建立细胞外酸性pH培养系统

摘要

酸性肿瘤微环境在肿瘤进展中发挥关键作用。为评估酸性细胞外pH值对癌细胞的影响 体外 我们建立了简单的酸性培养体系。

摘要

肿瘤微环境的条件（如缺氧或营养缺乏）在癌症进展和恶性转化中起着关键作用。然而，与缺氧或营养缺乏条件相比，细胞外酸性pH在肿瘤侵袭性中的作用及其潜在机制尚未得到充分研究。此外，目前尚未有明确定义的培养方法用于模拟细胞外酸性肿瘤微环境。

这里我们介绍一种简单的方法 体外 采用减少碳酸氢盐并增加乳酸或盐酸浓度的培养基来维持酸性细胞外pH的培养方法。该培养基的pH值在PANC-1和AsPC-1胰腺癌细胞培养中至少可维持24小时，并在72小时后逐渐下降。本研究中的三种不同酸性培养条件显著上调了pH响应基因，例如 MSMO1, INSIG1，以及 IDI1 与缺氧或营养缺乏相比. 这些基因的上调可作为酸性pH的标志物。这些简单技术有助于阐明肿瘤在酸性肿瘤微环境下的恶性机制。因此，我们的细胞外酸性pH培养系统不仅可用于发现癌细胞对酸性pH的细胞反应，还可用于研究与糖尿病酮症酸中毒、乳酸酸中毒、肾小管酸中毒和呼吸性酸中毒等其他酸性紊乱相关的原代细胞（如肾小管上皮细胞）的酸性pH响应。

引言

肿瘤微环境在肿瘤进展和癌细胞代谢中发挥着关键作用^1,2,3。癌细胞常常暴露于缺氧、营养缺乏以及酸性细胞外pH（pHe）等条件下。然而，与缺氧或营养剥夺相比，pHe在肿瘤进展中的作用尚未被充分阐明。肿瘤组织中的pHe可呈酸性，最低可达约pH 6.8^4,5。这种酸性pH主要源于增殖的癌细胞通过有氧和无氧糖酵解过程排出质子（H⁺）和乳酸所致^5,6。

近期研究表明，细胞外酸化可诱导组蛋白去乙酰化、脂肪酸氧化以及酸性溶酶体的胞吐作用，以适应严苛的酸性环境^7,8,9,10。然而，细胞外酸化如何影响肿瘤细胞行为的机制，以及酸性pH肿瘤微环境中关键调控因子的身份，尚未完全明确。此外，已有多个研究报告采....

方案

1. 酸性培养基的制备

1. 对照（pH 7.4）和低pH（pH 6.8）培养基的制备
   1. 将4.75 g不含L-谷氨酰胺的DMEM粉末溶解于500 mL水中。
   2. 在耐压瓶中配制0.33 M NaHCO₃溶液。
      注意：必须使用耐压瓶，因为NaHCO₃在加热并发生热分解时会释放CO₂气体。
   3. 对培养基和溶液进行高压灭菌，并使其冷却至25 °C。
   4. 向500 mL不含碳酸氢盐的DMEM中加入5 mL 200 mM L-谷氨酰胺、5 mL青霉素-链霉素溶液和50 mL胎牛血清。
   5. 对于对照组（pH 7.4）培养基，每100 mL不含碳酸氢盐的DMEM中加入2.4 mL 0.33 M NaHCO₃溶液；对于低pH（pH 6.8）培养基，每100 mL不含碳酸氢盐的DMEM中加入0.6 mL 0.33 M NaHCO₃溶液。
   6. 将培养基在37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时后检测其pH值。
      注：所需添加的NaHCO₃溶液体积需根据培养基实际pH值进行调整，而该pH值可能因培养箱内CO₂浓度和大气压的不同而有所变化。理想情况下，首次操作时应使用不同浓度的碳酸氢盐溶....

结果

为了确定合适的碳酸氢盐浓度，我们配制了含 0 - 8 mM NaHCO₃（培养基中的终浓度）的 DMEM，并成功制备出 pH 范围为 6.4 - 7.4 的培养基（图 1）。根据先前报道中指出实体瘤的细胞外 pH 可达 6.8，我们以含 8 mM NaHCO₃ 的 DMEM（pH 7.4）作为对照培养基，以含 2 mM NaHCO₃ 的 DMEM（pH 6.8）作为酸性 pH 培养基^4,5。在 PANC-1 和 AsPC-1 细胞培养过程中，酸性培养基的 pH 在 24 小时内保持稳定，并在 72 小时内逐渐下降至约 pH 6.6（图 2）。接下来，为了确定将对照培养基（pH 7.4）调节至 pH 6.8 所需的乳酸或 HCl 用量，我们在对照培养基中加入不同量的乳酸或 H.......

讨论

在此，我们描述了一种简单的酸性pH培养体系及其评估流程。该体系结合了三种培养基酸化方法， 即降低碳酸氢盐浓度、添加乳酸以及添加盐酸，使我们能够深入研究pH响应机制，并将细胞对其他肿瘤微环境条件（如缺氧或营养缺乏）的反应进行比较。

该方法的关键在于确定培养基中碳酸氢盐、乳酸和盐酸的适当浓度。首次使用该方法时，通过检测不同碳酸氢盐浓度下的培养基pH值，以确定培养基中NaHCO₃的合适添加量，这一点非常重要。在此过程中，必须在37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时后测定培养基的pH值，因为培养基温度和CO₂的平衡状态会显著影响其pH值。通常建议对碳酸氢盐溶液进行高压灭菌，因为碳酸氢盐容易分解失效。细胞密度和细胞融合度是关键因素，因为大量增殖的癌细胞即使在对照样本中也容易使培养基酸化。此外，细胞对外界酸性pH的反应依赖于细胞状态，并可能随着传代次数增加而减弱，因此实验中使用的细胞传代次数均少于10代。

我们的方法已显著证明培养基 pH 值在 24 .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
Dulbecco's Modified Eagle Medium“Nissui” 2	Nissui	05919
胎牛血清	Thermo Fisher	10438
NaHCO3	Wako	191-01305
L-谷氨酰胺溶液	Thermo Fisher	25030-081
青霉素-链霉素混合溶液（稳定型）	Nacalai	09367-34
含酚红的0.5 g/L胰蛋白酶/0.53 mmol/L EDTA溶液	Nacalai	32778-05
0.5%台盼蓝染色液	Nacalai	29853-34
乳酸溶液	Sigma-Aldrich	252476
盐酸溶液	Sigma-Aldrich	H9892
RNeasy Plus Mini Kit	QIAGEN	74134
SuperScript IV 第一链合成系统	Thermo Fisher	18091
Power SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4368702
名称	公司	目录编号	备注
细胞系
PANC-1	ATCC	CRL-1469
AsPC-1	ATCC	CRL-1682
KMS-6	JCRB Cell Bank	JCRB0432
TIG	JCRB Cell Bank
MRC9	ATCC	CCL-212
HUVEC	ATCC	CRL-1730
名称	公司	目录编号	备注
设备
NanoDrop One 微量紫外-可见分光光度计（带Wi-Fi）	Thermo Fisher	ND-ONE-W
QuantStudio 5 实时荧光定量PCR系统	Thermo Fisher	CRL-1682