，以及人工刺激11,12 存活的视网膜神经元。其中，临床上最可行的是视网膜假体，这类人工神经刺激装置传统上利用电极阵列，以特定模式对双极细胞或视网膜神经节细胞（RGCs）进行电刺激，旨在为患者产生人工视觉感知11. 当前一代的电刺激假体，例如 Argus II13 和 Alpha-IMS14 设备已获得临床批准，初步研究表明，通过视网膜上（视网膜前）和视网膜下（视网膜后）植入设备恢复部分视力，可改善患者的生活质量15,16全球各地的研究团队正在致力于推进视网膜假体技术，以超越第一代设备所取得的成果17,18,19,20 但在设计能够使患者的视力恢复到法定盲症水平以下的高清晰度视觉的电假体方面，研究人员遇到了困难。近期研究表明，由于电荷注入量的限制，当前一代基于电刺激的假体难以实现更高的空间分辨率；这一限制要求必须使用较大的电极以安全地刺激视网膜神经元，但会以牺牲空间分辨率为代价。 即 视力11,21此外，电刺激还存在进一步的局限性，因为它通常会刺激所有邻近的细胞，从而在患者中引发不自然且令人困惑的感知，这在很大程度上是由于其本质上是一种非自然的刺激模式21然而，电刺激的早期成功表明，人工神经刺激可作为感光细胞变性疾病的有效治疗方法。这使人假设，若使用神经递质化学物质——化学突触间天然的信息传递介质——对视网膜进行刺激，或许能实现更为有效的治疗。本文所提出方法的目的在于探索化学刺激的治疗可行性，即通过模拟视网膜神经元之间天然的突触通信系统，为视网膜假体提供一种仿生替代电刺激的策略。

将治疗性化学刺激的概念转化为化学视网膜假体，依赖于通过微流控装置释放少量内源性神经递质（如谷氨酸），以化学方式激活目标视网膜神经元。该微流控装置包含大量微孔阵列，可响应视觉刺激释放神经递质。通过这种方式，化学视网膜假体本质上是一种仿生的人工感光细胞层，能够将自然到达视网膜的光子转化为化学信号。由于这些化学信号使用的是正常视网膜信号传导中所采用的相同神经递质，并通过与正常视觉通路相同的突触通路刺激退化视网膜中尚存的神经元，因此通过化学视网膜假体所获得的视觉感知可能比通过电刺激假体诱发的视觉更为自然且易于理解。此外，由于释放神经递质的微孔可制作得极小且能以高密度排列，与电极不同，潜在的化学假体可能实现更局灶性的刺激和更高的空间分辨率。因此，基于这些潜在优势，化学视网膜假体为电刺激假体提供了一种极具前景的替代方案。

然而，对视网膜的化学刺激直到最近才受到较少关注。尽管视网膜的电刺激已在数十年的研究中得到充分表征， 体外22,23, 体内23,24以及临床研究13,14，关于化学刺激的研究一直仅局限于少数几种 体外 作品25,26,27,28. Iezzi 和 Finlayson26 和 Inayat 等27 视网膜内表面化学刺激视网膜的演示 体外 分别使用单电极和多电极阵列（MEA）记录视网膜神经元对谷氨酸刺激的反应。最近，Rountree 等28 通过视网膜下侧的谷氨酸刺激，利用多电极阵列（MEA）记录视网膜多个位点的神经反应，证明了对视网膜OFF通路和ON通路的选择性激活。尽管这些研究初步确立了化学刺激的可行性，但仍需进一步研究以探索该方法在现有研究尚未涉及的诸多方面的特性与潜力。25,26,27,28，并精细调整两种情况下的治疗刺激参数 体外 和 体内 动物模型研究，然后再将此概念转化为化学视网膜假体，如上所述。然而，目前文献中尚无建立成熟的视网膜化学刺激方法学体系，以往研究中所采用的方法亦未被详细描述到足以支持重复性研究的程度。因此，本文方法学论文的立意在于提供一个明确定义的实验框架，以开展相关研究。 体外 视网膜的化学刺激，适用于有意重复我们先前研究的科研人员27,28 或进一步推进化学神经刺激这一新兴概念。

