用博来霉素对小鼠气道进行预处理可提高原位肺癌细胞移植效率

摘要

我们描述了一种通过预先对气道造成损伤以显著增强肺癌细胞在小鼠肺部原位移植效率的方法。该方法还可用于研究肺部微环境中的基质相互作用、肿瘤转移扩散、肺癌共病情况，以及更高效地建立患者来源的异种移植模型。

摘要

肺癌是一种致命且难以治疗的疾病，具有高度的生物学异质性。为了理解并有效治疗各种胸腔恶性肿瘤，需要建立更多能够模拟不同类型和阶段人类肺癌的动物模型。同系移植或异种移植模型具有较高的灵活性，可利用小鼠或人类来源的恶性细胞，在体内定量评估其致瘤能力in vivo。然而，以往报道的肺癌细胞移植方法通常在非生理部位（如小鼠的 flank 部位）进行，这是由于将细胞原位移植至肺部的效率较低所致。在本研究中，我们描述了一种通过使用诱导纤维化的试剂博来霉素（bleomycin）预先处理小鼠气道，以增强肺癌细胞原位移植效率的方法。作为概念验证实验，我们将该方法应用于将来源于小鼠或人类的肺腺癌亚型肿瘤细胞，移植至多种品系的小鼠体内。我们证明，在注射肿瘤细胞前使用博来霉素损伤气道，可使肿瘤细胞的移植成功率从 0–17% 提高至 71–100%。重要的是，该方法在不同模型和小鼠品系中均显著提高了肺部肿瘤的发生率及其后续生长。此外，移植的肺癌细胞可从肺部扩散至相关远端器官。因此，我们提供了一种实验方案，可用于在细胞数量或生物样本极其有限的情况下，建立和维持新型的肺癌原位模型，并在生理相关条件下对肺癌细胞的致瘤能力进行定量评估。

引言

肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因¹。肺癌患者最终通常因肿瘤转移至远处器官而死亡，尤其是中枢神经系统、肝脏、肾上腺和骨骼^2,3,4。胸部恶性肿瘤传统上被分为小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）⁵。NSCLC 是最常见的恶性肿瘤类型，可进一步分为不同的组织学亚型，包括肺腺癌（LUAD）和肺鳞状细胞癌（LUSC）⁶。对切除的人类原发性肺癌进行基因组分析发现，同一组织学类型的肿瘤也可能表现出多种不同的分子异常，这进一步导致其临床进展的差异性，并使患者的预后评估变得复杂。肺癌显著的异质性给合理设计、临床前测试以及有效治疗策略的实施带来了重大挑战。因此，有必要拓展可操作的实验性肺癌模型体系，以研究该疾病多样化的细胞起源、分子亚型及不同发展阶段。

已采用多种动物模型研究肺癌 体内，每种方法都有其独特的优缺点，具体选择取决于所研究的生物学问题。基因工程小鼠模型（GEMMs）可针对特定的前体细胞类型引入精确的遗传改变，从而在免疫功能健全的宿主体内诱导肿瘤发生与发展⁷尽管GEMM具有极强的功....

方案

所有实验均依照耶鲁大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行。

1. 试剂的准备与配制。

1. 博来霉素
   注意：根据化学品分类和标签全球协调制度（GHS），博来霉素被归类为GHS08健康危害物质。
   1. 在化学通风橱中配制博来霉素。将15 U溶解于5 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中。
   2. 将100–200 µL溶液分装至玻璃小瓶中，于–20 °C冷冻保存以备后续使用。用重悬日期正确标记试管，并在该日期起6个月内使用。
      注意：每种小鼠品系对博来霉素的敏感性不同²⁶建议针对每种小鼠品系测试不同的博来霉素剂量。代表性实验中使用的小鼠品系及其对应的博来霉素剂量列于 表1.
2. 小鼠
   1. 购买实验所需小鼠，注射前让小鼠适应环境7天。在生物安全柜中进行灌注操作。在博来霉素灌注前，按照本机构标准操作程序，将饲养于非符合BSL2标准房间内的动物转移至符合BSL2标准的房间。小鼠在6至8周龄时进行注射。
      注意：根据机构对有害制剂、生物安全二级（BSL2）以及IACUC批准的规定进行小鼠注射。
      注意：代表性实验所用小鼠的购买信息列于下文 材....

结果

为了提高肺腺癌细胞在小鼠肺部的移植效率，我们建立了一种先使用博来霉素预处理气道，再进行原位肿瘤细胞注射的实验方案（图1）。我们证实，即使在免疫缺陷的无胸腺小鼠中，博来霉素在给药后第14天仍可诱导短暂性纤维化，表现为气道结构破坏和胶原沉积增加（图2）。在博来霉素注射后50天，这些小鼠的宏观纤维化已消退（图2；右侧面板），与先前的研究结果一致²⁴。

基于这些观察结果，我们将不同来源的肺腺癌（LUAD）细胞移植到经预处理的小鼠品系肺部，这些小鼠在14天前预先接受了一次性剂量的载体或博来霉素处理。例如，将来自已建立的人肺腺癌细胞系H2030的细胞悬液经气管内注入无胸腺小鼠的肺部。35天后，经博来霉素预处理的小鼠表现出较高的肺部肿瘤负荷，.......

