方法文章

博莱霉素对小鼠气管的预处理提高原位肺癌细胞植入的效率

DOI：

10.3791/56650

⸱

2018年6月28日

 ,  , 
1Department of Pathology, Yale University School of Medicine, 2Department of Medical Oncology, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍一种通过对气道损伤进行预适应来显著提高肺癌细胞原位植入的方法。这种方法也可以应用于研究肺微环境中的间质相互作用, 转移传播, 肺癌的共同发病, 并更有效地产生病人的移植。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肺癌是一种致命的治疗顽固性疾病, 是生物异构的。为了了解和有效地治疗胸恶性肿瘤的完整临床谱, 需要额外的动物模型来重述不同的人肺癌亚型和分期。同种异体或异种移植模型是多种多样的, 可以利用小鼠或人类的恶性细胞,在体内癌变能力的量化。然而, 以前所描述的肺癌细胞植入的方法已经在非生理部位进行, 如小鼠的侧面, 由于细胞移植到肺部的效率低下。在本研究中, 我们描述了一种通过对小鼠肺纤维化诱发博莱霉素进行预调节来增强原位肺癌细胞植入的方法。作为一种概念验证实验, 我们将这种方法应用于从老鼠或人源获得的肺腺癌亚型的嫁接肿瘤细胞, 并将其转化为不同品系的小鼠。我们证明, 在肿瘤细胞注射前, 与博莱霉素的呼吸道损伤增加了肿瘤细胞从0-17% 到71-100% 的植入。显著地, 该方法通过不同模型和小鼠菌株增强肺肿瘤发生率和后续生长。此外, 嫁接肺癌细胞从肺部传播到相关的远端器官。因此, 我们提供了一个协议, 可用于建立和维持新的肺癌原位模型, 限制数量的细胞或 biospecimen, 并定量评估肺癌细胞在生理相关设置的癌变能力.

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肺癌是全球1癌症相关死亡的主要原因。肺癌患者最终从转移到远端器官, 主要是中枢神经系统, 肝脏, 肾上腺, 骨骼2,3,4。胸恶性肿瘤历来被归类为小细胞肺癌或非小细胞肺癌 (NSCLC)5。NSCLC 是最常见的恶性肿瘤, 可分为不同的组织学亚型, 包括肺腺癌 (LUAD) 和肺鳞状细胞癌 (LUSC)6。经手术切除的人原发性肺癌的基因组分析显示, 某一 histotype 内的肿瘤也能表达多种分子扰动, 进一步促进其临床进展和混淆患者预后。肺癌的显著异质性对合理的设计、临床前试验和有效的治疗策略的实施都是一个重大挑战。因此, 有必要扩大可听话的实验性肺癌模型的汇辑, 以研究这种疾病的不同细胞来源、分子亚型和分期。

使用动物模型的各种方法在体内研究肺癌, 每个都有各自的优缺点, 这取决于所关心的生物学问题。基因工程小鼠模型 (GEMMs) 可以针对特定祖细胞类型的特异基因改变, 导致肿瘤在免疫宿主7中取得进展。虽然非常强大和临床相关的, 潜伏期, 变异性和/或肺部肿瘤发病率与 GEMMs 可能会禁止某些定量测量和检测晚期转移在遥远的器官8。一个补充的方法是使用同种异体模型, 藉以肺癌细胞从老鼠肿瘤直接获得或首先被获取作为建立的细胞线在文化中被重新介绍入自体寄主。类似, 肺癌移植是由人体细胞系或病人衍生的肿瘤样本建立的。人细胞系移植或患者衍生的移植 (PDXs) 一般维持在免疫缺陷小鼠, 因此排除完全免疫监测9。尽管有这个缺点, 它们提供了一个途径来传播限制数量的人类 biospecimens 和研究人类癌细胞的基本的体内性质, 这编码为更复杂的基因组畸变比 GEMM 肿瘤。

