我们介绍了从肠道中分离三维结构的实验方案 体内 组织和 体外 嵌入基底膜基质的类器官，并详细说明针对微管、中心体和连接蛋白以及包括干细胞蛋白Lgr5在内的细胞标志物进行免疫标记的不同固定和染色方案。
本文内容
摘要
摘要
3D 技术的出现 体外 类器官，模拟 体内 组织结构与形态发生的研究极大地推动了细胞生物学和发育生物学中关键生物学问题的探索。此外，类器官结合基因编辑和病毒介导基因递送技术的最新进展，有望促进疾病治疗相关新药的研发和医学研究的进步。类器官的培养 体外 在基底膜基质中提供了研究各种蛋白质行为与功能的有力模型系统，且非常适合对荧光标记蛋白进行活体成像。然而，在内源性蛋白质中建立其表达与定位 离体 组织及在 体外 类器官对于验证标记蛋白的行为至关重要。为此，我们开发并改进了组织分离、固定和免疫标记方案，用于微管、中心体及相关蛋白的定位分析 离体 肠组织及在 体外 肠道类器官。目的是使固定剂在保存类器官/组织三维结构的同时，维持抗原的抗原性，并确保固定剂和抗体具有良好的渗透与清除效果。低温处理会导致除稳定微管以外的所有微管发生去聚合，这是优化各实验方案时的关键因素。我们发现，将乙二胺四乙酸（EDTA）浓度从3 mM提高至30 mM，可有效分离小肠中的绒毛和隐窝，而结肠隐窝则仅需3 mM EDTA即可充分解离。所建立的甲醛/甲醇固定方案在良好保存结构的同时，也保留了抗原性，能够有效标记微管、肌动蛋白及末端结合（EB）蛋白。该方案同样适用于中心体蛋白ninein的标记，尽管甲醇固定方案的结果更为稳定一致。我们进一步证实，无论是从基底膜基质中分离的类器官，还是仍保留在基底膜基质中的类器官，均可实现微管及其相关蛋白的固定与免疫标记。
引言
上皮细胞形成具有顶-基底极性是发育过程中的一个基本事件，涉及微管和中心体蛋白的显著重排。在许多动物细胞中，微管组织中心（MTOC）位于细胞中央，由此发出辐射状微管阵列，这种结构适合相对扁平的细胞。相比之下，柱状上皮细胞（如肠上皮细胞）则组装非辐射状的跨细胞微管阵列，更有利于维持这些细胞的形态及其特化功能。这种微管系统的显著重组是通过中心体移向细胞顶面，并在顶面形成非中心体微管组织中心（n-MTOCs），从而负责锚定跨细胞微管来实现的1,2,3,4,5。
我们对上皮细胞分化及其相关微管重组的许多认识均来自对二维（2D）体系的研究 体外 不显示的细胞层 体内 组织结构。三维结构的发育 体外 类器官培养技术，由 Clevers 及其同事首创6，代表了一项重大的技术进步，因为它们能够模拟 在体 结构与发育。肠道中表现出明显的上皮细胞分化层级：位于隐窝底部的干细胞产生未成熟的过渡扩增细胞，这些细胞在增殖后逐渐向上迁移至小肠绒毛或结肠表面，在此过程中逐步分化，最终在脱落进入肠腔前达到完全分化状态7重要的是，在肠道类器官中也观察到相同现象：来自干细胞微环境的细胞增殖形成囊状结构，随后产生类似隐窝的芽状结构，其底部为干细胞，分化逐渐向囊状区域延伸，该区域最终形成类似绒毛的结构。8因此，肠道类器官不仅为研究上皮细胞分化过程中微管和中心体的重组提供了有力的模型，还可用于研究多种其他蛋白质，同时为筛选具有潜在治疗价值的药物和食品化合物提供了理想的平台9,10.
