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方法文章

用博来霉素对小鼠气道进行预处理可提高原位肺癌细胞移植效率

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DOI：

10.3791/56650

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2018年6月28日

 ,  , 
1Department of Pathology, Yale University School of Medicine, 2Department of Medical Oncology, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们描述了一种通过预先对气道造成损伤以显著增强肺癌细胞在小鼠肺部原位移植效率的方法。该方法还可用于研究肺部微环境中的基质相互作用、肿瘤转移扩散、肺癌共病情况，以及更高效地建立患者来源的异种移植模型。

摘要

肺癌是一种致命且难以治疗的疾病，具有高度的生物学异质性。为了理解并有效治疗各种胸腔恶性肿瘤，需要建立更多能够模拟不同类型和阶段人类肺癌的动物模型。同系移植或异种移植模型具有较高的灵活性，可利用小鼠或人类来源的恶性细胞，在体内定量评估其致瘤能力in vivo。然而，以往报道的肺癌细胞移植方法通常在非生理部位（如小鼠的 flank 部位）进行，这是由于将细胞原位移植至肺部的效率较低所致。在本研究中，我们描述了一种通过使用诱导纤维化的试剂博来霉素（bleomycin）预先处理小鼠气道，以增强肺癌细胞原位移植效率的方法。作为概念验证实验，我们将该方法应用于将来源于小鼠或人类的肺腺癌亚型肿瘤细胞，移植至多种品系的小鼠体内。我们证明，在注射肿瘤细胞前使用博来霉素损伤气道，可使肿瘤细胞的移植成功率从 0–17% 提高至 71–100%。重要的是，该方法在不同模型和小鼠品系中均显著提高了肺部肿瘤的发生率及其后续生长。此外，移植的肺癌细胞可从肺部扩散至相关远端器官。因此，我们提供了一种实验方案，可用于在细胞数量或生物样本极其有限的情况下，建立和维持新型的肺癌原位模型，并在生理相关条件下对肺癌细胞的致瘤能力进行定量评估。

引言

肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因1。肺癌患者最终通常因肿瘤转移至远处器官而死亡，尤其是中枢神经系统、肝脏、肾上腺和骨骼2,3,4。胸部恶性肿瘤传统上被分为小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）5。NSCLC 是最常见的恶性肿瘤类型，可进一步分为不同的组织学亚型，包括肺腺癌（LUAD）和肺鳞状细胞癌（LUSC）6。对切除的人类原发性肺癌进行基因组分析发现，同一组织学类型的肿瘤也可能表现出多种不同的分子异常，这进一步导致其临床进展的差异性，并使患者的预后评估变得复杂。肺癌显著的异质性给合理设计、临床前测试以及有效治疗策略的实施带来了重大挑战。因此，有必要拓展可操作的实验性肺癌模型体系，以研究该疾病多样化的细胞起源、分子亚型及不同发展阶段。

已采用多种动物模型研究肺癌 体内，每种方法都有其独特的优缺点，具体选择取决于所研究的生物学问题。基因工程小鼠模型（GEMMs）可针对特定的前体细胞类型引入精确的遗传改变，从而在免疫功能健全的宿主体内诱导肿瘤发生与发展7尽管GEMM具有极强的功能和重要的临床相关性，但其潜伏期、变异性以及与肺部肿瘤相关的发病率可能会限制对某些定量指标的测量，并阻碍对远端器官中晚期转移的检测8另一种补充性方法是使用同种异体移植模型，即将直接来源于小鼠肿瘤或先在体外培养中建立的稳定细胞系的肺癌细胞重新引入同源宿主。类似地，肺癌异种移植模型则来源于人源细胞系或患者来源的肿瘤组织。人源细胞系异种移植模型或患者来源异种移植模型（PDXs）通常在免疫缺陷小鼠中维持传代，因此无法实现完整的免疫监视。9尽管存在这一缺点，它们仍为扩增有限的人体生物样本并研究基本的 体内 人类癌细胞的特性，其基因组异常比GEMM肿瘤更为复杂。