同种异体移植和异种移植的一个有用的特性是, 他们可以使用传统的限制性细胞稀释方法, 用于量化10恶性细胞中肿瘤起始细胞 (抽搐) 的频率。在这些实验中, 在动物的侧面注入了一定数量的细胞, 并根据肿瘤的发生率来估计抽搐频率。然而皮下肿瘤可以是更低氧11并且可能不模型主要生理制约肺肿瘤微环境。气管内向小鼠肺内输送上皮干细胞或祖细胞是研究肺再生和气道干细胞生物学12的方法。然而, 这种技术的植入率可能相对较低, 除非肺部首先受到生理形式的伤害, 如病毒感染13,14。炎症基质细胞的支持和 (或) 肺基底膜的破坏, 可改善移植细胞在远端气道15的相关干细胞龛位的保留。纤维化诱导剂也可以预条件肺, 以增强植入诱导多能细胞16和间充质干细胞17。类似的气道损伤形式是否会影响植入率, 肿瘤的启动能力和肺癌细胞的产生还有待系统地评估。

本文通过对损伤小鼠肺的预处理, 描述了提高原位肺癌细胞植入效率的方法。LUAD 出现在远端呼吸道与这些癌症的一个重要的子集发展纤维间质基质18 , 往往与不良预后19。博莱霉素是一种天然非核糖体杂交肽-聚酮体, 已广泛用于诱导小鼠肺纤维化20。博莱霉素的气道灌注首先促进肺泡上皮的磨损和炎症细胞的招募, 包括巨噬细胞、中性粒细胞和单核细胞21。其次是在远端呼吸道组织重塑, 基底膜重组22,23和细胞外基质 (ECM) 沉积24。单个博莱霉素注射液的影响是瞬变的, 在大多数研究中30天后纤维化解决25。利用同种异体移植和异种移植模型, 我们对博莱霉素小鼠呼吸道进行预适应试验, 可以显著提高肺 LUAD 细胞的服用率。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有实验都是按照耶鲁大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准的协议进行的。

1. 试剂的设置/准备。

  1. 博莱 霉 素
    注意: 根据全球统一的化学品分类和标签制度, 博莱霉素被归类为 GHS08 的健康危害。
    1. 用化学罩准备博莱霉素。并用重悬 15 U 入5毫升无菌磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。
    2. 整除100-200 µL 的溶液成玻璃瓶, 并冻结在-20 摄氏度, 以供将来使用。用泥沙的日期正确地标注管子。从该日期起6月内使用。
      注意: 每个鼠标的应变对博莱霉素26有不同的敏感性。建议对不同剂量的博莱霉素进行小鼠菌株的检测。表 1列出了在代表性实验中使用的鼠株和博莱霉素的相应剂量。
  2. 小 鼠
    1. 购买实验所需的小鼠, 并允许老鼠在注射前7天适应。在生物安全罩中进行输液。在博莱霉素输液前使用标准的机构程序, 将动物安置在 non-BSL2 兼容的房间里, BSL2 房间。在6-8 周的年龄注射老鼠。
      警告: 在危险剂、生物安全等级 2 (BSL2) 和 IACUC 批准的机构指南下注射老鼠。
      注: 为代表性实验而购买的鼠标列在材料表中。只有雄性老鼠被使用。
  3. 肺癌细胞系
    1. 在各自的媒体中培养所需的细胞线。注射前, 进行短串联重复 DNA 分析或基因检测, 以确保正确的细胞线识别。为了促进体内和体外成像, 感染细胞系的慢病毒北疆表达胸苷激酶, 绿色荧光蛋白 (GFP) 和荧光素酶融合记者27, 并排序报告阳性细胞的荧光植入前的活化细胞分类。每6月支原体试验线。
      1. 培养 H2030 人类癌细胞系的建议, 制造商使用罗斯威尔公园纪念研究所培养基 (RPMI) 与10% 胎牛血清 (血清), 青霉素-链霉素, 和两性霉素 B。
      2. 培养368T1 小鼠细胞系 (从KrasG12D;p 53-/ 老鼠) 使用 Dulbecco 的改良鹰的培养基 (DMEM) 与10% 的血清, 青霉素-链霉素, 和两性霉素 B。
      3. PC9 人类癌细胞系的 RPMI, 采用10% 血清、青霉素-链霉素和两性霉素 B。

