本研究建立了一种使用树脂毒素（RTX）的纯小纤维神经病变实验模型。特定剂量的RTX（50 µg/kg）是构建模拟患者特征的小纤维神经病变模型的最佳选择，有助于研究神经病理性疼痛背后伤害性感受相关分子机制的意义。
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摘要
摘要
糖尿病（DM）患者或经历化疗药物神经毒性作用的个体可能因小直径感觉神经元的变性和损伤而出现感觉障碍，这种状况被称为小纤维神经病变。现有的小纤维神经病变动物模型同时影响大直径和小直径感觉纤维，从而导致神经病理学改变过于复杂，难以准确评估小直径感觉纤维损伤的特异性效应。因此，有必要建立一种纯小纤维神经病变的实验模型，以充分研究这些问题。本方案描述了一种通过单次腹腔注射树脂毒素（resiniferatoxin, RTX）——瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）的超强激动剂——诱导特异性损伤小直径感觉神经的小纤维神经病变实验模型，称为RTX神经病变。该RTX神经病变表现出与小纤维神经病变患者临床特征相似的病理表现和行为异常，包括表皮内神经纤维（IENF）变性、小直径神经元的特异性损伤，以及热觉减退和机械性异常性疼痛的诱导。本方案测试了三种剂量的RTX（分别为200、50和10 µg/kg），并得出结论：诱导典型小纤维神经病变表现需要一个关键剂量的RTX（50 µg/kg），同时建立了一种改良的免疫染色方法，用于检测IENF变性和神经元胞体损伤。该改良方法快速、系统且经济。神经病理性疼痛的行为学评估对于揭示小直径感觉神经的功能至关重要。实验啮齿类动物机械阈值的评估尤为困难，本方案介绍了一种定制的金属网筛装置，适用于啮齿类动物此类评估。总之，RTX神经病变是一种新型且易于建立的实验模型，可用于评估神经病理性疼痛相关的分子机制及干预策略，从而推动治疗药物的研发。
引言
小纤维神经病常表现为神经病理性疼痛，并伴有表皮内神经纤维（IENF）的退变，这种情况常见于多种疾病，如糖尿病（DM），以及化疗药物的神经毒性作用1,2,3,4,5。IENF是位于背根神经节（DRG）中的小直径神经元的外周终末，在IENF发生退变时，这些神经元也会同时受到影响6。例如，已有研究通过激活转录因子-3（ATF3）的上调证明了神经元胞体上游基因转录的改变6,7。此外，通过皮肤活检评估IENF的支配情况，对小纤维神经病的诊断具有重要价值5,8,9。传统上，皮肤活检中IENF的检测依赖于对蛋白基因产物9.5（PGP 9.5）的免疫组织化学染色1,10
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方案
所述所有操作均符合实验动物伦理指南30，且该方案已获得中国台湾高雄医学大学动物委员会的批准。
1. RTX 神经病变的建立
注意：RTX 具有神经毒性且危险。接触后会对眼睛、黏膜和上呼吸道产生刺激作用。配制 RTX 时应避免吸入，并佩戴实验室护目镜和实验服。若皮肤接触或操作后，应立即用大量清水冲洗。
- 加入1 mg RTX粉末至 200 µL 等体积吐温80与无水乙醇混合液100 µL （每种溶剂）。
- 分装 RTX 溶液（12 µL/vial) 并于 -20 °C，最长可保存3个月。此即为RTX储备液；RTX溶液过期后应弃用剩余部分。
- 用生理盐水将RTX原液稀释至终体积 600 µL最终RTX溶液的浓度应为0.01%，相当于 1 µg RTX 在 10 µL 溶剂对照液
- 使用8周龄成年雄性ICR小鼠（35-40 g）作为实验动物，单次给予RTX溶液（剂量：200、50和 10 µg/kg分别通过微量注射器对小鼠进行腹腔内（i.p.）注射。使用5%异氟烷通过吸入麻醉法对小鼠实施深度麻醉。若小鼠在注射RTX期间出现四肢回缩反应，应延长麻醉吸入时间。
示例：如果小鼠体重为40 g，则其将接受 20 µL RTX 溶液的剂量，代表给药剂量 50 µg/k....
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结果
本方案描述了一种新型的RTX神经病变小鼠模型，该模型特异性影响小直径神经元，伴有表皮内神经纤维（IENF）退变，与感觉障碍相关（图2）。根据本方案操作，动物在RTX注射后第7天（D7）出现热痛觉减退和机械性异常性疼痛。为建立这一小纤维神经病变模型，通过腹腔注射（i.p.）给予三组不同剂量的RTX：200、50和10 µg/kg。其中RTX剂量（50 µg/kg）被确定为关键剂量，初步研究表明高剂量RTX（200 µg/kg）导致小鼠死亡率显著升高（图3）。
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讨论
临床上迫切需要有效的治疗手段来促进小纤维神经病变患者的功能恢复和生活质量提升。目前，由于对小直径神经元损伤的分子机制缺乏全面认识，尚缺乏针对小纤维神经病变相关感觉障碍的治疗指南。以往的神经病变模型通常同时影响大直径和小直径感觉神经，例如化疗诱导的神经病变12,32,33和机械性诱导的神经病变34,35。因此，在这些神经病变模型的行为学检测中，无法完全排除运动功能减弱和大直径感觉神经损伤所带来的影响。本实验方案介绍了一种新的小纤维神经病变小鼠模型，该模型仅影响小直径感觉神经，并通过IENF变性的病理学和功能学证据加以证实。
RTX 是 TRPV1 的一种超强激动剂，也是辣椒素的类似物，可能在体外培养36和体内系统
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披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
本研究工作得到了中国台湾科技部（106-2320-B-037-024）、高雄医学大学（KMU-M106028、KMU-S105034）以及高雄医学大学顶尖大学计划补助（TP105PR15）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 化学试剂 | |||
| Resiniferatoxin | Sigma | R8756 | |
| Tween 80 | Sigma | P1754 | |
| 3,3’-diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| avidin-biotin complex | Vector | PK-6100 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 一抗 | |||
| Peripherin | Chemicon | MAB-1527 | |
| ATF3 | Santa Cruz | SC-188 | |
| PGP9.5 | UltraClone | RA95101 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 二抗 | |||
| 生物素标记的山羊抗兔IgG | Vector | BA-1000 | |
| Texas Red标记的山羊抗小鼠IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-075-146 | |
| 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的驴抗兔IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-095-152 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 设备 | |||
| 热板仪 | IITC | Model 39 | |
| von Frey纤维丝 | Somedic Sales AB | 10-600-0001 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 材料 | |||
| Shandon盖板 | Thermo scientific | 72110017 | |
| 载玻片架 | Thermo scientific | 73310017 |
参考文献
- Shun, C. T., et al. Skin denervation in type 2 diabetes: correlations with diabetic duration and functional impairments. Brain. 127 (Pt 7), 1593-1605 (2004).
- Polydefkis, M., et al.
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重印与许可