讨论

肺癌与其他慢性肺部疾病之间已观察到显著的临床相似性³⁶。特别是，特发性肺纤维化（IPF）患者更易发生肺癌，且这种关联性与吸烟史无关^37,38。IPF 的特征是通过细胞外基质（ECM）沉积导致肺组织结构进行性破坏和呼吸功能受损³⁹。此外，伴有 IPF 的早期非小细胞肺癌（NSCLC）患者在接受手术切除后预后较差⁴⁰。大多数 NSCLC 肿瘤在诊断时即含有纤维化成分，且这种间质反应的程度与不良预后相关¹⁸。纤维化引起的急性或持续性组织损伤可能通过多种机制增加肿瘤发生的风险。例如，损伤后上皮再生过程可能扩大易发生恶性转化的前体细胞池。此外，多种免疫细胞的浸润及其功能改变可能有助于形成免疫抑制的微环境，而肌成纤维细胞的活化可能分泌生长因子或沉积促进肿瘤的细胞外基质。因此，我们采用致纤维化试剂预先处理肺组织的方法，可能特别适用于研究肺癌共病（.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
博来霉素	Sigma	B5507-15UN	注意 健康危害 GHS08
Exel 导管 24G	Fisher	1484121	移除针头。用于气管内注射
氯胺酮（Ketaset 注射液 100 mg/mL C3N 10 mL）	Butler Schein	56344	用于小鼠麻醉
赛拉嗪	Butler Schein	33198	用于小鼠麻醉
酮洛芬，5,000 mg	Cayman Chemical	10006661	镇痛剂
Puralube 兽用眼科软膏	BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC	8897	防止麻醉期间眼睛干涩
D-荧光素粉末	Perkin Elmer Health Sciences Inc	122799	用于发光成像。用 PBS 重悬粉末至工作浓度 15 mg/mL。避光保存
啮齿类动物插管架	Braintree Scientific	RIS-100	推荐用于气管内注射的支架
MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150	DOLAN-JENNER INDUSTRIES	MI-150 / EEG2823M	用于照亮并可视化气管
Graefe 镊子，2.75（7 cm）长锯齿	Roboz	RS-5111	用于气管内注射
鲁尔锁式无菌注射器 5 mL	BD / Fisher	309646
Conair Satiny Smooth 双刀网膜式可充电剃须刀（湿/干两用）	Conair	-	用于剃除小鼠体毛
Bonn 剪刀，3.5" 直头 15 mm 锐/锐安全刀刃	Roboz	RS-5840SC
15 mL 锥形管	BD / Fisher	352097
1.5 mL 离心管	USA SCIENTIFIC INC	1615-5500
7 mL 硼硅酸盐玻璃闪烁瓶 GPI	Fisher	701350
滤芯移液器吸头（200 μL）	USA SCIENTIFIC INC	1120-8710
磷酸盐缓冲液	Life Technologies	14190-144
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Life Technologies	25200-056
DMEM 高糖培养基	Life Technologies	11965-092
RPMI 1640 培养基	Life Technologies	11875-093
胎牛血清 USDA	Life Technologies	10437-028
青霉素-链霉素	Life Technologies	15140-122
两性霉素 B	Sigma	A2942-20ML
台盼蓝染色液 0.4%	Life Technologies	15250-061
Countess 自动细胞计数仪	Life Technologies	AMQAX1000
细胞培养瓶 T/C 75 cm² 倾斜颈，蓝色瓶盖	Fisher / Corning	353135
IVIS Spectrum Xenogen 生物发光成像系统	Perkin Elmer Health Sciences Inc	124262	用于 in vivo 生物发光成像
Living Image 软件	Perkin Elmer Health Sciences Inc	128113	用于 in vivo 生物发光分析
XGI-8 气体麻醉系统	Perkin Elmer Health Sciences Inc	118918	用于异氟烷麻醉
BD Ultra-Fine II 短针胰岛素注射器 1 cc，31 G × 8 mm（5/16 英寸）	BD / Fisher	BD328418	用于眶后静脉窦荧光素注射
1 mL 注射器	BD / Fisher	14-823-434	用于腹腔注射
26 G × 1/2 英寸针头	BD / Fisher	305111	用于腹腔注射
4% 多聚甲醛	VWR	43368-9M	注意 健康危害 GHS07, GHS08。用于组织固定
Pipet-Lite 移液器，通用型 SL-200XLS+	METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL	17014411
Mayer 苏木精染液	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	517-28-2
伊红 Y 染液 0.25%（w/v）溶于 57%	Fisher	67-63-0
Masson 三色染色试剂盒	IMEB Inc	K7228	用于 Masson 三色染色以显示胶原纤维
Superfrost Plus 玻片	Fisher	1255015
6 孔板	Corning	C3516
通用支原体检测试剂盒	ATCC	30-1012K
OCT 包埋剂	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	62550-12	用于冷冻切片的组织包埋
Leica CM3050 S 研究型冷冻切片机	Leica	CM3050 S	用于组织切片以进行染色分析
Keyence 一体式荧光显微镜	Keyence	BZ-X700
ImageJ	美国国立卫生研究院	IJ1.46	http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 for Mac OS X	GraphPad Software, Inc.	-
裸鼠（Crl:NU(NCr)-Foxn1nu）	Charles River	NIH-553
NSG 小鼠（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ）	Jackson Laboratories	5557
B6129SF1/J 小鼠	Jackson Laboratories	101043
NIH-H2030 细胞	ATCC	CRL-5914
368T1	由 Monte Winslow（斯坦福大学）慷慨提供	-
PC9 细胞	Nguyen DX 等. Cell. 2009;138:51–62	-
H2030 BrM3 细胞	Nguyen DX 等. Cell. 2009;138:51–62	-