2. 博莱霉素治疗

  1. 计划在肿瘤细胞植入前14天注射博莱霉素 intratracheally 小鼠。
  2. 在注射前将博莱霉素在冰上解冻2小时。
  3. 解冻后, 将博莱霉素稀释至所需的工作浓度 (0.02 U/50 µL 或 0.005 U/50 µL), 并将其放在冰上。
    注: 博莱霉素浓度取决于实验用的小鼠应变 (表 1)。应进行小鼠博莱霉素滴定, 以确定最佳剂量。
  4. 用1毫升注射器和27克针, 通过将氯胺酮和甲苯噻嗪稀释到最终浓度10毫克/毫升和1毫克/毫升, 通过注射腹腔氯胺酮/甲苯噻嗪溶液在100/10 毫克/千克上麻醉每只老鼠, 以制备麻醉药。分别。
  5. 监测老鼠的呼吸, 并使用脚趾捏。确认正确的麻醉时, 鼠标不响应脚趾捏。在麻醉时, 应将兽医软膏涂抹于眼部, 以防干燥。
  6. 放置1鼠标在一个插管平台上, 通过挂在它的前牙与它的背部对平台。
  7. 用光纤照明灯照亮上胸部, 帮助可视化气管。张开鼠标的嘴, 用无菌的扁平钳轻轻地拉出舌头。
  8. 使用静脉导管没有针头, 以避免阻塞呼吸。将导管放置在从气管开口处发出的白色光线上。
  9. 将导管插入气管, 直到导管顶部到达前牙。通过在口腔内打开导管, 通过可视化白光照射, 确认导管在气管内的正确放置。
  10. 使用吸管, 50 µL 的博莱霉素或车辆 (PBS) 直接进入导管, 以确保整个体积被吸入。在无菌条件下执行此步骤。
  11. 如果导管正确插入, 鼠标将立即吸入导管的内容。等待几秒钟, 直到整个音量沿着导管移动。然后从气管取出导管, 在10% 漂白剂溶液中处理。
    注: 每个步骤 2.7-2.11 的鼠标平均时间约为5分钟。
  12. 如果鼠标不吸入液体, 仔细监测呼吸并调整导管位置。如果鼠标停止呼吸, 立即取出导管, 并允许鼠标在重新插入导管前正常恢复呼吸。
  13. 将注入的鼠标放在 IACUC 上的已批准的加热垫上, 然后放在平坦的表面上进行恢复。整个过程将采取每只鼠标10分钟。在完全恢复之前, 不要将已经注射到其他动物公司的动物退回。
  14. 将 "危险化学品使用" 卡放在笼子里24小时。

3. 在插管后监测小鼠

  1. 在插管后立即监测小鼠呼吸窘迫, 然后每15分钟, 直到老鼠从麻醉中醒来。不要让老鼠无人看管, 直到他们恢复足够的意识来维持胸骨卧床。
  2. 注射酮酮 (5 毫克/千克) 腹腔减轻疼痛。
  3. 检查小鼠 24 h 后插管和每周3次的任何发病率的迹象。
  4. 记录程序的日期、动物身份、程序类型、麻醉类型和术后监测观察时间。
  5. 监测小鼠的体重减轻, 呼吸窘迫, 行为异常, 身体状况评分 < 2 (椎柱明显/背骨盆骨分割) 双周后注射博莱霉素。
  6. 弄死小鼠在呼吸窘迫或小鼠经历了15% 的身体质量损失由 CO2或氯胺酮/甲苯噻嗪后, 颈椎脱位。通过对呼吸活动进行触诊确认安乐死。