类器官非常适合对荧光标记蛋白进行活体成像，且可通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建敲入和敲除类器官11,12。然而，在研究内源性蛋白的表达与定位时，明确其表达情况尤为重要，特别是用于验证标记蛋白的行为。相较于在二维培养皿中生长的细胞，对在基底膜基质中培养或ex vivo分离的三维类器官进行免疫标记更为复杂。固定方案需在保持抗体抗原性（即抗体结合的表位）的同时，保留类器官精细的三维结构。例如，4%多聚甲醛（PFA）常被用作固定剂，虽然其固定作用相对较快且能良好地保存形态结构，但根据我们的经验，它常导致抗原性丧失，不适用于许多中心粒抗体。此外，还需考虑固定剂和抗体对三维结构和组织的穿透能力。为此，我们改进并开发了适用于三维in vitro类器官及ex vivo分离肠道组织的组织分离与间接免疫标记方案。本文描述了小肠隐窝与绒毛以及结肠组织的分离方法，并提供了一种将三维类器官分离后再进行固定的替代方案，而非直接在基底膜基质中固定和免疫标记。我们提出了三种不同的固定方案，适用于微管和中心粒蛋白（如ninein）以及微管正端追踪蛋白（+TIPs，如EB蛋白和CLIP-170）的免疫标记（另见参考文献8,13）。同时，我们也讨论了每种方案的优缺点。
方案
此处描述的所有方法均根据东英吉利大学的机构许可指南进行。
1. 肠道组织的分离
- 用于免疫标记的结肠隐窝分离（参见 图1，示意图
- 处死小鼠（使用 CO2 窒息）后，使用解剖剪和镊子从盲肠开始向尾侧方向取出结肠14.
- 用带有橡胶吸头的玻璃移液管以磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗结肠内容物。PBS：氯化钠（8.0 g/L）、氯化钾（0.2 g/L）、磷酸氢二钠（1.15 g/L）和磷酸二氢钾（0.2 g/L），pH 值为 7.3。
- 使用金属棒（直径2.4 mm）或玻璃移液管末端，固定结肠管的一端，然后轻轻将组织沿金属棒或移液管滑动，使结肠组织外翻，上皮朝外。
注意：如果无法实现，则用剪刀打开结肠，并切成5 mm的片段。 - 将翻转的结肠或结肠片段转移至含有40 mL PBS的50 mL锥形管中。
- 反复倒置试管数次，以进一步去除肠内容物和黏液， 等等。
- 将结肠/组织块转移至含有40 mL 3 mM EDTA的PBS溶液中，室温（RT）孵育15分钟。
注意：用 PBS 稀释 0.5 M EDTA（pH 8.0）贮存液。 - 振荡以去除黏液，将结肠/组织片段转移至含有40 mL PBS中3 mM EDTA的新鲜溶液的50 mL锥形管中。室温孵育35分钟。
- 将结肠组织/组织块转移至含有10 mL PBS的50 mL锥形管中，剧烈振荡30秒以释放隐窝（隐窝组分）。
- 将结肠组织/组织块从离心管中取出，并放回3 mM EDTA溶液中，以备后续可能需要的进一步分离。将剩余的隐窝组分在300 × g下离心5分钟。
- 移除5 mL上清液，并将隐窝沉淀物重悬于剩余的5 mL液体中。
- 在体视显微镜下观察，放大倍数为50 - 100倍 放大）以检查结肠隐窝的存在情况。
注意：若无隐窝存在，则将结肠/组织块在 PBS 中含 3 mM EDTA 的溶液中继续孵育 30 分钟，然后重复步骤 1.1.8 - 1.1.11。 - 将隐窝组分在300 × g下离心5分钟。
- 移除所有上清液以获得隐窝沉淀物，并立即进行固定（第3节）。
- 小肠隐窝和绒毛的分离用于免疫标记（图2)
- 安乐死小鼠（使用 CO2 窒息）后，使用解剖剪和镊子取出小肠（从近端十二指肠至末端回肠）14.
