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方法文章

利用光激活型激动剂实现T细胞活化的时空控制

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DOI：

10.3791/56655

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2018年4月25日

 , 
1Immunology Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, 2Weill-Cornell Graduate School of Medical Sciences

本文内容

摘要

本方案描述了一种基于成像的T淋巴细胞激活方法，该方法利用光激活型肽-MHC实现对T细胞激活的精确时空控制。

摘要

T淋巴细胞在T细胞受体（TCR）激活后的数分钟内即启动快速且极化的信号传导。这一过程诱导免疫突触的形成，免疫突触是一种典型的细胞-细胞连接结构，可调控T细胞的活化，并将效应反应定向引导至特定位置。为了有效研究这些过程，需要采用一种能够捕捉快速、极化反应的成像方法。本实验方案描述了基于光激活肽-主要组织相容性复合物（pMHC）的成像系统，该pMHC在未暴露于紫外光时不具备刺激性，仅在光照后被激活。在视频显微镜实验中对这一试剂进行靶向脱笼，可实现对TCR激活的精确时空控制，并通过全内反射荧光显微成像（TIRF）高分辨率地监测后续的细胞反应。该方法还可与基因编辑和药理学干预策略相兼容，有助于构建从TCR信号传导到极化细胞骨架结构形成的明确分子通路，从而揭示免疫突触形成的分子机制。

引言

T淋巴细胞（T细胞）通过识别呈现在细胞表面MHC分子环境中的抗原肽，在细胞免疫中发挥核心作用。由TCR介导的抗原识别可驱动初始T细胞的分化，并促进效应细胞群传递细胞毒性和通讯性反应。TCR的结合还会诱导细胞结构发生显著变化。数分钟内，T细胞便会黏附到抗原呈递细胞（APC）的一侧，形成一种极化的界面，称为免疫突触（IS）1,2。免疫突触通过实现细胞因子的定向释放，或在细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的情况下释放破坏APC的溶细胞蛋白，从而增强T细胞的效应功能。

pMHC 对 TCR 的结合可迅速诱导多个下游接头分子的磷酸化，其中包括 T 细胞活化连接蛋白（Linker for the Activation of T cells, LAT），最终促进免疫突触细胞骨架的强烈重塑2。皮层纤维状肌动蛋白（F-actin）驱动 T 细胞在抗原呈递细胞（APC）表面扩散，并随后重组为一种环状结构，其特征是 F-actin 在免疫突触（IS）外围富集而在中心区域耗竭。F-actin 环的形成与微管组织中心（MTOC，T 细胞中也称为中心体）的重定向紧密偶联，使其定位至细胞接触界面正下方的中心区域。这两个事件均在初始抗原识别后的数分钟内发生，并建立起后续活化事件及效应反应发生的结构基础。

为了研究免疫突触（IS）的形成，多个实验室已开发出一些方法，其中用玻璃表面替代抗原提呈细胞（APC），该玻璃表面或直接固定有T细胞受体（TCR）配体，或支撑含有这些配体的脂质双层3,4。T细胞在这些表面上可形成类似免疫突触的接触结构，可通过全内反射荧光显微镜（TIRF）或共聚焦显微镜进行成像，从而实现对T细胞早期活化及免疫突触形成过程的高分辨率研究。

尽管这些方法能够很好地可视化完全组装的免疫突触（IS），但TCR与pMHC结合后的大部分信号传导事件在数秒内即发生，这使得准确确定TCR激活后事件顺序的努力变得复杂。为克服这一问题，已开发出一种光激活方法，该方法利用可光激活的pMHC实现对TCR激活的时间和空间控制5,6,7。在此系统中，T细胞被附着在含有可光激活pMHC的玻璃表面，该pMHC在未受到紫外光（UV）照射前对TCR无刺激性。对T细胞下方微米尺度区域的表面进行紫外光照射，可去除光保护基团，从而形成可被T细胞识别的刺激区域。随后通过基因编码的荧光报告分子监测后续的信号事件及细胞骨架重塑过程。目前已开发出两种抗原肽的可光激活形式：分别由MHC II类分子I-Ek和MHC I类分子H2-Kb提呈的飞蛾细胞色素c88-103（MCC）和卵清蛋白257-264（OVA）（图1）。这使得研究人员能够分析特异性识别MCC-I-Ek的CD4+ T细胞（表达5C.C7、2B4或AND TCR）以及特异性识别OVA-H2-Kb的CD8+ T细胞（表达OT1 TCR）。