4. 植入肺腺癌细胞系。

注: 在注射博莱霉素14天后进行细胞植入 (步骤 2.1)。

  1. 允许细胞生长在75厘米2瓶不受干扰的3天前的注射与相应的媒体, 如步骤1.3 所述。
    注: 在注射的当天, 它们应该是80% 汇合的 (在每个烧瓶中对应于 2-3 x 106 , 这取决于细胞线)。
  2. 用5毫升的 PBS 在室温下冲洗75厘米2烧瓶上生长的细胞。
  3. 吸入 PBS 和添加1.5 毫升胰蛋白酶到细胞和孵化细胞在37°c, 直到细胞分离 (通常2-5 分钟)。
    注: 我们建议每隔2分钟检查从塑料的细胞脱离, 通过简单的可视化烧瓶底部或在光显微镜下。不要超过5分钟的孵化与胰蛋白酶。
  4. 加入4毫升含有10% 种血清的培养基 (与步骤4.1 相同的培养基) 中和胰蛋白酶。将细胞收集成15毫升管, 在室温下将其离心在 200 x g 处3分钟。
  5. 在5毫升的 PBS 中吸入培养基并并用重悬细胞颗粒以洗涤细胞。在室温下将细胞以 200 x g 为3分钟, 在颗粒细胞中进行离心。重复这1次。
  6. 吸入 pbs 和并用重悬1.5 毫升的 pbs 每瓶。
  7. 将50µL 的细胞混合物与50µL 的台盼蓝混合, 用细胞计数器/Hemocytometer 室28计算细胞数。
  8. 通过稀释 PBS 中的细胞来制备细胞悬浮液, 在每只老鼠的50µL 中注射 1 x 105细胞 (或其他指示量)。在注射前把细胞放在冰上。
    注: 准备至少两次更多的细胞注射, 以避免耗尽细胞悬浮。
  9. 用1毫升注射器和27克针, 通过将氯胺酮和甲苯噻嗪稀释到最终浓度10毫克/毫升和1毫克/毫升, 通过注射腹腔氯胺酮/甲苯噻嗪溶液在100/10 毫克/千克上麻醉每只老鼠, 以制备麻醉药。分别。
  10. 监测老鼠的呼吸, 并使用脚趾捏。确认正确的麻醉时, 鼠标不响应脚趾捏。在麻醉时, 应将兽医软膏涂抹于眼部, 以防干燥。
  11. 放置1鼠标在一个插管平台上, 通过挂在它的前牙与它的背部对平台。
  12. 用光纤照明灯照亮上胸部, 帮助可视化气管。
  13. 用 p200 吸管轻轻地并用重悬细胞, 以确保它们不形成团簇。张开鼠标的嘴, 用无菌的扁平钳轻轻地拉出舌头。
  14. 使用静脉导管与针移除, 以避免阻塞呼吸。将导管放置在从气管开口处发出的白色光线上。
  15. 将导管插入气管, 直到导管顶部到达前牙。通过在口腔内打开导管, 通过可视化白光照射, 确认导管在气管内的正确放置。
  16. 使用吸管, 将50µL 的细胞直接放入导管中, 以确保整个体积被吸入。在无菌条件下执行此步骤。
    注: 如果导管正确插入, 鼠标将立即吸入导管的内容。
  17. 等待几秒钟, 直到整个音量沿着导管移动, 然后从气管中取出导管, 并在10% 漂白剂溶液中处理。
  18. 如果鼠标不吸入液体, 仔细监测呼吸并调整导管位置。如果鼠标停止呼吸, 立即取出导管, 并允许鼠标在重新插入导管前正常恢复呼吸。
    注: 步骤 4.11-4. 18 的每个鼠标的平均时间约为5分钟。
  19. 将注入的鼠标放在 IACUC 上的已批准的加热垫上, 然后放在平坦的表面上进行恢复。
    注: 整个过程将采取10分钟每鼠标。在完全恢复之前, 不要将已经注射到其他动物公司的动物退回。
  20. 在成像前用电动剃须刀剃掉整个肋区的腹部和背的 B6129SF1/J 和其他小鼠的黑头发。
  21. 2-3 分钟后细胞注射, 注射100µL 荧光素复古轨道 (15 毫克/毫升) 使用胰岛素针。在每次成像会话中交替使用用于注射的眼睛。
  22. 在至少2分钟后, 在一个动物生物发光成像仪中放置多达5只老鼠, 在背卧床位置, 并获得一个侧面图片使用发光设置29。
  23. 在控制面板下调整分辨率和灵敏度设置, 以测量给定细胞线的发光。对于大多数应用程序, 从3分钟 (或 "自动" 如果饱和) 开始, binning = 中等 (4), F/Stop=1, 视野 = D, 主题高度 = 1.50。
    注: 如果注射成功, 在上胸区, 在一个肺或两个肺部检测到发光信号。
  24. 翻转小鼠到胸骨卧床位置, 并获得一个背部图片如上所述。
    注: 如果细胞注射未正确执行, 细胞可能会聚集在气管入口或颈部。
  25. 注射酮酮5毫克/千克腹腔减轻疼痛。
  26. 把老鼠搬回笼子里, 在笼子里放一张 "BSL-2 剂"。
  27. 在插管后立即监测小鼠呼吸窘迫, 然后每隔15分钟, 直到老鼠从麻醉中醒来。不要让老鼠无人看管, 直到他们恢复足够的意识来维持胸骨卧床。
  28. 检查小鼠 24 h 后插管和每周三次的任何发病率的迹象。
  29. 记录在程序日期, 动物身份, 程序类型, 麻醉类型和术后监测观察和时间的日志。
  30. 监测小鼠的体重减轻, 呼吸窘迫, 行为异常, 身体状况评分 < 2 (脊柱明显/背骨盆骨分割可见) 两周后接种的博莱霉素。
    注: 肺肿瘤小鼠可能表现为呼吸刺激、体重减轻、恶病质和/或死亡。
  31. 弄死小鼠在呼吸窘迫或小鼠经历了15% 的身体质量损失由 CO2或氯胺酮/甲苯噻嗪后, 颈部脱位, 如果收集组织。通过对呼吸活动进行触诊确认安乐死。