同种异体移植物和异种移植物的一个有用特性是，它们适用于传统的有限稀释细胞实验，该实验可用于量化恶性细胞群体中肿瘤起始细胞（TICs）的频率10。在这些实验中，将确定数量的细胞皮下注射到动物的侧 flank 部位，然后根据成瘤率来估算 TICs 的频率。然而，皮下肿瘤可能缺氧程度更高11，且可能无法模拟肺部肿瘤微环境中的关键生理限制。将上皮干细胞或前体细胞经气管递送至小鼠肺部，是一种研究肺再生和气道干细胞生物学的方法12。然而，该技术的移植率通常相对较低，除非肺部事先经历某种生理性的损伤，例如病毒感染13,14。炎性间质细胞的支持作用和/或肺基底膜的破坏，可能有助于提高移植细胞在远端气道相关干细胞生态位中的滞留能力15。纤维化诱导剂也可预先处理肺组织，以增强诱导性多能干细胞16和间充质干细胞17的移植效率。目前尚未系统评估类似的气道损伤是否会影响肺癌细胞的移植率、肿瘤起始能力及其后续生长。

本研究中，我们描述了一种通过预先对小鼠肺部造成损伤以提高原位肺癌细胞移植效率的方法。肺腺癌（LUAD）起源于远端气道，其中相当一部分肿瘤会形成纤维化间质18，这通常与预后不良相关19。博来霉素（Bleomycin）是一种天然的非核糖体杂合肽-聚酮化合物，已被广泛用于在小鼠中诱导肺纤维化20。气道内给予博来霉素首先会促进肺泡上皮的剥脱以及巨噬细胞、中性粒细胞和单核细胞等炎性细胞的募集21。随后发生远端气道的组织重塑、基底膜重排22,23以及细胞外基质（ECM）沉积24。单次注射博来霉素的作用是暂时的，在大多数研究中，纤维化会在30天后逐渐消退25。我们利用同种移植和异种移植模型，检测了预先用博来霉素处理小鼠气道是否能显著提高LUAD细胞在肺部的成瘤率。

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方案

所有实验均依照耶鲁大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行。

1. 试剂的准备与配制。

  1. 博来霉素
    注意：根据化学品分类和标签全球协调制度（GHS），博来霉素被归类为GHS08健康危害物质。
    1. 在化学通风橱中配制博来霉素。将15 U溶解于5 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中。
    2. 将100–200 µL溶液分装至玻璃小瓶中，于–20 °C冷冻保存以备后续使用。用重悬日期正确标记试管，并在该日期起6个月内使用。
      注意：每种小鼠品系对博来霉素的敏感性不同26建议针对每种小鼠品系测试不同的博来霉素剂量。代表性实验中使用的小鼠品系及其对应的博来霉素剂量列于 表1.
  2. 小鼠
    1. 购买实验所需小鼠，注射前让小鼠适应环境7天。在生物安全柜中进行灌注操作。在博来霉素灌注前，按照本机构标准操作程序，将饲养于非符合BSL2标准房间内的动物转移至符合BSL2标准的房间。小鼠在6至8周龄时进行注射。
      注意：根据机构对有害制剂、生物安全二级（BSL2）以及IACUC批准的规定进行小鼠注射。
      注意：代表性实验所用小鼠的购买信息列于下文 材料表仅使用了雄性小鼠。
  3. 肺癌细胞系
    1. 在各自的培养基中培养目标细胞系。注射前，进行短串联重复序列DNA分析或基因检测，以确保细胞系鉴定无误。为便于 体内 和 离体 成像，用表达胸苷激酶、绿色荧光蛋白（GFP）和荧光素酶融合报告基因的慢病毒感染细胞系27，并在移植前通过荧光激活细胞分选（FACS）筛选报告基因阳性细胞。每6个月对细胞系进行一次支原体检测。
      1. 按照制造商建议，使用含10%胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素和两性霉素B的RPMI培养基培养H2030人癌细胞系。
      2. 培养368T1小鼠细胞系（源自一种 KrasG12Dp53-/- 使用含10%胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素和两性霉素B的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）培养小鼠细胞。
      3. 使用含10%胎牛血清、青霉素-链霉素和两性霉素B的RPMI培养基培养PC9人癌细胞系。