在过去十年中，TCR光激活与成像技术已被用于阐明TCR早期信号传导事件的精确动力学过程，并鉴定调控极性细胞骨架重塑的分子通路5,6,7,8,9,10。例如，该检测方法在研究中发挥关键作用，证实了中心体向抗原呈递细胞（APC）的重新取向是由免疫突触（IS）中心区域局部形成的脂质第二信使二酰甘油（diacylglycerol）浓度梯度所介导的。预计该方法将继续在需要高分辨率成像分析T细胞功能的研究应用中发挥重要价值。

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方案

1. 刺激性玻璃表面的制备

  1. 用去离子蒸馏水（ddH₂O）将生物素化聚-L-赖氨酸（Bio-PLL）按1:500比例稀释后，包被八孔腔室载玻片2O）。室温（RT）孵育30分钟。
  2. 用 H 洗涤2O.
  3. 室温下干燥2小时。
  4. 用封闭缓冲液（HEPES缓冲盐水 [10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl]，含2% BSA）在室温下封闭Bio-PLL包被的表面，孵育30分钟。
    1. 将5 mg聚-L-赖氨酸氢溴酸盐溶解于1 mL 10 mM NaPO中4，pH 8.5。
    2. 加入125 μmol（0.55 mg）NHS-生物素（溶于DMSO的100 mg/mL储备液），并检测反应液pH值。若pH低于8.5，加入2 μL 4 N NaOH将pH调至8.5–9.5之间。
    3. 涡旋 30 分钟。
    4. 用 50 μL 溶于 20 mM Tris（pH 8.0）中的 100 mM 甘氨酸终止反应。
    5. 以最大转速离心10分钟，将上清液转移至新管中。
      注意：通常通过将材料进行连续两倍稀释后包被到96孔ELISA板上，再与碱性磷酸酶偶联的链霉亲和素孵育，定量生物素含量，以此比较Bio-PLL的质量与先前制备批次的差异。
  5. 移除封闭缓冲液，切勿让孔板干燥。加入链霉亲和素（100 µg/mL，溶于封闭缓冲液中），4 °C孵育1小时。
  6. 用 HBS 洗涤。将腔室载玻片的孔进行填充并倒置 4–5 次，彻底去除孔中的 HBS。切勿让孔干燥。
  7. 将生物素化的pMHC配体和黏附分子添加至表面。
    注意：MCC 和 OVA 可通过添加基于邻硝基苄基的保护基团进行光笼修饰（例如， 硝基苯乙基（NPE）或硝基愈创木氧羰基（NVOC）对关键赖氨酸残基（MCC中的K12，OVA中的K7）的ε-氨基进行光笼修饰。光笼化MCC和OVA可从商业供应商处获得。在水相缓冲液中重悬后，将其与原核表达的I-E分子重新折叠结合k 和 H2-Kb 采用既定方法11,12.
  8. 光可激活MCC或OVA肽的验证
    1. 使用手持式紫外灯照射以脱保护十肽NVOC，见 材料表室温下孵育 20 分钟。
    2. 脉冲 1.0 × 105 APCs 与 1 µM 非刺激性肽段（阴性对照， 例如 血红蛋白（Hb）、未照射的光活化肽、照射后的光活化肽以及激动剂肽（阳性对照， 例如，MCC）在37 °C下孵育1小时至过夜。
    3. 为刺激表达5C.C7/2B4/AND TCR的T细胞，使用CH12或CH27 B细胞；为刺激OT1 T细胞，使用RMA-s或EL4胸腺瘤细胞。
    4. 将脉冲处理的APC与等数量的T细胞在96孔圆底板中混合，终体积为200 µL。37 °C孵育12–24小时。
    5. 从每个孔中回收上清液，并使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶比色法通过ELISA分析IL-2。
      注意：强烈建议在将所有肽段折叠成MHC复合物之前，通过电喷雾质谱法确认其封闭状态。
  9. 进行MHC的折叠和纯化时，应尽量减少其暴露于光线下。例如，将折叠反应混合物用铝箔包裹，并在关闭紫外灯的条件下进行凝胶过滤色谱。
    注意：已发现光激活型MCC-I-Ek 和 OVA-H2-Kb 在高密度下可能由于功能封闭不完全，导致不依赖紫外线的T细胞激活。因此，将光激活型pMHC稀释于10至30倍过量的非刺激性pMHC中，例如 I-Ek 含有血红蛋白64-76 在固定步骤中使用肽（Hb），可提高后续成像实验的信噪比。
  10. 光激活CD4+ T细胞共同使用混合的生物素化Hb-I-Ek (3 µg/mL)，生物素标记的光活化MCC-I-Ek （0.1 µg/mL）以及针对MHC I类分子H2-K的生物素化抗体k (0.5 µg/mL)。抗H2-Kk 抗体促进表达H2-K的5C.C7/2B4/AND T细胞k，使其在未活化的情况下即可在玻璃表面铺展。
  11. 对于CD8+ T细胞，使用生物素标记的H2-D混合物b 含有肽段 KAVYDFATL（1 µg/mL）的生物素化光活化 OVA-H2-Kb （0.1 µg/mL），以及黏附分子ICAM-1的胞外结构域（2 µg/mL，由昆虫细胞培养产生）13ICAM-1 通过与 T 细胞表面的整合素 LFA1 结合，促进紧密接触的形成。
  12. 将所有蛋白混合物加入封闭缓冲液中，室温孵育1小时或4 °C孵育至少2小时。
    注意：此类表面的分子密度约为每平方微米8000个2 先前已确定6鉴于光激活型pMHC约占1/30th 表面生物素化蛋白的密度约为每平方微米267个分子2，解笼之前。
  13. 按照步骤1.6进行洗涤，然后置于HBS中直至使用。
  14. 加入200,000个CD4+ 或 CD8+ 将表达适当TCR的T细胞加入各孔中，于37 °C孵育15分钟，使细胞贴壁。待细胞完全贴附并铺展后，即可进行光激活和成像。
    注意：效应T细胞通过逆转录病毒转导荧光成像探针的方法在其他文献中有详细描述6,7. 也可使用未转导的T细胞，负载钙离子敏感性染料Fluo-4来研究钙信号6不推荐使用比率型染料Fura-2，因为它需要在紫外光范围内激发，而紫外光会同时诱导光激活型pMHC的解笼反应。