5. 生物发光成像对肿瘤生长的监测

  1. 重复成像的老鼠在3天后植入和每周。
  2. 麻醉小鼠注射氯胺酮/甲苯噻嗪 (如步骤 2.4-2.5 中所述) 或吸入异氟醚 (2%)。监测小鼠的呼吸, 并使用脚趾捏来确认正确的麻醉。在麻醉时, 应将兽医软膏涂抹于眼部, 以防干燥。
  3. 在成像前用电动剃须刀剃掉整个肋区的腹部和背的 B6129SF1/J 和其他小鼠的黑头发。
  4. 一旦老鼠被麻醉, 注射100µL 的荧光素轨道 (15 毫克/毫升) 使用胰岛素针。等待2分钟交替的眼睛用于注射每一个成像会话。
  5. 将鼠标放在成像仪中, 并获得4.22-4 步24中所述的背侧和腹侧图像。
  6. 在成像后将老鼠放回笼子里, 在他们的背部在平坦的表面恢复。
    注: 整个手术过程每组5只老鼠需要5分钟。不要让老鼠无人看管, 直到他们恢复足够的意识来维持胸骨卧床。
  7. 利用成像/生物发光分析软件对图像进行分析。
    1. 选择适当的图像并将它们作为一个组加载到生物发光分析软件中。
    2. 单击roi 工具 | 正方形以添加感兴趣的正方形区域 (roi)。将 ROI 放在上胸部区域, 覆盖整个肺部图像。对每个鼠标图像重复此操作。
    3. 右键单击并选择 "复制所有 roi函数" 将相同的 roi 应用于组中的所有图像, 并将它们放置在鼠标的上胸部, 无论是腹侧视图还是背景色。
    4. 在图像窗口的左上角, 选择光子函数。单击测量控制面板函数以测量 ROIs。将包含总通量 (光子/s) 的输出表复制并粘贴到一个可供选择的软件中, 以便进一步分析数据。
    5. 将每个鼠标的每日 roi 值正常化为其在0天测量的 roi 值。