注意：如需观察小肠的不同节段，此时应将其分别分离并单独处理。参见 图1 和 表1 流程图及时间安排。 - 使用带橡胶球的玻璃移液管，以 PBS 冲洗小肠内容物。
- 用解剖剪剪开小肠，放入盛有15 mL PBS的培养皿中。
- 用 PBS 轻柔冲洗肠道以去除管腔内容物，同时避免损伤黏膜表面。将组织转移至新的培养皿中，并重复 PBS 冲洗。
- 将肠道切成3-5 mm的小段，转移至含有15 mL PBS中30 mM EDTA的100 mm培养皿中，在室温下孵育5分钟。或者，在PBS中3 mM EDTA中孵育30分钟。
- 第1组分（绒毛分离）：将肠组织碎片转移至50 mL锥形管中的10 mL PBS中，剧烈振荡10秒，然后倒入100 mm培养皿中。在体视显微镜下检查该组分中是否含有分离的绒毛。此阶段应主要为绒毛，但不同分离操作之间可能存在差异。
注意：为防止孤立的绒毛/隐窝粘附在塑料表面，应预先用胎牛血清（FBS）包被培养皿和收集管。将FBS倒入培养皿和/或管中，随即弃去。参见 表1 各组分的时间参考指南。 - 将肠段重新转移至含 PBS 的 30 mM EDTA 溶液中，孵育 5 分钟。在此孵育期间，收集组分 1 至预先用 FBS 包被的 15 mL 圆锥形离心管中，于 300 × g 离心 5 分钟。
- 第2组分：将肠段转移至含有10 mL PBS的50 mL锥形管中，剧烈振荡20秒，然后倒入100 mm培养皿中。在显微镜下检查该组分。通常在此阶段可观察到绒毛和隐窝的混合培养物（图 2A).
- 将肠段重新转移至含30 mM EDTA的PBS中，继续孵育5分钟。在此期间，将第2组分在15 mL圆锥形离心管（预先用FBS包被）中于300 × g离心5分钟以收集沉淀。弃去第1和第2组分的上清液，注意勿扰动沉淀，立即进行固定处理（步骤3）。
- 第3组分（隐窝分离）：将肠段转移至50 mL离心管中的10 mL PBS中，振荡20秒，倒入100 mm培养皿中。在显微镜下检查该组分。此阶段，该组分主要含有肠隐窝（crypts）图2B).
- 第4组分：将肠段转移至10 mL PBS中，振荡20秒，倒入100 mm培养皿中。在显微镜下检查该组分。此阶段应仅存在隐窝。
- 第5组分：将肠段转移至10 mL PBS中，振荡20秒，倒入100 mm培养皿中。在显微镜下检查该组分。通常在此阶段仅能提取极少量隐窝。若提取到的隐窝数量超过少量，则继续进行第6组分th 组分
注意：如果需要获得纯的隐窝细胞群（例如用于类器官培养），则使用70 µm细胞筛网从富集隐窝的组分中去除任何完整的绒毛。 - 分别收集第3至第5组分至15 mL离心管中，300 × g离心5分钟。
- 检查第3至第5组分的沉淀物，去除上清液时避免扰动沉淀，随后立即进行固定（第3节）。
- 安乐死小鼠（使用 CO2 窒息）后，使用解剖剪和镊子取出小肠（从近端十二指肠至末端回肠）14.
