Photoactivatable 激动剂对 T 细胞活化的时空控制

Summary

该协议描述了一种基于成像的方法, 激活 t 淋巴细胞使用 photoactivatable 肽 MHC, 使精确的时空控制 t 细胞活化。

Abstract

T 淋巴细胞参与快速, 极化信号, 发生在几分钟后 TCR 激活。这诱发了免疫突触的形成, 一种定型的细胞间结, 调节 T 细胞活化和定向靶效应反应。为了有效地研究这些过程, 需要一种适合捕获快速、极化响应的成像方法。该协议描述了这样一个系统, 它是基于 photoactivatable 肽-主要的组织相容性复合物 (抵押贷款公司), 它是不刺激的, 直到它暴露在紫外线。该试剂的靶 decaging 在 videomicroscopy 实验中, 通过全内反射 (TIRF) 成像, 实现对 TCR 活化和对后续细胞反应的高分辨率监测的精确时空控制。这种方法也符合遗传和药理的摄动策略。这允许组装明确定义的分子通路, 将 TCR 信号与免疫突触的极化骨架结构的形成联系起来。

Introduction

t 淋巴细胞 (t 细胞) 通过识别细胞表面 MHC 的抗原肽, 在细胞免疫中起重要作用。抗原识别是由 TCR 介导的, 它驱动了幼稚 T 细胞的分化, 促进了溶细胞的传递, 并推动了效应人群的交际反应。TCR 的参与也诱发了细胞结构的戏剧性变化。在几分钟内, T 细胞 gloms 到抗原呈现细胞 (APC) 的一侧, 形成一个极化接口, 称为免疫突触 (是)^1,2。增强 t 细胞效应反应通过使细胞因子的定向释放, 或者, 在细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTLs), 裂解蛋白, 破坏 APC。

TCR 参与抵押贷款公司诱导了多个下游适配器分子的快速磷酸化, 包括连接器的活化 T 细胞 (LAT), 这最终促进强健的重塑突触细胞^骨架2。皮质丝状肌动蛋白 (F 肌动蛋白) 驱动 T 细胞传播在 APC 表面, 然后解决成环状结构的特点是 F 肌动蛋白积累在外围和耗尽从中心。F-肌动蛋白环形成紧密耦合到重新定位微管组织中心 (MTOC, 也称为中心体在 T 细胞) 到一个位置只是在界面的中心。这两种事件都发生在初始抗原识别的几分钟内, 并建立了随后激活事件和效应响应发生的体系结构上下文。

研究的是形成, 各种实验室已经开发的方法, 其中 APC 被一个玻璃表面取代, 其中包括固定化 TCR 配体或支持脂双层, 本身包含配体^3,4。t 细胞形成类似的接触在这些表面上, 可以通过全内反射荧光显微镜 (TIRF) 或共聚焦显微成像, 使高分辨率研究早期 T 细胞活化和形成。

虽然这些方法已经允许充分组装的优秀可视化是, 许多信号跟随 TCR: 抵押贷款公司结扎发生在几秒钟之内, 复杂化努力确定事件序列在 TCR 活化以后准确地.为了规避此问题, 开发了一种 photoactivation 方法, 其中 photoactivatable 抵押贷款公司用于实现 TCR^激活5、6、7的时空控制.在这一系统中, T 细胞附着在含有 photoactivatable 抵押贷款公司的玻璃表面上, 而非刺激 TCR 直到紫外线 (UV) 光照射。在 t 细胞下的微米尺寸区域的紫外线照射会使 photocage 产生一个可由 t 细胞识别的刺激区。随后的信号事件和骨架重塑, 然后监测使用基因编码荧光记者。两个 photoactivatable 版本的抗原肽, 蛾细胞色素 c_88-103 (MCC) 和卵清蛋白_257-264 (卵), 这是在第二类 mhc I-E^k和类 I mhc H2-K^b分别提出, 已已开发 (图 1)。这样, 就可以对 CD4^k中特定的⁺ T 单元格进行分析 (表示5C。C7、2B4 或 TCRs) 和 CD8 OVA-H2-K^b (表示 OT1 TCR) 的⁺ T 单元格。

在过去的十年中, TCR photoactivation 和成像方法已被用来建立早期 TCR 信号步骤的精确动力学, 并确定的分子路径控制极化骨架重塑^5,6,7,8,9,10. 例如, 这项化验有助于确定中心体转向 APC 的方向是由甘油中心的脂质第二信使的局部梯度介导的。预计这种方法将继续对要求高分辨率的 T 细胞功能成像分析的应用有价值。