6. 组织分离和加工。

  1. 麻醉小鼠注射氯胺酮/甲苯噻嗪 (如步骤 2.4-2.5 或吸入异氟醚 (2%) 所述。监测老鼠的呼吸, 并使用脚趾捏。确认正确的麻醉时, 鼠标不响应脚趾捏。在麻醉时, 应将兽医软膏涂抹于眼部, 以防干燥。
  2. 用胰岛素针注射100µL 荧光素复古轨道 (15 毫克/毫升)。等待2分钟。
  3. 图象老鼠跟随步骤 4.22-4. 24 从这个协议。
  4. 注射到另一只眼睛从步骤6.2 另外100µL 的荧光素复古轨道使用胰岛素针之前, 安乐死。
  5. 弄死小鼠腹腔注射氯胺酮/甲苯噻嗪 (见步骤2.4 的细节), 其次是颈椎脱位, 如果小鼠在深度麻醉下, 根据 IACUC 提供的指导方针。通过对呼吸活动进行触诊确认安乐死。
  6. 使用无菌手术剪刀在胸骨下面做一个皮肤切口。用镊子和手术剪刀在隔膜上打开肌肉层, 通过在两侧两侧的肋骨笼上切开胸腔, 避免胸腔内动脉。
  7. 灌注通过在心脏右心房做一个小切口, 并通过左心室注入5毫升 PBS。如果血液灌注得当, 肺组织的颜色会从红到浅粉色白色。
  8. 用镊子抓住食道或心脏, 仔细地将肺部从胸腔中切除。轻轻拉组织, 并使用手术剪刀仔细削减连接组织避免穿刺的肺组织。在以后的一步中尽量保持气管的膨胀。
  9. 通过浸没和旋转组织3倍的6井板填充3毫升的 PBS, 以清除多余的血液, 洗肺。
  10. 将肺放在6井板的盖子上, 将含有组织的盖子放在发光成像仪中, 并获得发光图像30。
    注: 我们建议从 "采集控制面板" "视图 = A" 和 "主题高度 = 0.75 厘米" 中选择以下设置, 然后 "自动曝光" 以避免获得饱和图像。
  11. 消费和图像其他器官, 如步骤 6.9-6.10 中所做的, 其中转移已被发现的发光, 如脑, 肝, 肾上腺, 骨, 淋巴结, 肾脏或脾脏31。
  12. 灌注1毫升4% 多聚甲醛的肺, 将针头插入鼠标的气管内。如果灌注得好, 肺部会膨胀。
    警告: 4% 多聚甲醛是一种毒性、健康危害 GHS07 和 GHS08。
  13. 将肺部转移到15毫升圆锥, 5 毫升4% 多聚甲醛。
  14. 修复肺或其他组织通过孵化的组织与4% 多聚甲醛隔夜在4°c 在一个震动装置在 30-50 rpm。
  15. 根据应用32, 在石蜡或最佳切削温度化合物中嵌入肺部 (或其他组织)。
    注: 石蜡是保存肺结构和马尾松三色和苏木精-伊红染色的首选方法。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

为了提高 LUAD 癌细胞植入到小鼠肺中的效率, 我们制定了一项协议, 首先使用博莱霉素的呼吸道, 其次是原位肿瘤细胞注射 (图 1)。我们证实, 即使在免疫裸小鼠, 博莱霉素诱导瞬变纤维化14天, 证明了气道结构的损失和增加胶原沉积 (图 2)。这些小鼠的毛纤维化在博莱霉素注射液后50天解决 (图 2; 右面板) 与以前的研究一致24。