2. 从24孔板中基底膜基质圆顶分离肠道类器官
注意：类器官在基底膜基质圆顶中的形成方法已在其他文献中描述12。
- 根据制造商说明书，用基底膜基质在孔中形成凝胶 dome 结构。
- 用 500 µL PBS 洗涤含有基底膜基质 dome 的孔。
- 向每个孔中加入 250 µL 冷的细胞回收溶液（4 °C）（参见 材料表）。
注意：低温的细胞回收溶液将解聚除稳定微管外的所有微管结构。 - 使用 P1000 移液器刮取基底膜基质 dome，并在孔内轻柔反复吹打，以破碎并从塑料表面分离基底膜基质。
- 将上清液收集至 1.5 mL 低吸附微量离心管中。
- 将 1.5 mL 低吸附管轻轻倒置数次，在显微镜下检查类器官是否已成功分离，是否自由移动且未形成团块。将管置于体视显微镜下，以低倍（50X）观察。
- 在室温下以 1,000 × g 离心 5 分钟，沉淀类器官。
- 去除回收试剂后，立即进行固定（步骤 3）。
3. 分离肠组织和类器官的固定
- 甲醇固定
- 将分离的肠隐窝/绒毛组分重悬于 10 mL 甲醇中，类器官重悬于 1 mL 甲醇中，甲醇预冷至 -20 °C。
- 将隐窝/绒毛/类器官置于 -20 °C 冰箱中孵育 15 分钟，每隔 5 分钟颠倒离心管一次。
- 以 1,000 × g 离心 5 分钟，沉淀隐窝/绒毛/类器官。
- 吸除甲醇，加入洗涤液（类器官加 1 mL，分离的隐窝/绒毛组分加 10 mL）。洗涤液可为含 1% 血清的 PBS，或含 0.1% 去垢剂和 1% 血清的 PBS。
注：使用与二抗同源物种的血清。例如，若二抗来源于山羊，则使用山羊血清。 - 立即以 1,000 × g 离心 5 分钟，沉淀隐窝/绒毛/类器官。
- 吸除洗涤液，将隐窝/绒毛/类器官重悬于新鲜洗涤液中。
- 将离心管置于旋转仪上，转速设为 20 rpm，总洗涤时间为 1 小时，每 15 分钟离心一次（1,000 × g，5 分钟），沉淀隐窝/绒毛/类器官，并更换洗涤液。
注：若无旋转仪，可每隔 5 分钟手动颠倒离心管，以重悬分离的培养物。
- 甲醛/甲醇固定
注：固定剂和甲醛操作应在通风橱中进行。- 将分离的隐窝/绒毛重悬于 10 mL、类器官重悬于 1 mL 预冷至 -20 °C 的固定液（9.2 mL 甲醇加 800 µL 甲醛溶液）中。
- 将隐窝/绒毛/类器官在 -20 °C 冰箱中固定 15 分钟，每隔 5 分钟颠倒离心管一次。
- 以 1,000 × g 离心 5 分钟，沉淀隐窝/绒毛/类器官。
- 吸除甲醛/甲醇，加入洗涤液（类器官加 1 mL，分离的隐窝/绒毛组分加 10 mL）。洗涤液可为含 1% 山羊血清的 PBS，或含 0.1% 去垢剂和 1% 血清的 PBS。
- 以 1,000 × g 离心 5 分钟，沉淀隐窝/绒毛/类器官。
- 吸除洗涤液，重悬于新鲜洗涤液中。
- 将离心管置于旋转仪上，转速设为 20 rpm，总洗涤时间为 1 小时，每 15 分钟离心一次（1,000 × g，5 分钟），沉淀隐窝/绒毛/类器官，并更换洗涤液。
- PFA 固定
警示：PFA 粉末及溶液应在通风橱中操作。
注：通常使用 PBS 中含 4% PFA 的溶液，但根据抗体抗原性的保留情况，也可使用较低浓度。- 将分离并已沉淀的隐窝/绒毛重悬于 10 mL 4% PFA 中，室温孵育 1 小时；将分离并已沉淀的类器官重悬于 1 mL 4% PFA 中，孵育 30 分钟。两种情况下均每隔 10 分钟颠倒离心管一次。
- 以 1,000 × g 离心 5 分钟，沉淀隐窝/绒毛/类器官。
- 吸除 PFA，加入洗涤液（类器官加 1 mL，分离的隐窝/绒毛加 10 mL）。洗涤液为含 0.1% 去垢剂和 1% 血清的 PBS。
- 以 1,000 × g 离心 5 分钟，沉淀隐窝/绒毛/类器官。