在此我们展示一种进行 体外 在野生型大鼠以及一种光感受器退化的大鼠模型的视网膜全层标本中，对视网膜神经元进行化学刺激，该模型 closely mimics 人类光感受器退行性疾病的进展。开发此种刺激方法的原理在于 体外 模型旨在评估不同刺激参数的治疗范围，并研究在常规条件下难以或无法观察到的神经反应特征 体内 模型，尤其是在初步研究中评估该方法可行性的阶段。在本实验中，我们分别通过市售单通道玻璃微电极和自行设计的多通道微流控装置，向目标视网膜神经元附近递送少量1 mM谷氨酸，实现单点及同步多点化学刺激。尽管单点和多点刺激均可实现化学神经调控治疗可行性研究的基本目标，但二者各有特定用途和独特优势。单点刺激可使用市售预拉制玻璃微电极完成，能够将化学物质直接注入视网膜单一位置的亚表层区域，用于检测在注射位点下方是否可诱发类似于视觉诱发光反应的可观察视网膜神经节细胞（RGC）放电率响应。而多点刺激则需使用专门制备的多通道微流控装置，可在视网膜表面多个空间位点同步递送化学物质，用于研究在模式化刺激实验中，谷氨酸诱发的RGC反应模式与谷氨酸注射模式之间的对应关系。

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方案

所有动物实验均按照美国国家研究委员会《实验动物护理和使用指南》中规定的准则进行。动物操作和安乐死方案已通过芝加哥伊利诺伊大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的审查和批准。

1. 动物模型

  1. 野生型 Long-Evans 大鼠
    1. 获取一只年龄为 24 - 32 天、性别不限、在标准 12 小时明/暗循环条件下饲养的野生型 Long-Evans 花斑大鼠。
    2. 在开始实验前 1 小时，将大鼠置于完全黑暗的房间中进行暗适应。
  2. S334ter-3 大鼠
    1. 将表达两个拷贝突变视紫红质基因的转基因白化纯合 S334ter-3 大鼠品系（性别不限）与有色野生型 Long-Evans 大鼠杂交，以获得具有色素的杂合 S334ter-3 大鼠，其感光细胞退化进程与人类视网膜色素变性相似29,30。
    2. 在标准 12 小时明/暗循环条件下饲养杂合子后代，实验时使用不同年龄（对应不同感光细胞退变阶段）且性别不限的大鼠：早期退变阶段：14 - 20 日龄；中期退变阶段：21 - 27 日龄；晚期退变阶段：28 - 35 日龄；完全失明阶段：>50 日龄。
    3. 在开始实验前 1 小时，将大鼠置于完全黑暗的房间中进行暗适应。

2. 氨基酸培养基溶液与灌流系统的制备

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图1：实验装置示意图。 使用玻璃微吸管 (A) 和定制多通道微流控装置 (B) 进行化学刺激的实验装置示意图。视网膜被放置在pMEA上，并通过pMEA的穿孔从顶部和底部持续灌注新鲜的、含氧的Ames培养基溶液。pMEA电极采集到的神经反应信号经MEA放大器传入数据采集计算机。视觉刺激和化学刺激分别通过绿色LED和8通道压力注射器实现，两种刺激均由专用的刺激计算机触发，该计算机还通过高精度三维微操纵器控制微吸管的位置。实验过程中使用倒置显微镜观察视网膜。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：实验装置示意图。（A）完整实验装置的照片，显示了所有组件的相对位置。MEA放大器系统放置在倒置显微镜上方，实验过程中通过连接的高速相机对视网膜进行视觉检查，并对器件-视网膜界面进行数字成像。顶部和底部灌流由电磁阀控制的灌流系统独立调控。注射、位置控制和阻抗测量分别通过压力注射仪、显微操作器和膜片钳放大器（橙色框；详见B图）完成。玻璃微电极或器件插入膜片钳前置放大器中用于阻抗测量，并安装在龙门架上（绿色框标示；详见C图），以便通过显微操作器进行精确定位。（B） 实验中使用的测量与控制仪器的特写：8通道压力注射仪、显微操作器控制系统、用于阻抗测量的膜片钳放大器，以及用于消除灌流液的吸液装置。（C） 注射系统龙门架的特写，显示一个多端口器件与移液管夹持器、膜片钳前置放大器和显微操作器的连接情况。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：灌流装置示意图。（A）MEA放大器顶部的照片，显示顶部灌流口和吸液口的位置，以及用于可见光刺激的绿色LED。（B）pMEA灌流腔的特写图，展示顶部灌流口和吸液口、pMEA以及用于阻抗测量的参考电极的精确位置。（C）底部灌流板的显微照片。请点击此处查看该图的放大版本。