2. 图像采集

  1. 使用配备紫外兼容的150倍物镜的倒置全内反射荧光（TIRF）显微镜进行图像采集。利用连接至100 W汞灯（HBO）的数字光阑系统，对用户自定义区域进行紫外照射。通过400 nm长通反射镜将该灯发出的紫外光直接投射到样品上。
  2. 使用图像分析软件进行局部光激活及延时成像采集。在大多数实验中，分别使用488 nm和561 nm激发激光监测绿色和红色通道中的探针。激光通过一个双通带二向色镜投射到样品上，该二向色镜同时在紫外范围内透射（以实现解笼锁）。有关显微镜配置的更多信息，请参见材料表和图6。
  3. 安装含有T细胞的腔室载玻片后，根据需要调整设置以获得TIRF或落射荧光照明。在实时模式下，选择表达目标荧光探针的细胞视野。通过软件控制，在单个细胞下方设定微米尺度的光激活区域。
  4. 开始延时成像采集。通常采集80个时间点，每两个时间点之间间隔5 s。对于双色实验，该间隔足以完成488 nm和563 nm激发光的依次曝光。
  5. 在采集至第10个时间点后，通过打开数字光阑快门1–1.5 s，对选定区域进行光激活。
  6. 延时成像完成后，选择新的细胞视野并重复该过程。

3. 数据分析

注意：固定化配体的局部光激活可产生明确定义的、静止的刺激区域，可用于对信号响应和细胞骨架重塑事件进行定量分析。分析方案通常包括量化照射区域内的荧光强度，或以照射区域作为距离测量的位置终点。例如用于评估中心体向辐照区域的极化情况）。以下将分别描述两种分析方案。可使用多种交互式图像分析程序进行强度和距离测量，测量结果可导出以进行后续处理和分析。

  1. 荧光强度
    1. 测定细胞外背景区域的荧光强度（FI）b）。这将用于背景校正。
      1. 在细胞外绘制一个微米级的方形区域并创建掩膜。为测定荧光强度，点击 分析 | 掩模统计选择 平均荧光强度 并导出数值。
        注意：操作细节（例如 3.1.1.1）请参阅 Slidebook 软件（见 材料表）。使用其他软件包实施本方案（例如，FIJI）会略有不同。
    2. 确定每个时间点光激活区域内荧光强度（FI）。
      1. 选择 口罩 以标记被光激活的区域。为测定荧光强度，点击 分析 | 掩膜统计选择 平均荧光强度 并导出数值。
    3. 从该区域测得的荧光强度（FI）值中减去背景荧光强度。然后，将校正后的FI测量值除以光激活前前9帧的平均背景校正后FI值进行归一化处理。ΔF/F = ((FI - FIb)/均值(FI1-9)-FIb)).
      注意：以时间为横轴绘制 ΔF/F 的变化曲线。
  2. 距离
    1. 获取光激活区域中心的 x 和 y 坐标。
      1. 为了确定光激活区域中心的 x 和 y 坐标，选择 口罩 以高亮显示被光激活的区域。选定光激活区域后，选择 分析 | 掩膜统计 | 面积中心 并导出数值。
    2. 确定每个时间点目标荧光探针的 x 和 y 坐标。这通常通过手动或自动颗粒追踪来实现。
      1. 为了确定目标荧光探针的 x 和 y 坐标，选择 手动颗粒追踪 随时间点击感兴趣的荧光探针。完成所有时间点的追踪后，选择 分析 | 掩膜统计 | 面积中心 并导出数值。
    3. 使用以下公式计算每个时间点目标荧光蛋白与光激活区域中心之间的距离：距离 = √((x2-x1)2+(y2-y1)2），其中 x2 和 y2 是所关注的荧光蛋白的坐标，x1 和 y1 是光激活区域中心的坐标。
    4. 将距离作为时间的函数进行绘图。