根据这些观察, 我们嫁接的 LUAD 细胞不同的起源到肺部的各种小鼠菌株, 已预先条件与单一剂量的车辆或博莱霉素前14天。例如, 从已建立的人类 LUAD 细胞系 (H2030) 中悬浮 LUAD 细胞, intratracheally 到裸小鼠的肺部。35天后, 用博莱霉素预处理的小鼠有很高...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在肺癌和其他慢性疾病的肺36之间有明显的临床相似之处。尤其是特发性肺纤维化 (IPF) 患者对发展肺癌的偏爱增加, 而这个协会独立于吸烟史37,38。森林小组的特点是逐步破坏肺结构和受损的呼吸功能, 通过沉积 ECM39。同时, 在手术切除后, 早期的无细胞肺癌患者并发森林小组的结局较差40。多数 NSCLC 肿瘤在诊断时含有纤维化成分, 这种间质反应的程度与预后差18有关。纤维化的急性或持续性组织损伤可能以多种方式增加肿瘤发生率。例如, 在损伤后, 上皮再生的过程可能会扩大容易转化的祖细胞池。另外, 各种免疫细胞的流入和功能可能有助于建立免疫抑制微环境, 而肌的活化可能分泌生长因子或沉积肿瘤促进 ECM。因此, 我们用纤维化诱导剂对肺部进行预调节的方法可能特别适合于研究肺癌的发病率 (如纤维化) 和非 NSCLC 亚型的模型, 后...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明没有竞争的财政利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项研究的经费来自国家癌症研究所 (R01CA166376 和 R01CA191489 D.X.) 和国防部 (W81XWH-16-1-0227 D.X. 阮) 的赠款。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
博来霉素SigmaB5507-15UN注意 健康危害 GHS08
Exel 导管 24GFisher1484121取出针头。气管内注射
氯胺酮（Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL）Butler Schein56344麻醉小鼠
甲苯噻嗪Butler Schein33198麻醉小鼠
酮洛芬，5,000 毫克开曼化学10006661镇痛药
Puralube 兽用眼药膏BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC8897为了防止麻醉时眼睛干涩
Perkin Elmer Health Sciences Inc122799用于发光成像。用 PBS 复溶粉末，工作浓度为 15 mg/mL。防止光线
啮齿动物插管架Braintree ScientificRIS-100气管内注射推荐支架
MI-150 照明器 150W MI-150DOLAN-JENNER INDUSTRIESMI-150 / EEG2823M照亮和观察气管
Graefe 镊子，2.75 （7 cm） 长 serratRobozRS-5111用于气管内注射
注射器 Luer-Lok 无菌 5mlBD / Fisher309646
Satini Smooth by Conair 双箔湿/干充电剃须刀Conair-To剃须鼠
Bonn 剪刀，3.5 英寸直 15 毫米锋利/锋利的刀片RobozRS-5840SC
15 mL 锥形管BD / Fisher352097
1.5 mL 离心管USA SCIENTIFIC INC1615-5500
样品瓶闪烁 7 mL 硼硅酸盐玻璃 GPIFisher701350
过滤移液器吸头 （200 μL）USA SCIENTIFIC INC1120-8710
磷酸盐缓冲盐Life Technologies14190-144
0.25% 胰蛋白酶-EDTALife Technologies25200-056
DMEM 高葡萄糖Life Technologies11965-092
RPMI 培养基 1640Life Technologies11875-093
胎牛血清 USDALife Technologies10437-028
青霉素-链霉素Life Technologies15140-122
两性霉素 BSigmaA2942-20ML
台盼蓝染色 0.4%Life Technologies15250-061
Countess 自动细胞计数仪Life TechnologiesAMQAX1000
瓶 T/C 75cm 方形斜颈，蓝色瓶盖Fisher / Corning353135
IVIS Spectrum Xenogen 生物发光Perkin Elmer Health Sciences Inc124262用于 体内生物发光成像
活体图像软件Perkin Elmer Health Sciences Inc128113用于 体内 生物发光分析
XGI-8 气体麻醉系统Perkin Elmer Health Sciences Inc118918用于异氟醚麻醉
BD 超细 II 短针胰岛素注射器 1 cc. 31 G x 8 mm （5/16 in）BD / FisherBD328418用于眶后荧光素注射
注射器 1mlBD / Fisher14-823-434用于腹膜内注射
26 G x 1/2 英寸针BD / Fisher305111用于腹膜内注射
4% 多聚甲醛VWR43368-9M注意 健康危害 GHS07、GHS08。用于固定组织
Pipet-Lite 移液器，Unv.SL-200XLS+梅特勒-托利多国际
Mayer's 苏木精电子显微镜科学517-28-2
曙红 Y 染色剂 0.25% （w/v） 在 57%Fisher67-63-0
马森三色染色试剂盒IMEB IncK7228用于马森三色染色剂以可视化胶原蛋白
Superfrost plus 载玻片Fisher
6 孔板康宁C3516
通用支原体检测试剂盒ATCC30-1012K
OCT 包埋化合物电子显微镜科学62550-12用于冷冻切片组织包埋
Leica CM3050 S Research 低温恒温器LeicaCM3050 STo 切片组织进行染色分析
Keyence 一体式荧光显微镜KeyenceBZ-X700
ImageJ美国国立卫生研究院IJ1.46http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 适用于 Mac OS XGraphPad Software， Inc.-
无胸腺 （Crl：NU（NCr）-Foxn1nu） 小鼠Charles RiverNIH-553
NSG （NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ） 小鼠Jackson Laboratories5557
B6129SF1/J 小鼠Jackson Laboratories101043
NIH-H2030 细胞ATCCCRL-5914
368T1由 Monte Winslow（斯坦福大学）慷慨提供-
PC9 细胞Nguyen DX et al. Cell. 2009;138：51–
BrM3 细胞Nguyen DX et al. Cell. 2009;138：51–62-
，水 头 17014411 1255015 62-H2030

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