注意：参见图1、图2和图3

  1. 在室温（约 21 °C）下量取 900 mL 去离子水，置于 1 L 容器中。
  2. 使用鼓泡装置向水中通入 100% CO2。
    1. 将 8.8 g 粉末状 Ames 培养基加入 1 L 容器中的水中。
    2. 用几 mL 去离子水冲洗 Ames 培养基容器，以去除残留的粉末，并将冲洗液加入 1 L 容器中。
    3. 向 1 L 容器中加入 25.3 mL 碳酸氢钠溶液（7.5% w/v31）。
    4. 加入额外的水，使溶液最终体积达到 1 L。
    5. 继续向溶液中通入 CO2 约 5 分钟。
  3. 停止通入 CO2，改为通入医用级混合气体（95% O2 和 5% CO2），持续至少 30 分钟，或直至 pH 稳定在 7.4。
    注意：本实验方案中，Ames 培养基全程保持在室温（约 21 °C），以防止 CO2 或 O2 逸出，避免产生气泡阻塞灌注管路。
  4. 用 70% 乙醇充满上下灌注管路进行清洗，然后用去离子水各冲洗 3 次。将下部管路充满去离子水，上部管路充满空气。使用电磁阀系统关闭两条管路。
  5. 将主灌注管连接至 1 L Ames 培养基容器的鲁尔接头。
  6. 打开上部灌注阀，保持开启状态，直至溶液从上部灌注出口流出。随后关闭上部灌注阀。
  7. 打开下部灌注出口，保持开启状态，直至所有气泡均从下部灌注出口排出。
  8. 将一个空的吸液瓶连接至主吸液管，并开启吸力源。确保上下吸液入口均处于开放且正常工作状态。
  9. 确保所有计算机显示屏均覆盖红色滤光片，以避免对视网膜造成无意的视觉刺激。

3. 全眼球视网膜制备

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图4：视网膜的解剖与整体装片制备。 (A) 来自光感受器退化动物的完整眼杯照片。(B) 对视网膜进行纵向切口以展平的显微照片。(C) 展平视网膜后，将其光感受器面朝下放置于网格上，并在空气中（非灌流液环境中）进一步展平，以确保无皱褶或边缘卷曲。(D) 将网格与视网膜迅速转移至多电极阵列（pMEA）上，使节细胞层一侧接触电极，并立即用含氧Ames培养基进行灌流。请点击此处查看该图的放大版本。

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图5：带穿孔的多电极阵列。 (A) 本实验方案中所用带穿孔多电极阵列的照片。视网膜被放置于pMEA腔室内的电极阵列上（红色矩形所示区域，在B图中更详细展示），以便持续灌注含氧的Ames培养基。 (B) 电极阵列本身的显微照片，显示电极之间穿孔的排列方式。 请点击此处查看该图的放大版本。