Protocol

1. 制备刺激性玻璃表面

1. 涂层八井腔 coverglass 与生物素化聚 l-赖氨酸 (生物锁相环) 稀释1:500 在蒸馏, 去离子水 (_ddH2 O)。室温下孵育30分钟 (RT)。
2. 使用 H₂进行清洗。
3. 在 RT 干燥2小时。
4. 块生物锁相环涂层表面与阻塞缓冲 (HEPES 缓冲盐水 [10 毫米 HEPES pH 值 7.4, 150 毫米氯化钠], 与 2% BSA) 为30分钟在 RT。
   1. 将5毫克的聚 l-赖氨酸氢溴酸盐溶于1毫升的10毫米矫正假肢₄, pH 8.5。
   2. 添加125μmol (0.55 毫克) 的 NHS-生物素 (从100毫克/毫升的股票在亚砜) 和检查的 pH 值的反应。如果 ph 值低于 8.5, 则添加 2 ul 4 N 氢氧化钠, 将其提高到 ph 值8.5 和9.5 之间。
   3. 涡流为30分钟。
   4. 淬火反应与 50 ul 100 毫米甘氨酸溶解在20毫米三 pH 值8.0。
   5. 全功率旋转10分钟, 将上清液转移到新管上。
      注: 生物锁相环的质量通常与以前的制剂相比, 通过将材料的两倍稀释涂敷在96井 ELISA 板上, 并用碱性磷酸酶结合链亲和素进行孵化后定量化素含量。
5. 删除阻止缓冲区。不要让水井干。添加链亲和素 (100 µg/毫升在阻塞缓冲区)。在4摄氏度孵育1小时。
6. 在哈佛商学院洗。填充和反转室滑井 4-5 次, 从井中删除哈佛商学院。不要让水井干。
7. 将生物素化抵押贷款公司配体和黏附分子添加到表面。
   注意: 可通过将邻硝基保护组 (例如, nitrophenylethyl (photocaged) 或 nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) 添加到关键 lysines (mcc, K12 在卵中 K7) 的ε氨基组中, 来 MCC 和卵子。Photocaged MCC 和卵子可以从商业供应商获得。重建后的水缓冲, 他们被折叠到细菌表达的 I E^k和 H2-K^b使用已建立的方法^11,12。
8. photoactivatable MCC 或卵肽的验证
   1. Decage NVOC 保护肽通过紫外线照射与手持紫外线灯 (见材料表) 在 RT 20 分钟。
   2. 脉冲 1.0 x 10⁵ apc 与1µM nonstimulatory 肽 (阴性控制,例如Hb), 非辐照 photoactivatable 肽, 辐照的 photoactivatable 肽, 和激动肽 (正控制, 例如, MCC) 为 1 h 到隔夜在37°c。
   3. 刺激 T 细胞表达5C。C7/2B4/AND TCR, 使用 CH12 或 CH27 B 细胞。为了刺激 OT1 T 细胞, 使用 RMA 或 EL4 胸腺瘤细胞。
   4. 将脉冲 apc 与相同数量的 T 细胞在96井圆底板上混合, 最终体积为200µL. 孵育37°c 为 12-24 h。
   5. 用链亲和素-辣根过氧化物酶比色检测法, 从各井中恢复上清液, 并进行酶联免疫分析 IL-2。
      注: 强烈建议通过电喷雾质谱法确认所有肽的锁定状态, 然后再复性为 MHC 复合体。
9. 对 MHC 进行折叠和纯化, 以尽量减少光照射。例如, 用铝箔包裹折叠反应, 用 UV 灯关闭凝胶过滤层析。
   注: 发现 photoactivatable^k和卵 H2-K^b在高密度下诱导紫外独立 T 细胞活化, 可能是由于功能不完全的锁定。因此, 在固定化步骤中, photoactivatable 抵押贷款公司被稀释成 10 30x 以上的 nonstimulatory 抵押贷款公司 (例如^I -e k,_其中包含血红蛋白64-76 肽 (Hb))。这提高了后续成像实验的信噪比。
10. 若要 photoactivate CD4⁺ T 单元格, 请集体使用生物素^化k (3 µg/毫升)、生物素化 photoactivatable^MCC -e k (0.1 µg/毫升) 的混合物, 并对 i^类MHC 生物素化 k (0.5 H2-K/mL). anti-H2-K^K抗体鼓励5C。C7/2B4/AND T 细胞, 表达 H2-K^K, 扩散到玻璃表面而不进行激活。
11. 对于 CD8⁺ T 单元格, 请使用生物素化^H2-D b 的混合体, 其含肽 KAVYDFATL (1 µg/毫升)、生物素^化photoactivatable OVA-H2-K b (0.1 µg/毫升) 和黏附分子 ICAM-1 的胞外域 (2 µg/毫升由昆虫细胞培养产生的¹³)。ICAM-1 通过将整合素 LFA1 在 T 细胞表面上, 鼓励紧密的接触形成。
12. 将所有蛋白混合物应用于阻塞缓冲液中, 然后在 RT 中孵化1小时, 或至少2小时4摄氏度。
    注: 此类表面的分子密度为每µm²的 8000, 以前已确定为⁶。鉴于 photoactivatable 抵押贷款公司代表了生物素化蛋白在表面上^的~ 1/30 th, 它的密度将是 decaging^之前每µm 2 的267个分子。
13. 在步骤1.6 中进行清洗, 并在哈佛商学院离开, 直到准备使用。
14. 将 20万 CD4⁺或 CD8⁺ T 单元格表示为每个井中适当的 TCR, 并允许单元格在37摄氏度内坚持15分钟。一旦细胞在表面上附着并扩散, 它们就可以 photoactivation 和成像。
    注: 荧光成像探针对效应 T 细胞的逆转录病毒转导, 详细描述 elswhere^6,7。钙信号也可以研究使用 untransduced T 细胞加载的钙敏感染料 Fluo-4⁶。比例染料 Fura-2 是不推荐的, 因为它需要在紫外线范围内的激发, 这也诱导 decaging photoactivatable 抵押贷款公司。