2. 博来霉素处理

  1. 计划在肿瘤细胞移植前14天对小鼠进行气管内注射博来霉素。
  2. 注射前2小时将博来霉素储备液置于冰上解冻。
  3. 解冻后，将博来霉素稀释至所需的工作浓度（0.02 U/50 µL 或 0.005 U/50 µL），并保持在冰上。
    注意：博来霉素的浓度取决于实验所用的小鼠品系（表1）。应在小鼠中进行博来霉素剂量滴定，以确定最佳剂量。
  4. 通过将氯胺酮和赛拉嗪分别稀释至终浓度为10 mg/mL和1 mg/mL来配制麻醉剂。使用1 mL注射器和27 G针头，按氯胺酮/赛拉嗪100/10 mg/kg的剂量对每只小鼠进行腹腔注射麻醉。
  5. 监测小鼠呼吸，并进行足趾夹捏测试。当小鼠对足趾夹捏无反应时，确认麻醉成功。在麻醉期间，向眼睛涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。
  6. 每次将一只小鼠放置于插管平台上，使其前牙悬挂于平台边缘，背部紧贴平台。
  7. 使用光纤光源照射小鼠上胸部，以帮助可视化气管。打开小鼠口腔，并用无菌平头镊子轻轻拉出舌头。
  8. 使用无针头的静脉导管以避免阻塞呼吸。将导管置于气管开口处发出的白光上方。
  9. 将导管插入气管，直至导管顶端到达前牙处。通过观察导管在口腔内开口处透出的白光，确认导管正确位于气管内。
  10. 使用移液器将50 µL博来霉素或对照溶剂（PBS）直接注入导管中，确保全部液体被吸入。此步骤需在无菌条件下进行。
  11. 若导管插入正确，小鼠将立即吸入导管内的液体。等待数秒，直至全部液体通过导管进入体内。随后将导管从气管中取出，并丢弃至10%次氯酸钠溶液中。
    注意：步骤2.7–2.11每只小鼠平均耗时约5分钟。
  12. 若小鼠未吸入液体，应密切观察其呼吸，并调整导管位置。若小鼠呼吸停止，应立即移除导管，待其恢复正常呼吸后再重新插入。
  13. 将注射后的小鼠仰卧置于经IACUC批准的加热垫上，在平坦表面上进行恢复。整个操作过程每只小鼠约需10分钟。在动物完全恢复前，不得将其放回与其他动物共同饲养的笼具中。
  14. 在笼具上放置一张"正在使用危险化学品"警示卡，持续24小时。

3. 气管插管后小鼠的监测

  1. 插管后立即监测小鼠的呼吸窘迫情况，之后每15分钟监测一次，直至小鼠从麻醉中苏醒。在小鼠恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得离开无人看管。
  2. 通过腹腔注射酮洛芬（5 mg/kg）以缓解疼痛。
  3. 在插管后24小时及之后每周三次检查小鼠是否有任何发病迹象。
  4. 记录操作日期、动物编号、操作类型、麻醉剂类型以及术后监测观察结果及对应时间。
  5. 博来霉素注射后，每两周监测一次小鼠的体重减轻、呼吸窘迫、行为异常以及体况评分 <2（脊柱分节明显/背侧骨盆骨骼可触及）的情况。
  6. 对出现呼吸窘迫或体重减轻达15%的小鼠，采用CO2或氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉后进行颈椎脱位实施安乐死。通过触诊呼吸活动确认动物死亡。