- 吸除洗涤液，重悬于新鲜洗涤液中。
- 将离心管置于旋转仪上，转速设为 20 rpm，总洗涤时间为 1 小时，每 15 分钟离心一次（1,000 × g，5 分钟），沉淀隐窝/绒毛/类器官，并更换洗涤液。
注：若无旋转仪，可每隔 5 分钟手动颠倒离心管，以重悬分离的培养物。 - 抗原修复（PFA 固定推荐的可选步骤）
- 以 1,000 × g 离心 5 分钟，沉淀隐窝/绒毛/类器官，吸除上清液。
- 加入 1 - 10 mL 预热至 80 °C 的 10 mM 柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0），在 80 °C 孵育 20 分钟。
- 以 1,000 × g 离心 5 分钟，沉淀隐窝/绒毛/类器官，吸除上清液。
- 加入 1 - 10 mL 新鲜的、预热至 80 °C 的 10 mM 柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0），室温孵育 20 分钟。
- 以 1,000 × g 离心 5 分钟，沉淀隐窝/绒毛/类器官，吸除上清液。
- 用 1 - 10 mL 含 1% 血清的 PBS 洗涤，并重复洗涤 3 次，每次均通过离心（1,000 × g，5 分钟）沉淀隐窝/绒毛/类器官，再加入新鲜洗涤液。
4. 封闭步骤
- 配制封闭液：在 PBS 中加入 10% 的二抗来源物种血清（可选：加入 0.1% 去垢剂）。
- 通过离心（1,000 × g，5 分钟）沉淀隐窝/绒毛/类器官，并移除上清液。
- 根据所需样本数量加入 5–10 mL 封闭液（见下文注释）。在此步骤中，将隐窝/绒毛/类器官悬液分装至多个独立离心管中（每个 1.5 mL 低吸附微量离心管含 0.2–1 mL），用于不同抗体的染色。
注：每次分离得到的隐窝/绒毛组分可获得 5–10 个样本，具体数量取决于沉淀物的大小，可用于不同的标记组合。理想情况下，每个样本的沉淀物大小应在 2–4 mm 之间。在此阶段可合并不同组分，因为隐窝和绒毛易于识别（图 2）。 - 在室温下，使用管式旋转仪孵育封闭液 1 小时。
5. 一抗孵育
- 将一抗（参见材料表）用含10%血清和0.1%去垢剂的PBS稀释。每个微量离心管样品需要100至200 µL一抗溶液。
- 通过离心（1,000 × g，5分钟）去除封闭液。
- 将隐窝/绒毛/类器官沉淀重悬于一抗溶液中，并在4 °C下使用管式旋转仪（20 RPM）孵育过夜，以保持隐窝/绒毛/类器官处于悬浮状态。
- 次日：将样品在管式旋转仪（20 rpm）上恢复至室温，孵育1小时。
- 通过离心（1,000 × g，5分钟）收集样品，并去除一抗溶液。
- 加入1 mL洗涤液，并重悬隐窝/绒毛/类器官沉淀。
- 立即通过离心（1,000 × g，5分钟）去除洗涤液。
- 加入1 mL新鲜洗涤液，在管式旋转仪（20 rpm）上旋转孵育2小时。每30分钟通过离心更换一次洗涤液，操作同步骤5.7。
6. 二抗孵育
- 将二抗（参见材料表）用含10%血清和0.1%去污剂的PBS稀释。每个微量离心管样品约需200 µL二抗溶液。
注意：应使用高度交叉吸附的抗体，以减少二抗在小鼠隐窝/绒毛/类器官中的非特异性结合。 - 以1,000 × g离心5分钟，沉淀隐窝/绒毛/类器官，并将沉淀重悬于200 µL二抗溶液中。
- 将离心管置于摇床（20 rpm）上，室温孵育1小时。
- 以1,000 × g离心5分钟，沉淀隐窝/绒毛/类器官，并弃去上清液（未结合的二抗）。
- 将沉淀重悬于洗涤液中，立即以1,000 × g离心5分钟，沉淀隐窝/绒毛/类器官。
- 弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL新鲜洗涤液中。