注意：参见图4和图5

  1. 根据IACUC规程，使用手持红色LED手电筒提供微弱红光照明，通过二氧化碳窒息法对动物实施安乐死，随后进行颈椎脱位或其他选定方法。
  2. 使用钟表匠#5镊子摘除双眼，并将摘出的眼球置于直径60 mm的培养皿中，加入约3–4 mL新鲜、充氧的Ames培养基溶液。
  3. 在解剖体视显微镜下观察眼球，显微镜的顶部和底部光源均覆盖红色滤光片，用手术刀或一对尖头剪刀在角膜表面做一个小切口。
  4. 从该小切口向角膜边缘剪开，然后沿角膜全周进行环形切割。移除已分离的角膜以及晶状体、透明的房水和玻璃体。
  5. 用一对镊子轻轻夹住眼杯，在眼杯相对两侧各做两个小切口；接着使用两对镊子在切口处轻轻将眼杯拉开，使视网膜与巩膜分离。 缓慢将整个视网膜从巩膜和眼杯上提起。若视神经仍附着，将其剪断。
  6. 用剪刀对视网膜进行纵向切割，获得半片或四分之一片的视网膜组织，然后将其中一片视网膜组织轻轻铺展在尼龙网上（丝线直径100 µm，孔径350 µm），使节细胞层（视网膜凹面）背离尼龙网。
  7. 将带有视网膜的尼龙网放置于穿孔多电极阵列（pMEA）上，使节细胞层与pMEA表面接触。 然后在尼龙网上方轻轻放置一个带重物的切片固定网格，以固定视网膜位置。

4. 多电极阵列与数据采集系统的设置

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图6：pMEA的噪声水平。 (A) 一组表现出高持续性噪声的pMEA电极的代表性记录。这种噪声通常是由于pMEA焊盘与MEA放大器插针之间接触不良所致，原因在于pMEA上覆盖的薄型穿孔聚酰亚胺层（尤其是在焊盘区域）因正常使用而磨损。另一个可能的噪声来源通常是溶液泄漏到pMEA放大器的接触焊盘上。由于插针接触不良和/或接触焊盘上有液体泄漏引起的持续性噪声，通常可通过调整pMEA在放大器中的位置以改善接触，以及分别清洁并干燥焊盘来纠正。如果通过清洁或调整pMEA位置仍无法消除噪声，则可能需要完全更换pMEA。 (B) 来自一个洁净且pMEA与放大器接触良好的pMEA上部分电极的噪声水平代表性记录。通常，平均噪声水平在±16 µV以内。 请点击此处查看该图的放大版本。

注意：参见图6

  1. 在红光照明下，将 pMEA 放入 MEA 放大器中，并关闭放大器卡扣。
  2. 如果 pMEA 腔室环上尚未有参考标记，则在显微镜支架可清晰观察到的区域刻出两个相距约 5 mm 的“X”形标记。
  3. 将顶部灌流出口置于 pMEA 腔室内，并打开顶部灌流阀，使灌流速度达到约每分钟 3 mL。将顶部吸液入口置于所需灌流液面高度（约 5 mm 深），并确保其正常工作。
  4. 在数据采集计算机上打开数据采集软件，点击“播放”按钮以开始接收数据。确保所有 pMEA 通道无噪声并正在记录神经信号。若未达到此状态，请重新调整 pMEA 在放大器中的位置，以改善放大器针脚与 pMEA 接触点之间的接触（参见 图 5）。
  5. 确保底部灌流管路中无任何气泡；若无气泡，打开底部灌流阀，以保证视网膜底部获得充足的氧气和营养物质。
  6. 启动倒置光学显微镜（10X 放大倍数，数值孔径 N.A. 为 0.45）连接的高速相机，并打开成像软件。确保倒置显微镜照明器覆盖红色滤光片，仅发射红光，然后将照明强度调至低水平，以避免视网膜发生光漂白。
    1. 通过监视器观察倒置显微镜视野的实时数字图像，检查 pMEA 底面是否有溶液流经底部灌流板的迹象。
  7. 确认底部灌流正常流动后，通过手动调节真空废液装置上的真空压力旋钮，同时在倒置显微镜下观察视网膜，缓慢增加底部负压。当观察到对视网膜产生明显吸附力时，停止增加负压。注意避免负压过大或过小。
  8. 在确认底部负压已将视网膜固定到位后，用镊子取下压在视网膜上的切片网格，并小心地从一角开始剥离尼龙网，使其与视网膜轻松分离。此时视网膜应牢固附着于 pMEA 底部，且视网膜色素上皮面朝上暴露。保持灌流持续约 30 分钟，使视网膜从手术创伤中稳定恢复。