4. 肺腺癌细胞系的移植。

注意：在注射博来霉素后14天进行细胞移植（步骤2.1）。

  1. 按照步骤1.3所述的相应培养基，在注射前一天将细胞在75 cm2培养瓶中静置培养3天。
    注意：注射当天细胞应达到80%融合度（根据细胞系不同，每瓶约含2-3 × 106个细胞）。
  2. 用5 mL室温PBS洗涤生长在75 cm2培养瓶中的细胞。
  3. 吸除PBS，向细胞中加入1.5 mL胰蛋白酶，并在37 °C孵育，直至细胞脱落（通常为2-5分钟）。
    注意：建议每2分钟通过直接观察培养瓶底部或在光学显微镜下检查一次细胞脱落情况。胰蛋白酶孵育时间不得超过5分钟。
  4. 加入含10%胎牛血清（FBS）的培养基4 mL以中和胰蛋白酶（使用与步骤4.1相同的培养基）。将细胞收集至15 mL离心管中，在室温下以200 × g离心3分钟。
  5. 吸除上清液，用5 mL PBS重悬细胞沉淀以洗涤细胞。在室温下以200 × g离心3分钟使细胞成团。重复此步骤1次。
  6. 吸除PBS，按每瓶加入1.5 mL PBS重悬细胞沉淀。
  7. 取50 µL细胞悬液与50 µL台盼蓝混合，使用细胞计数器/血细胞计数板28进行细胞计数。
  8. 用PBS稀释细胞，制备细胞悬液，使每只小鼠注射体积为50 µL，含1 × 105个细胞（或其他指定数量）。注射前将细胞置于冰上保存。
    注意：为避免细胞悬液不足，建议准备至少两倍于所需量的细胞。
  9. 将氯胺酮和赛拉嗪稀释至终浓度分别为10 mg/mL和1 mg/mL，以配制麻醉剂。使用1 mL注射器和27 G针头，按100/10 mg/kg剂量对每只小鼠进行腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪溶液以实施麻醉。
  10. 监测小鼠呼吸，并进行足趾夹捏测试。当小鼠对足趾夹捏无反应时，确认已充分麻醉。在麻醉期间于眼部涂抹兽用眼膏，防止角膜干燥。
  11. 每次将一只小鼠放置于插管平台，使其前牙钩住平台前端，背部紧贴平台。
  12. 使用光纤光源照射小鼠上胸部，以帮助可视化气管位置。
  13. 用P200移液器轻轻重悬细胞，确保细胞不形成团块。打开小鼠口腔，用无菌平头镊子轻轻拉出舌头。
  14. 使用已去除针头的静脉导管，以避免阻塞呼吸。将导管置于气管开口处发出的白光上方。
  15. 将导管插入气管，直至导管顶端到达前牙位置。通过观察导管在口腔内开口处透出的白光，确认导管正确置于气管中。
  16. 使用移液器将50 µL细胞悬液直接注入导管内，确保全部液体被吸入。此操作需在无菌条件下进行。
    注意：若导管插入正确，小鼠会立即吸入导管内容物。
  17. 等待数秒，待全部液体通过导管进入体内后，将导管从气管中取出，并丢弃至10%次氯酸钠溶液中。
  18. 若小鼠未吸入液体，应密切观察其呼吸并调整导管位置。若小鼠停止呼吸，应立即取出导管，待其恢复正常呼吸后再重新插入。
    注意：步骤4.11至4.18每只小鼠平均耗时约5分钟。
  19. 将注射后的小鼠仰卧置于经IACUC批准的加热垫上，在平坦表面上进行恢复。
    注意：整个操作过程每只小鼠约需10分钟。在小鼠完全恢复前，不得将其放回与其他动物同笼饲养。
  20. 成像前，使用电动剃须刀剃除B6129SF1/J及其他深色毛发小鼠品系的整个肋区（腹侧和背侧）毛发。
  21. 细胞注射后2-3分钟，使用胰岛素针头经眶后静脉注射100 µL荧光素（15 mg/mL）。每次成像时交替使用不同眼睛进行注射。
  22. 至少等待2分钟后，将最多5只小鼠以仰卧位放入动物活体生物发光成像仪中，使用发光设置获取腹面图像29。
  23. 在控制面板中调整分辨率和灵敏度设置，以检测特定细胞系的发光信号。大多数应用可从以下参数开始：曝光时间3分钟（或若信号饱和则设为"自动"），binning=中等（4），F值=1，视野=D，样本高度=1.50。
    注意：若注射成功，可在上胸部区域、单侧肺或双侧肺检测到发光信号。
  24. 将小鼠翻转为俯卧位，按上述方法获取背面图像。
    注意：若细胞注射操作不当，细胞可能聚集在气管入口或颈部区域。
  25. 腹腔注射酮洛芬5 mg/kg以缓解疼痛。
  26. 将小鼠放回笼中，并在笼上放置一张"正在使用BSL-2级病原体"警示卡。
  27. 插管后立即监测小鼠是否出现呼吸窘迫，之后每15分钟监测一次，直至小鼠从麻醉中苏醒。在小鼠恢复足够意识以维持俯卧姿势前，不得无人看管。
  28. 插管后24小时及之后每周三次检查小鼠是否有任何发病迹象。
  29. 在实验记录本中记录操作日期、动物编号、操作类型、麻醉剂种类以及术后监测观察结果和时间。
  30. 博来霉素接种后，每两周监测一次小鼠体重减轻、呼吸窘迫、行为异常及体况评分<2的情况（可见脊柱分节、可触及背侧骨盆骨骼）。
    注意：患有肺肿瘤的小鼠可能出现呼吸刺激症状、体重减轻、恶病质和/或死亡。
  31. 对于出现呼吸窘迫或体重减轻达15%的小鼠，采用CO2安乐死，或使用氯胺酮/赛拉嗪麻醉后行颈椎脱臼法处死（如需采集组织）。通过触诊呼吸活动确认动物死亡。