- 置于摇床（20 rpm）上，室温旋转孵育1.5–2小时，每20–30分钟更换一次洗涤液，操作同前6.3–6.6步骤所述。
7. 细胞核染色
- 按照制造商说明书，将核染料（如 DAPI 或 Hoechst）用洗涤液稀释。例如：将 DAPI 储存液（20 mg/mL）按 1:10,000 比例稀释。储存液可分装后于 -20 °C 保存。
- 以 1,000 × g 离心 5 分钟，沉淀隐窝/绒毛/类器官，并去除洗涤液。
- 将沉淀物重悬于核复染液中。
- 在室温下，于试管旋转仪上以 20 rpm 转速旋转 10 分钟。
- 以 1,000 × g 离心 5 分钟，沉淀隐窝/绒毛/类器官，弃去核染液，并将沉淀物重悬于洗涤液中。
- 在室温下，于试管旋转仪上以 20 rpm 转速旋转 30 至 60 分钟，每 10 分钟更换一次洗涤液。
8. 分离隐窝、绒毛和类器官的包埋
- 以 1,000 × g 离心 5 分钟，使隐窝/绒毛/类器官沉淀，并移除所有洗涤液。
注意：如果沉淀物分散，请再次离心。 - 向沉淀物中加入两滴含抗荧光淬灭剂的硬性封片介质。
- 剪去 P200 移液枪吸头末端，小心地将沉淀物重悬于封片介质中，避免产生气泡。
注意：分离得到的类器官培养物具有很强的黏性；务必充分重悬。 - 使用移液枪将隐窝/绒毛/类器官与封片介质的混合液转移至载玻片中央，沿中心线状点样。
注意：线条长度不应超过即将使用的盖玻片长度。使用体视显微镜检查隐窝/绒毛/类器官是否在载玻片上均匀分布，无团聚现象。 - 小心地将盖玻片覆盖于样品上方，避免产生气泡。
- 将载玻片放入玻片盒中，置于冰箱内过夜，使封片介质充分固化，之后再进行共聚焦显微镜分析。
注意：对小鼠组织进行小鼠源抗体染色时，使用商用免疫荧光试剂盒（见材料表）。将第 4 步的封闭步骤替换为：先用蛋白封闭液封闭 10 分钟，再加入试剂盒提供的封闭试剂孵育 1 小时。然后在第 5.8 步（洗涤过程中）加入荧光信号增强试剂，孵育 1 小时。随后将试剂盒中的试剂用荧光稀释液稀释（也可将其他二抗与此试剂联合使用），按前述方法孵育，并从第 6 步起继续完成后续实验流程。
9. 类器官在基底膜基质内的固定与免疫标记
注意：用于固定和免疫标记且保留在基底膜基质中的类器官，是在24孔板中的圆形玻璃盖玻片上形成基底膜基质小滴（每孔一个）后生成的。类器官的基底膜基质小滴在24孔板中通过添加和移除各种溶液进行处理。
- 从孔中移除培养基，并加入固定剂；静置 1 小时。
- 移除固定剂，用含有 1% 血清和 0.1% 去垢剂的 PBS 洗涤 2 小时，每 30 分钟更换一次洗涤液。
- 移除洗涤液，用含 10% 血清和 0.1% 去垢剂的 PBS 封闭 1 小时。
- 将抗体用含 1% 血清的 PBS 或含 1% 血清和 0.1% 去垢剂的 PBS 稀释。
- 移除封闭液，向每孔中加入 100 - 200 μL 一抗溶液（见材料表）。
注意：必须彻底移除所有封闭液，以避免进一步稀释抗体。 - 将培养板放入冰箱，在 4 °C 下孵育过夜。
- 随后在室温下放置 1 - 2 小时。
- 移除抗体溶液，用洗涤液洗涤 2 - 3 小时，每 20 分钟更换一次洗涤液。
- 彻底移除洗涤液，向每孔中加入 100 - 200 μL 用含 1% 血清的 PBS 稀释的二抗溶液（见材料表），在室温下孵育 1 小时。
- 移除二抗溶液，用洗涤液洗涤 2 小时，每 20 分钟更换一次洗涤液。
- 移除洗涤液，加入 DAPI 溶液，在室温下静置 10 分钟。使用 1:10,000 稀释的 DAPI 储存液（20 mg/mL）。储存液可分装后于 -20 °C 保存。
- 移除 DAPI 溶液，用洗涤液洗涤 40 分钟，每 10 分钟更换一次洗涤液。