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结果

光激活与成像方法可实现对快速、极性信号响应的观察与简便定量。为展示该方法的能力，此处重现了一项实验，用于研究TCR诱导的DAG积累与中心体重新定向之间的时空相关性。5C.C7 T细胞母细胞通过逆转录病毒转导两种荧光报告分子：一种是包含蛋白激酶C-θ串联C1结构域并连接GFP的DAG生物传感器（C1-GFP），另一种是用于标记中心体的RFP-微管蛋白。随后将T细胞接种于含有光可激活MCC-I-Ek的腔室盖玻片上。采用全内反射荧光显微镜（TIRF）观察C1-GFP，同时以落射荧光模式观察RFP-微管蛋白。如图2所示，在T细胞下方局部光激活细胞表面，可诱导DAG在照射区域聚集，数秒后中心体即重新定向至同一区域。

可通过计算光激活区域中心随时间变化的背景校正后归一化荧光强度，来定量分析 C1-GFP 的积累（图 3）。通...

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讨论

近年来，光已成为时空可控激活细胞过程的一种极佳工具。已开发出多种方法，每种方法都有其相应的优缺点。本文所述系统基于对固定化的细胞外配体进行脱笼，非常适合分析快速、亚细胞水平、极性化的信号响应。如上所述，该方法已应用于研究T细胞中免疫突触（IS）的形成。此外，研究人员还设计了针对其他受体的笼锁型配体，使我们能够采用相同策略评估自然杀伤细胞中的抑制性信号传导，以及Toll样受体信号通路激活后转录因子NF-κB的核转位过程14,15。

在本实验方案中，通过将刺激性配体固定化，可确保其在整个成像实验过程中保持为静止且极化的刺激源。该方法非常适合用于细胞极化研究。然而需要注意的是，TCR光激活方法可轻松适用于在支撑脂双层上实现时间可控的T细胞激活。显然，在此情况下无法实现持续且极化的刺激。但根据实验目的，这可能是不必要的。

在解笼所需的紫外光源方面，该系统也具有很高的灵活性。目前使用100 W的汞灯进行聚焦照明，但此前也...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢Huse实验室成员提供的建议和帮助。本研究由美国国立卫生研究院（R01-AI087644资助给M.H.，P30-CA008748资助给纪念斯隆-凯特琳癌症中心）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Nunc Lab-Tek 带孔盖玻片Thermofischer Scientific155361
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐Sigma-AldrichP2636需要制备生物素化聚-L-赖氨酸
EZ-Link NHS-生物素Thermofischer Scientific20217需要制备生物素化聚-L-赖氨酸
链霉亲和素Thermofischer Scientific434301
BirA-500：BirA 生物素-蛋白连接酶标准反应试剂盒AvidityBirA500用于蛋白质的生物素标记
生物素化 Hb I-EK 关于蛋白质折叠，请参见参考文献6。关于生物素化，请使用BirA试剂盒
生物素化 NPE-MCC I-EK Anaspec定制NPE-MCC（H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH）可从Anaspec公司购买
生物素化 αH2-Kk 抗体BD Biosciences553591
生物素化 NPE-OVA H2-KbAnaspec定制NPE-OVA（H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH）可从Anaspec公司购买
生物素化 KAVY H2-Db Anaspec定制合成蛋白（KAVYDFATL）可从Anaspec公司购买
生物素化 ICAM1 关于蛋白质折叠，请参见实验方案中的参考文献。关于生物素化，请使用BirA试剂盒
手持式紫外灯UVPUVGL-25使用时将灯置于距样品 < 1 cm 处。  365 nm 紫外光照射30秒即可实现可检测的脱笼，照射20分钟可实现定量脱笼。
Olympus IX-81 OMAC TIRF 系统Olympus有关成像系统的更多详细信息，请参见 图6
Mosaic 数字光阑Andor
Slidebook 软件Intelligent Imaging Innovations

参考文献

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