5. 利用生物发光成像监测肿瘤生长

  1. 在移植后第3天及之后每周重复对小鼠进行成像。
  2. 通过注射氯胺酮/赛拉嗪（如步骤2.4–2.5所述）或吸入异氟烷（2%）对小鼠进行麻醉。监测小鼠呼吸，并通过脚趾夹捏测试确认麻醉效果。在麻醉期间，于眼睛上涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。
  3. 使用电动剃毛器，在成像前将B6129SF1/J及其他深色毛发小鼠品系的整个肋骨区域（腹侧和背侧）剃毛。
  4. 待小鼠进入麻醉状态后，使用胰岛素针头经眶后静脉注射100 µL荧光素（15 mg/mL）。等待2分钟。每次成像时交替使用另一侧眼睛进行注射。
  5. 将小鼠放入成像仪中，并按照步骤4.22–4.24所述获取背侧和腹侧图像。
  6. 成像完成后，将小鼠放回笼中，仰卧于平坦表面上以利于恢复。
    注意：每组5只小鼠的操作全过程约需5分钟。在小鼠恢复至能够自主维持胸卧位意识状态前，不得无人看护。
  7. 使用成像仪或生物发光分析软件对图像进行分析。
    1. 选择适当的图像，并在生物发光分析软件中将其作为一组加载。
    2. 点击 ROI工具 | 方形 添加方形感兴趣区域（ROI）。将ROI置于胸部上方区域，覆盖整个肺部影像。对每只小鼠的图像重复此操作。
    3. 右键单击并选择 复制所有ROI 功能，将相同的ROI应用到该组所有图像上，并将其定位在每只小鼠的上胸部区域（包括腹侧和背侧视图）。
    4. 在图像窗口的左上角，选择 光子 功能。点击 测量 控制面板功能以测量各ROI。将包含总通量（光子数/秒）的输出表格复制并粘贴至所选软件中，以便进一步分析数据。
    5. 将每只小鼠每日的ROI值归一化为其第0天测得的ROI值。