- 用镊子取出带有基底膜基质穹顶的玻璃盖玻片，将其放置于载玻片上，使基底膜基质穹顶朝上；滴加数滴封片剂，然后盖上另一片玻璃盖玻片。
- 将载玻片放入玻片盒中，置于冰箱过夜，使封片剂充分固化。
结果
用于免疫标记的肠道组织分离
本文所述的结肠和小肠组织分离方案经过优化，旨在保存微管及其相关蛋白并进行免疫标记，但并非用于维持干细胞活性或类器官生成（图1 和 表1）。目标是获得尽可能纯净的隐窝和绒毛组分（即去除黏液及其他组织成分），同时尽量减少EDTA处理和低温暴露，以保护结构完整性，并避免使用冰冻溶液导致微管解聚——此类溶液仅能保留稳定微管，其余微管均会解聚。图2 展示了从小肠组织分离得到的第2和第3组分的图像示例，其中第2组分包含绒毛与隐窝的混合物（图2A、B），而第3组分主要为隐窝（图2C、D）。
分离肠组织的固定与免疫标记
随后对单个或合并的组分进行处理，依次经过固定、去污剂处理、封闭、抗体孵育和洗涤等步骤，完成固定与免疫标记。最后将获得的绒毛/隐窝沉淀物重悬于封片液中，转移至载玻片，并加盖盖玻片。随后使用共聚焦显微镜对隐窝和绒毛进行成像。
通过以下方法，在绒毛和隐窝中均实现了微管和肌动蛋白的良好保存与标记：在 -20 °C 下采用甲醛/甲醇固定，随后用含有 0.1% 去垢剂和 1% 血清的 PBS 反复洗涤，并在含有 0.1% 去垢剂和 10% 血清的 PBS 中封闭，接着在 4 °C 下与一抗孵育过夜，然后在室温下与二抗孵育 2 小时（图 3）。甲醛/甲醇固定法也适用于在分离的隐窝和绒毛中标记 +TIPs 蛋白，例如 EB 蛋白家族和 CLIP-170（图 4）。在隐窝中可明显观察到 EB3 在微管正端的聚集（即“彗星”结构）（图 4A），而在绒毛样本中则可见其沿稳定微管晶格的分布（图 4C）。在分离的绒毛中，CLIP-170 和 dynactin 复合物的 p150Glued 亚基在顶端 n-MTOC 处呈现出清晰的特异性定位（图 4B）。然而，使用针对小鼠 ninein 的 Pep3 抗体时，甲醛/甲醇固定法在分离的肠组织中对 ninein 的定位效果并不稳定。相比之下，在 -20 °C 下仅使用甲醇固定，再采用与甲醛/甲醇法相同的洗涤和封闭溶液，可在分离的隐窝和绒毛中获得非常理想的 ninein 定位结果（图 5；参考文献8）。有趣的是，尽管 ninein 主要富集于顶端中心体，但在部分分离隐窝细胞的基底区域也可见一定量的聚集（图 5）。这种现象是源于非特异性标记，还是由于分离过程延迟了固定（从而影响了蛋白保存），尚需进一步研究。然而，在 -20 °C 下甲醇固定的绒毛冷冻切片（见参考文献8中的图 3bi）中，某些细胞的基底部位同样检测到 ninein 的信号，提示 ninein 可能也与基底区域的一群微管存在关联。
从基底膜基质中分离类器官的固定与免疫标记
小肠类器官在基底膜基质中培养并生长三周或更长时间（图6A；参考文献6,15）。使用低温（4 °C）细胞回收溶液将类器官从基底膜基质中分离。将含有类器官的去聚合基底膜溶液转移至离心管中，在固定与免疫标记前进行离心处理。该方法可获得非常洁净的样本，并使各类溶液充分接触类器官。类器官绒毛区域内的分化细胞含有稳定的顶-基底微管结构；在大多数情况下，这些微管可被良好标记（图6B、C），EB1亦可沿微管晶格清晰可见（图6E；参考文献13）。然而，低温细胞回收溶液可能导致动态微管的去聚合，在部分样本中表现为基底隐窝区域缺乏EB1彗星状信号（EB1结合于生长中微管的正端）（图6F）。而在其他样本中，星体（动态）微管得以保留（图6D）。在固定与免疫标记前对类器官进行分离的方法，同样适用于连接蛋白、ninein、CLIP-170以及细胞标志物（如杯状细胞的黏蛋白和肠内分泌细胞的嗜铬粒蛋白A）的检测。