2. 图像采集

1. 使用带有 UV 兼容150X 物镜的倒置 TIRF 显微镜进行图像采集。紫外线照射用户定义的区域使用一个数字隔膜系统连接到 100 W 汞灯 (HBO)。使用 400 nm 长的后视镜将这盏灯上的紫外线直接照射到样品上。
2. 使用图像分析软件进行局部 photoactivation 和时间推移采集。在大多数实验中, 分别使用 488 nm 和 561 nm 激发激光器对绿色和红色通道中的探头进行监测。激光光被定向到样品上, 使用双通带分色镜, 也传输在紫外线范围 (以使 decaging)。有关显微镜配置的其他信息, 请参阅材料表和图 6 。
3. 安装包含 T 单元格的会议厅幻灯片后, 根据需要调整设置以获得 TIRF 或荧光照明。在 "实时" 模式下, 选择表示感兴趣的荧光探针的单元格字段。使用软件控制建立单个细胞下 photoactivation 的微米尺度区域。
4. 开始时间推移获取。通常, 获取 80 timepoints, 每个时间点之间间隔为5秒。在双色实验的情况下, 这给连续 488 nm 和 563 nm 曝光留下了足够的时间。
5. 10 timepoints 后, 通过打开数字隔膜快门 1-1.5 s, photoactivate 选定区域。
6. 完成时间后, 选择一个新的单元格字段并重复该过程。

3. 数据分析

注: 固定化配体的局部 photoactivation 创建一个定义良好的固定刺激区域, 可用于定量分析信号响应和骨架重塑事件。分析协议通常涉及在辐照区域内量化荧光强度, 或者使用辐照区域作为距离测量的位置端点 (e. g. 用于评估中心体的偏振度到辐照区域)。下面介绍两种分析协议。各种交互式图像分析程序可用于进行强度和距离测量, 然后可以输出以进行额外的处理和分析。

1. 荧光强度
   1. 确定单元格外部的背景区域 (fi_b) 的荧光强度 (fi)。这将用于背景更正。
      1. 在单元格外绘制一个微米大小的正方形区域并制作一个面具。要确定荧光强度, 请单击分析 |掩码统计信息。选择平均值荧光强度并导出值。
         注意: 过程详细信息 (例如3.1.1.1) 引用 Slidebook 软件 (请参阅材料表)。使用其他软件包 (e. g) 实现此协议将稍有不同。
   2. 确定每个时间点的光活化作用区域内的 FI。
      1. 选择掩码以突出显示光活化作用的区域。要确定荧光强度, 请单击分析 |掩码统计信息。选择平均值荧光强度并导出值。
   3. 从区域内的实测 fi 值中减去背景 fi。然后, 通过在 photoactivation 前9帧的平均、背景校正 fi 划分, 使校正后的 fi 测量正常化。ΔF = (fi_b)/平均 (fi_1-9)-fi_b))。
      注: 图ΔF 作为时间的函数。
2. 距离
   1. 获取光活化作用区域中心的 x 和 y 坐标。
      1. 要确定光活化作用区域中心的 x 和 y 坐标, 请选择掩码以突出显示光活化作用的区域。突出显示 photoactivation 区域后, 选择分析 |面具统计 |区域中心并导出值。
   2. 确定每个时间点感兴趣的荧光探针的 x 和 y 坐标。这通常是通过手动或自动粒子跟踪实现的。
      1. 要确定感兴趣的荧光探针的 x 和 y 坐标, 请选择手动粒子跟踪, 然后单击感兴趣的荧光探针。跟踪所有时间点后, 选择分析 |面具统计 |区域中心并导出值。
   3. 使用等式计算每个时间点的荧光蛋白与光活化作用区域中心的距离: 距离 = √ (_x2-_x1⁾2 + (_y2 1⁾2),其中 x₂和 y₂是感兴趣的荧光蛋白的坐标, x₁和 y₁是光活化作用区域中心的坐标。
   4. 将距离图作为时间的函数。