6. 组织分离与处理。

  1. 通过注射氯胺酮/赛拉嗪（如步骤 2.4-2.5 所述）或吸入异氟烷（2%）对小鼠进行麻醉。监测小鼠呼吸，并进行足趾夹捏测试。当小鼠对足趾夹捏无反应时，确认麻醉成功。在麻醉期间，于眼睛上涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。
  2. 使用胰岛素针头经眼眶后静脉注射 100 µL 荧光素（15 mg/mL）。等待 2 分钟。
  3. 按照本实验方案的步骤 4.22-4.24 对小鼠进行成像。
  4. 在实施安乐死前，使用胰岛素针头向另一只眼眶后再次注射 100 µL 荧光素。
  5. 通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪（详见步骤 2.4）对小鼠实施安乐死，若小鼠已处于深度麻醉状态，则按照 IACUC 提供的指南进行颈椎脱位。通过触诊呼吸活动确认动物死亡。
  6. 使用无菌手术剪在胸骨下方做皮肤切口。用镊子和手术剪沿膈肌打开肌层，并从身体两侧剪开肋骨，暴露胸腔，注意避开内胸动脉。
  7. 在心脏右心房做一小切口，通过左心室注入 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）进行灌注。若灌注充分，肺组织颜色将由红色变为淡粉白色。
  8. 用镊子夹住食管或心脏，小心地将肺组织从胸腔中取出。轻柔牵拉组织，并使用手术剪小心剪断连接组织，避免刺破肺组织。尽可能保留气管，以便后续步骤中对肺气道进行充气。
  9. 将肺组织浸入含 3 mL PBS 的 6 孔板中，轻轻晃动 3 次，以去除多余血液。
  10. 将肺组织置于 6 孔板盖上，将带有组织的板盖放入生物发光成像仪中，获取发光图像30。
    注意：我们建议在"采集控制面板"中选择以下设置："视野=A" 和 "样本高度=0.75 cm"，然后使用"自动曝光"，以避免图像饱和。
  11. 切除并成像其他器官（如步骤 6.9-6.10 所述），这些器官中可通过生物发光检测到转移灶，例如脑、肝、肾上腺、骨、淋巴结、肾或脾31。
  12. 将针头插入小鼠气管，灌注 1 mL 4% 多聚甲醛。若灌注良好，肺将膨胀。
    警示：4% 多聚甲醛具有毒性，属于健康危害物质，GHS07 和 GHS08。
  13. 将肺组织转移至含有 5 mL 4% 多聚甲醛的 15 mL 锥形管中。
  14. 将组织置于含 4% 多聚甲醛的溶液中，在 4 °C 条件下于摇床上以 30–50 rpm 转速孵育过夜，以固定肺或其他组织。
  15. 根据应用需求，将肺（或其他组织）包埋于石蜡或最佳切割温度包埋剂（OCT）中32。
    注意：石蜡包埋是保存肺结构以及进行马松三色染色和苏木精-伊红染色的首选方法。

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结果

为了提高肺腺癌细胞在小鼠肺部的移植效率，我们建立了一种先使用博来霉素预处理气道，再进行原位肿瘤细胞注射的实验方案（图1）。我们证实，即使在免疫缺陷的无胸腺小鼠中，博来霉素在给药后第14天仍可诱导短暂性纤维化，表现为气道结构破坏和胶原沉积增加（图2）。在博来霉素注射后50天，这些小鼠的宏观纤维化已消退（图2；右侧面板），与先前的研究结果一致24。

基于这些观察结果，我们将不同来源的肺腺癌（LUAD）细胞移植到经预处理的小鼠品系肺部，这些小鼠在14天前预先接受了一次性剂量的载体或博来霉素处理。例如，将来自已建立的人肺腺癌细胞系H2030的细胞悬液经气管内注入无胸腺小鼠的肺部。35天后，经博来霉素预处理的小鼠表现出较高的肺部肿瘤负荷，...