5. 谷氨酸刺激准备

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图7：玻璃微移液管与多通道微流控装置。 (A) 插入微移液管或装置前的移液管固定器。银/氯化银电极（直径50 µm）在末端与适配器电连接，以与膜片钳前置放大器接口相连。 (B) 玻璃微移液管与移液管固定器连接后的照片，显示用于启动气动注射的压力接口位置。 (C) 一个定制的多通道微流控装置（尺寸为1 cm × 1 cm × 0.134 cm），连接至一个定制的3D打印夹具，并通过不锈钢管与移液管固定器连接。该装置由两层构成：底层（厚340 µm）设有八个微端口（直径14 µm），顶层（厚1 mm）设有八个片上储液池（直径1.6 mm），用于储存谷氨酸。装置底层的每个微端口通过平面内微通道独立连接至顶层的相应片上储液池，而每个片上储液池又通过柔性管连接至8通道压力注射器的压力接口，从而实现对各个微端口的独立控制，以进行模式化多点注射。 (D) 使用镊子夹持的多通道装置特写，显示在连接管路接口夹具前，八个可独立寻址的片上储液池及管路入口的排列方式。 (E) 装置底面的显微照片，显示八个直径为14 µm的微端口以3 × 3阵列排列，间距200 µm，以便与pMEA电极对齐。八个外围微端口用于多点注射，中央端口仅在装置制造过程中用于对准。 请点击此处查看该图的放大版本。

注意：参见图7。

  1. 通过将谷氨酸储备液与充氧的Ames培养基溶液混合，配制0.5 mL、工作浓度为1 mM的谷氨酸溶液。
  2. 将预先拉制的直径为10 µm的微移液管或连接至多通道微流控装置的不锈钢杆小心插入标准移液管支架中，支架内含一根直径为50 µm的银/氯化银丝电极。
    注意：若无阻抗检测条件，可省略银/氯化银丝电极。
  3. 将移液管支架连接至膜片钳头级放大器，并将移液管支架的压力接口鲁尔接头连接至压力注射系统的1号通道（若使用玻璃微移液管）；若使用多通道装置，则将8个注射端口的压力接口鲁尔接头分别连接至压力注射系统的1–8号通道。
  4. 手动开启压力注射系统，并打开1号通道（或根据情况打开1–8号通道）。确保系统与大气相通，并将注射压力设定为0.1 psi。
  5. 开启显微操作器，并通过操作器控制器上的“校准”按钮进行校准。调整显微操作器位置，使微移液管尖端（或相应装置底部）位于MEA放大器上方约30 mm处。
  6. 将少量谷氨酸溶液（含1 mM谷氨酸的标准Ames培养基）加入小培养皿中，并将其置于显微操作器下方。将微移液管尖端（或相应装置）浸入溶液中，按下压力注射系统上的“填充”按钮（负压为-13 in H2O），直至在玻璃微移液管或多通道装置的管路中可见约20 mm的液柱。
    1. 若使用多通道装置，关闭压力注射器的1号通道，对2–8号通道重复上述填充步骤。将微移液管尖端或装置从溶液中提起，移除培养皿，并将显微操作器移至pMEA腔室上方。
  7. 使用支架式体视显微镜，将微移液管尖端或装置的角部与pMEA腔室环上刻有的参考标记对齐。通过控制软件中的“存储参考点A”和“存储参考点B”按钮（或手动记录操纵器坐标），将显微操作器的坐标系统与pMEA电极位置对应起来。
  8. 使用显微操作器控制软件，选择一个具有较强自发性电活动的目标pMEA电极，点击“移动至通道”按钮，使玻璃微移液管与目标电极对齐。若使用多通道装置，则采用相同方法，将装置的微孔与具有较强自发性电活动的目标pMEA电极对齐。