Results

photoactivation 和成像方法允许观察和简便量化快速, 极化信号响应。为了说明它的能力, 这里转载的是一个实验, 研究了 TCR 诱导的中心体的时空关系。5C。C7 T 细胞爆炸是 retrovirally 转基因与两个荧光记者: 一项由蛋白激酶 C-θ链接到与 GFP (C1-GFP) 和 RFP 蛋白的串联 C1 域的一台检测生物传感器, 以监测中心体。然后将 T 细胞连接到包含 photoactivatable coverglass^k的腔内。C1-GFP 在荧光模式下使用 TIRF 显微镜和 RFP 蛋白进行成像。如图 2所示, T 单元格下表面的局部 photoactivation 诱导了在辐照区域中的 a 的堆积。这在几秒钟之内被跟随中心体的重新定位到同一个区域。

C1-GFP 积累可以通过计算的规范化荧光强度, 经过背景校正后, 在光活化作用区域的...

Discussion

近年来, 光已成为 spatiotemporally 控制激活细胞过程的绝佳工具。开发了各种方法, 各有关联的优缺点。这里描述的系统, 这是基于 decaging 的固定化, 胞外配体, 是非常适合分析快速, 亚细胞, 极化信号响应。这种方法已被应用于检测 T 细胞的形成, 如上文所述。此外, 其他受体的笼型配体已被设计, 使我们能够应用同样的策略来评估自然杀伤细胞中的抑制信号和转录因子 NF-nf-κb 的核易位, 以回应像受体信号^14,15。

在这个协议中, 刺激配体被固定, 以确保它们在成像实验期间保持为固定的、极化的激励源。这种方法非常适合于细胞极化的研究。然而, 应该指出的是, TCR photoactivation 方法很容易适应于世俗控制的 T 细胞活化在支持的脂质双层。显然, 在这种情况下, 人们无法实现持续的极化刺激。然而, 鉴于实验目标, 这可能是不必要的。

对于 decaging 的紫外线...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nunc Lab-Tek 腔室盖玻片	Thermofischer Scientific	155361
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma-Aldrich	P2636	需要制造生物素化聚-L-赖氨酸
EZ-Link NHS-生物素	Thermofischer Scientific	20217	需要制造生物素化聚-L-赖氨酸
链霉亲和素	Thermofischer Scientific	434301
BirA-500：BirA 生物素-蛋白连接酶标准反应试剂盒	Avidity	BirA500	将用于生物素化蛋白质
生物素化 Hb I-EK			关于蛋白质折叠，参见参考文献 6。对于生物素化，使用 BirA 试剂盒
生物素化 NPE-MCC I-EK	Anaspec		定制 NPE-MCC （H-ANERADLIAYL-K（Nvoc）-QATK-OH） 可从 Anaspec
生物素化和 α 处购买;H2-Kk抗体	BD Biosciences	553591
生物素化 NPE-OVA H2-Kb	Anaspec		定制 NPE-OVA （H-SIINFE-K（Nvoc）-L-OH） 可从 Anaspec
生物素化 KAVY H2-Db  购买;	Anaspec		定制合成蛋白 （KAVYDFATL） 可从 Anaspec
生物素化 ICAM1 购买			对于蛋白质折叠，请参阅实验步骤中的参考文献。对于生物素化，使用 BirA 试剂盒
手持式紫外灯	UVP	UVGL-25	灯距离样品 < 1 cm.  30 秒的 365 光足以进行可检测的去壳，20 分钟用于定量去壳。
奥林巴斯 IX-81 OMAC TIRF 系统。	奥林巴斯		成像系统的其他信息，请参见Figure 6
Mosaic 数字光阑	Andor
幻灯片软件	Intelligent Imaging Innovations