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讨论

肺癌与其他慢性肺部疾病之间已观察到显著的临床相似性36。特别是，特发性肺纤维化（IPF）患者更易发生肺癌，且这种关联性与吸烟史无关37,38。IPF 的特征是通过细胞外基质（ECM）沉积导致肺组织结构进行性破坏和呼吸功能受损39。此外，伴有 IPF 的早期非小细胞肺癌（NSCLC）患者在接受手术切除后预后较差40。大多数 NSCLC 肿瘤在诊断时即含有纤维化成分，且这种间质反应的程度与不良预后相关18。纤维化引起的急性或持续性组织损伤可能通过多种机制增加肿瘤发生的风险。例如，损伤后上皮再生过程可能扩大易发生恶性转化的前体细胞池。此外，多种免疫细胞的浸润及其功能改变可能有助于形成免疫抑制的微环境，而肌成纤维细胞的活化可能分泌生长因子或沉积促进肿瘤的细胞外基质。因此，我们采用致纤维化试剂预先处理肺组织的方法，可能特别适用于研究肺癌共病（...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本研究由美国国家癌症研究所（资助号：R01CA166376 和 R01CA191489，授予 D.X. Nguyen）和美国国防部（资助号：W81XWH-16-1-0227，授予 D.X. Nguyen）的基金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
博来霉素SigmaB5507-15UN注意 健康危害 GHS08
Exel 导管 24GFisher1484121移除针头。用于气管内注射
氯胺酮（Ketaset 注射液 100 mg/mL C3N 10 mL）Butler Schein56344用于小鼠麻醉
赛拉嗪Butler Schein33198用于小鼠麻醉
酮洛芬，5,000 mgCayman Chemical10006661镇痛剂
Puralube 兽用眼科软膏BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC8897防止麻醉期间眼睛干涩
D-荧光素粉末Perkin Elmer Health Sciences Inc122799用于发光成像。用 PBS 重悬粉末至工作浓度 15 mg/mL。避光保存
啮齿类动物插管架Braintree ScientificRIS-100推荐用于气管内注射的支架
MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150DOLAN-JENNER INDUSTRIESMI-150 / EEG2823M用于照亮并可视化气管
Graefe 镊子，2.75（7 cm）长锯齿RobozRS-5111用于气管内注射
鲁尔锁式无菌注射器 5 mLBD / Fisher309646
Conair Satiny Smooth 双刀网膜式可充电剃须刀（湿/干两用）Conair-用于剃除小鼠体毛
Bonn 剪刀，3.5" 直头 15 mm 锐/锐安全刀刃RobozRS-5840SC
15 mL 锥形管BD / Fisher352097
1.5 mL 离心管USA SCIENTIFIC INC1615-5500
7 mL 硼硅酸盐玻璃闪烁瓶 GPIFisher701350
滤芯移液器吸头（200 μL）USA SCIENTIFIC INC1120-8710
磷酸盐缓冲液Life Technologies14190-144
0.25% 胰蛋白酶-EDTALife Technologies25200-056
DMEM 高糖培养基Life Technologies11965-092
RPMI 1640 培养基Life Technologies11875-093
胎牛血清 USDALife Technologies10437-028
青霉素-链霉素Life Technologies15140-122
两性霉素 BSigmaA2942-20ML
台盼蓝染色液 0.4%Life Technologies15250-061
Countess 自动细胞计数仪Life TechnologiesAMQAX1000
细胞培养瓶 T/C 75 cm² 倾斜颈，蓝色瓶盖Fisher / Corning353135
IVIS Spectrum Xenogen 生物发光成像系统Perkin Elmer Health Sciences Inc124262用于 in vivo 生物发光成像
Living Image 软件Perkin Elmer Health Sciences Inc128113用于 in vivo 生物发光分析
XGI-8 气体麻醉系统Perkin Elmer Health Sciences Inc118918用于异氟烷麻醉
BD Ultra-Fine II 短针胰岛素注射器 1 cc，31 G × 8 mm（5/16 英寸）BD / FisherBD328418用于眶后静脉窦荧光素注射
1 mL 注射器BD / Fisher14-823-434用于腹腔注射
26 G × 1/2 英寸针头BD / Fisher305111用于腹腔注射
4% 多聚甲醛VWR43368-9M注意 健康危害 GHS07, GHS08。用于组织固定
Pipet-Lite 移液器，通用型 SL-200XLS+METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL17014411
Mayer 苏木精染液ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES517-28-2
伊红 Y 染液 0.25%（w/v）溶于 57%Fisher67-63-0
Masson 三色染色试剂盒IMEB IncK7228用于 Masson 三色染色以显示胶原纤维
Superfrost Plus 玻片Fisher1255015
6 孔板CorningC3516
通用支原体检测试剂盒ATCC30-1012K
OCT 包埋剂ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES62550-12用于冷冻切片的组织包埋
Leica CM3050 S 研究型冷冻切片机LeicaCM3050 S用于组织切片以进行染色分析
Keyence 一体式荧光显微镜KeyenceBZ-X700
ImageJ美国国立卫生研究院IJ1.46http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 for Mac OS XGraphPad Software, Inc.-
裸鼠（Crl:NU(NCr)-Foxn1nu）Charles RiverNIH-553
NSG 小鼠（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ）Jackson Laboratories5557
B6129SF1/J 小鼠Jackson Laboratories101043
NIH-H2030 细胞ATCCCRL-5914
368T1由 Monte Winslow（斯坦福大学）慷慨提供-
PC9 细胞Nguyen DX 等. Cell. 2009;138:51–62-
H2030 BrM3 细胞Nguyen DX 等. Cell. 2009;138:51–62-

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