6. 与视网膜的接口

  1. 如果可进行阻抗测量，打开膜片钳放大器，并通过点击“开始”按钮启动阻抗可视化软件，以观察位于移液管支架内的银/氯化银电极的阻抗。在实时观察阻抗信号的同时，缓慢降低微移液管或装置，直至其接触视网膜表面，此时阻抗信号会迅速上升（见图8）。记录或记下视网膜表面的位置。
    1. 若无法进行阻抗测量，可通过视觉观察来判断与视网膜表面的接触，但精度较低。将移液管或装置缓慢下降，直至其明显接触到MEA腔室中Ames培养基溶液的液面顶部。
    2. 然后，在倒置显微镜下观察视网膜顶部，缓慢降低移液管或装置，直至视网膜表面出现可见形变，表明已接触视网膜表面。记录或记下视网膜表面的位置。
  2. 对于深层刺激，将移液管再向下降低40 µm（针对S334ter-3视网膜）或70 µm（针对野生型视网膜）。
  3. 使用压力注射系统（0.1 psi）进行数次短时程（10 - 30 ms）注射，同时通过数据采集软件观察神经信号，以确定微移液管尖端或装置微孔附近的细胞是否对谷氨酸刺激有反应。
    注意：成功的注射会引发明显可见的放电频率激增或放电抑制（见图9）。若未观察到反应，应将微移液管或装置重新定位至另一个电极处。

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图8：阻抗测量。 (A) 阻抗测量技术的示意图。使用膜片钳放大器，在微移液管缓慢下降接近视网膜表面的过程中，持续监测其阻抗。当微移液管位于视网膜上方时，Ames培养基相对较高的离子电导率导致测得的阻抗值较低。当微移液管与视网膜表面接触时，银/氯化银导线的离子电导率降低，引起测量阻抗迅速升高。(B) 显示微移液管尖端与视网膜表面接触前后所记录阻抗变化的曲线图。在接触前，微移液管尖端处于溶液中，此时测得的阻抗相对较低（由左侧橙色区域表示）。一旦发生接触（由红色箭头和右侧绿色区域表示），由于与视网膜组织接触后离子电导率降低，阻抗迅速上升。在实际操作中，视网膜表面的位置被定义为测量阻抗开始急剧上升时对应的高度（即红色箭头所指位置）。请点击此处查看该图的放大版本。

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图9：视觉刺激、自发活动及谷氨酸注射期间神经活动的电极记录。 (A) 来自九个pMEA电极的代表性记录，显示在绿色LED光刺激期间经高通滤波处理的电极数据，其中每个矩形代表一个独立电极的神经数据。每个电极记录展示了绿色LED开启后第一秒内采集的数据（各图中橙色箭头所示时间点），左侧y轴显示统一的电压标度。通过设定-18 µV的阈值电压（各电极图中红色水平线）识别出动作电位，并以黑色轨迹叠加在绿色电极信号上表示。除位于顶部中央的电极表现出对光的抑制性反应外，其余所有电极均出现明显的放电爆发（兴奋性反应）。 (B) 相同电极在无视觉刺激或注射刺激条件下记录的自发神经活动图示。尽管存在较小的放电簇，但其放电模式与视觉刺激诱发的模式显著不同。 (C) 在中央电极注射谷氨酸后立即记录的同一组电极的代表性数据（各图中橙色箭头指示注射时间点）。注射的谷氨酸在中央电极引发了一次放电爆发，其特征与视觉诱发的放电爆发非常相似。其余所有电极均未受谷氨酸注射影响，表明该化学刺激技术具有良好的空间分辨率。 请点击此处查看该图的放大版本。

7. 启动视网膜记录与刺激程序

  1. 将绿色LED对准视网膜的上表面。在专用记录计算机上使用数据采集软件，输入文件名并点击“record”按钮开始记录。
  2. 记录开始后，打开刺激控制程序，点击“Read Stimulus File”按钮加载默认刺激文件。接着点击“Run Stimulus File”按钮，启动默认刺激文件，该文件包含如下所述的刺激和数据采集方案：
    注：(i) 使用绿色LED进行30次全视野闪光刺激，每次刺激持续2秒开启、2秒关闭，光强为5 lm/m2；(ii) 关闭绿色LED，记录约相同时间尺度下的视网膜自发活动，持续120秒；(iii) 1组或以上谷氨酸注射，每组包含30次注射，压力为0.1 psi，注射时间为10–30毫秒（每次注射体积约为100–300 pL），脉冲间间隔为3秒。若进行多点注射，可选择2个或以上端口同时注射；(iv) 记录90秒的自发活动。
  3. 完成刺激文件后，点击“Stop”按钮停止记录，保存文件以供后续进行峰电位分选和数据分析（示例见图10）。

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图10：视觉、自发及谷氨酸反应的刺激前后直方图。 (A) 来自图9A中部分电极的脉冲数据的代表性刺激前后直方图（30 ms时间窗），该图对20次绿色LED光刺激实验的记录结果进行了平均。所有电极均采用相同的脉冲频率标度，显示在左侧y轴上。每个电极图中的黑线表示在绿色LED开启后第一秒内记录到的所有脉冲的平均脉冲频率。可以看出，除中心上方电极表现出短暂的抑制性反应外，其余电极在视觉刺激下均出现短暂的兴奋性脉冲频率反应。(B) 在无任何视觉或化学刺激条件下，相同电极记录到的平均自发脉冲频率反应。在无刺激情况下，各电极的脉冲频率相对稳定。(C) 在中央电极上方位置注射谷氨酸后，相同电极记录到的平均脉冲频率反应。唯一明显的短暂反应是位于注射位点正下方电极的兴奋性反应。请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

尽管光感受器丢失导致了显著的细胞重构，本方案仍可用于化学刺激正常的野生型视网膜以及光感受器退变的视网膜。在开始使用光感受器退变或野生型视网膜进行实验之前，需要准备好记录和刺激设备（图1 和 图2），并清洁平面多电极阵列（pMEA）（图5），以尽量减少每个电极通道的噪声（图6）。尽管光感受器退变的视网膜比野生型视网膜更薄，因而更为脆弱，但两者均采用相同的解剖步骤（图4）。解剖完成后，将视网膜小心地放置在pMEA上，使节细胞层朝向电极，并将pMEA固定在MEA放大器内（图3A），随后可从上方（图3B）和下方（图3C

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讨论

本文介绍了一种独特的神经刺激范式，其中视网膜神经元通过在体外将内源性神经递质化学物质注入视网膜亚表层进行化学刺激。in vitro。与传统的电刺激技术相比，这种化学刺激技术具有多项优势，包括对目标神经元的选择性和高度局灶特异性。上述方案详细描述了如何使用单通道玻璃微移液管或定制的多通道微流控装置，向目标视网膜神经元附近进行小体积的气动注射谷氨酸神经递质，从而引发具有生理意义的视网膜神经节细胞（RGC）反应。尽管本方案仅以谷氨酸为例进行演示，但该方法同样适用于研究其他类型神经递质对视网膜的化学刺激。此外，虽然本方案建议使用穿孔微电极阵列（pMEA）进行电生理记录32，但其他类型的微电极阵列（MEA）设计（包括非穿孔型）也可用于获得与pMEA相似的结果。在接下来的段落中，我们将讨论本方案中最关键的步骤、常见问题的解决方法，以及该刺激技术的局限性和未来应用前景。

为了获得安全可靠的化学刺激，本方案中必须完成几个关键步骤。其中一个关键步骤是通过仔细分离视网膜并尽量减少其置于含氧Ames培养基外的时间，以获得成功的视网膜制备。...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本论文所述工作由美国国家科学基金会前沿研究与创新（NSF-EFRI）项目资助，项目编号0938072。本文内容仅由作者负责，不代表美国国家科学基金会的官方观点。作者还感谢Samsoon Inayat博士在设计和测试化学刺激初始实验装置方面所做的工作，以及Ashwin Raghunathan先生在设计、加工和评估本研究中所用多通道微流控装置方面所做的贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
微电极阵列，穿孔布局Multi Channel Systems, GmbH60pMEA200/30iR-Ti-prhttp://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti
MEA放大器Multi Channel Systems, GmbHMEA1060-Invhttp://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv
pMEA用底部灌流接地板Multi Channel Systems, GmbHMEA1060-Inv-(BC)-PGPhttp://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp
三轴电动显微操作器Sutter Instruments, Novato, CAMP-285https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html
显微操作器控制系统Sutter Instruments, Novato, CAMPC-200https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html
龙门式带线性滑轨的显微操作器支架Sutter Instruments, Novato, CAMT-75/LShttps://www.sutter.com/STAGES/mt75.html
8通道可编程多通道压力注射仪OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ
供应商：Harvard Apparatus UK		PM-8000 或 PM-8OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm
供应商: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1
_HAUK_ProductDetail
Axopatch 200A 集成式膜片钳放大器Molecular Devices, Sunnyvale, CAAxopatch 200AAxopatch 200A 已被更新型号 Axopatch 200B 取代：
https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier
膜片钳前置放大头级Molecular Devices, Sunnyvale, CACV 201Ahttp://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage
真空废液套件ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NYVMKhttp://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/
移液管支架Warner Instruments, Hamden, CTQSW-A10Phttps://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915
预拉制玻璃微移液管（尖端直径 10 μm）World Precision Instruments, Sarasota, FLTIP10TW1https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/
变倍体视显微镜Nikon, Tokyo, JapanSMZ-745Thttps://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745
带双线性滚珠轴承臂的显微镜臂架Old School Industries, Inc., Dacono, COOS1010H-16BBhttp://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm
带C-LEDS混合LED支架的变倍体视显微镜Nikon, Tokyo, JapanSMZ-445https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445
倒置显微镜系统Nikon, Tokyo, JapanEclipse Ti-Ehttps://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E
Ames培养基Sigma-Aldrich, St. Louis, MOA1420http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420
L-谷氨酸（谷氨酸盐）Sigma-Aldrich, St. Louis, MOG5667http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291
碳酸氢钠Sigma-Aldrich, St. Louis, MOS8761http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761
60 mm 培养皿（高10 mm）Fischer Scientific, Waltham, MAFB0875713A60 mm 透明培养皿；https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a
珠宝商#5镊子World Precision Instruments, Sarasota, FL555227Fhttps://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/
标准手术刀片#24World Precision Instruments, Sarasota, FL500247https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/
手术刀柄#4World Precision Instruments, Sarasota, FL500237https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/
Vannas Tubingen解剖剪World Precision Instruments, Sarasota, FL503378https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/
尼龙网筛套件Warner Instruments, Hamden, CTNYL/MESHhttps://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173
Harp切片固定网格ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NYHSG-5ADhttp://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/
Ag/AgCl参比电极颗粒Multi Channel Systems, GmbHP1060http://www.multichannelsystems.com/products/p1060
4通道阀控重力灌流系统ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NYVC3-4xGhttp://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/
Zyla 5.5 sCMOS显微相机Andor Technology, Belfast, UKZyla 5.5 sCMOShttp://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos
银丝（直径 50 μm）Fischer Scientific, Waltham, MAAA44461G5https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5
Tygon微孔管（直径1.6 mm）Cole Parmer, Vernon Hills , ILEW-06419-01https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901
带钢制套管的倾斜工具支架ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NYTILTPORT各使用一个用于顶部灌流和抽吸；http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/
Roscolux #26 红色滤光片片材Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CTR2611制造商: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux
供应商: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html
Smith & Wesson Galaxy Red手电筒Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA4588制造商: https://www.smith-wesson.com/
供应商: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588
MC_Rack 软件Multi Channel Systems, GmbHMC_Rackhttp://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack
Labview 软件National Instruments, Austin, TXLabVIEWhttp://www.ni.com/labview/
NIS-Elements：基础研究软件Nikon, Tokyo, JapanNIS-Elements BRhttps://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research

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谷氨酸刺激视网膜神经节细胞微移液管注射多通道微流控装置穿孔式多电极阵列视网膜下腔注射光感受器退化视网膜仿生神经刺激玻璃微移液管技术
利用神经递质谷氨酸对大鼠视网膜进行仿生化学神经调节的方法学 体外
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