类器官在基底膜基质中的固定与免疫标记
图7显示了处于囊状阶段（A-C）以及隐窝发育早期阶段（D）的类器官，二者均采用甲醛/甲醇固定，并对微管和ninein进行免疫标记。微管和ninein在顶膜n-MTOCs处的标记清晰可见，表明微管结构保存良好。 图8A、B展示了第6天类器官中一个隐窝区域，采用甲醇固定方案固定，并对微管和EB1进行标记。微管和EB1彗星状结构保存良好，提示动态微管得以保留。
类器官在仍保留在基底基质中时即进行固定和免疫标记。该方法的缺点可能是固定液渗透不良，以及抗体滞留在基底基质中图 8B），尽管在固定液和/或洗涤液中添加0.1%去垢剂时，上述情况的发生频率均有所降低。此外，4% PFA 对基底膜基质的保存效果不佳，会导致其溶解，而1% PFA 的这一现象较轻。另一方面，甲醇固定有时会引起类器官塌陷。
使用某些抗体（如针对干细胞标志物 Lgr5 和潘氏细胞标志物 CD24 的抗体）对类器官进行标记时，采用 4% 多聚甲醛、甲醇或甲醛/甲醇固定方案均未获得成功。然而，在室温下使用含 0.1% 去垢剂的 1% 多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PBS）对基底膜基质中的类器官进行固定，可实现 Lgr5 和 CD24 的有效标记（图 9）。
图1：小肠绒毛与隐窝的分离。 在固定和免疫标记前，小肠绒毛和隐窝分离关键步骤的流程图。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：从小鼠小肠分离的绒毛和隐窝。 显示绒毛（大箭头）和隐窝（小箭头）的肠组织组分明场显微镜图像。（A, B）第2组分包含绒毛和隐窝的混合物，B 中可见绒毛和隐窝形态结构的完整性。（C, D）第3组分显示隐窝被成功分离，无绒毛存在，且可见完整的隐窝结构，包括 C 中的分叉隐窝。比例尺 = 500 μm（A, C）；100 μm（B, D）。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：经甲醛/甲醇固定的分离小肠绒毛与隐窝，微管和肌动蛋白免疫标记结果。（A）绒毛与隐窝上皮的示意图，标示了不同类型的细胞。高亮框表示在（B）和（C）中成像的代表性区域。（B, C）通过共聚焦显微镜获取的小肠分离绒毛（B）和基底隐窝（C）的光学切片图像。组织经30 mM EDTA分离后，用甲醛/甲醇固定，PBS（含1%山羊血清和0.1%去污剂）洗涤，再用含10%山羊血清和0.1%去污剂的PBS封闭，随后使用鼠单克隆抗微管蛋白抗体（绿色）标记微管，兔多克隆抗β-actin抗体（红色）标记肌动蛋白。在绒毛和隐窝细胞中均可见结构完整的顶-基底微管束，肌动蛋白则在朝向管腔的顶端区域富集（箭头所示）。比例尺 = 5 μm。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：经甲醛/甲醇固定的分离小肠隐窝与绒毛，进行微管、EB3、p150Glued 和 CLIP-170 的免疫标记。 从小鼠小肠分离的隐窝和绒毛区域经30 mM EDTA处理后，使用甲醛/甲醇固定，PBS（含10%山羊血清和0.1%去污剂）洗涤并封闭，随后进行免疫标记。共聚焦光学切片结果如下：（A）隐窝用兔多克隆α-微管蛋白抗体（红色）和大鼠单克隆EB3-KT36抗体（绿色）标记，并用DAPI（蓝色）染色DNA，显示顶-基底方向的微管及EB3彗星状信号。反转的单通道图像清晰显示隐窝基底部细胞中广泛分布的EB3彗星信号，提示动态和稳定微管均得到了良好保存。（B）绒毛上皮细胞用兔多克隆CLIP-170抗体（红色，参见参考文献16）和小鼠单克隆p150Glued抗体（绿色）标记，显示两者在顶端区域共定位。下方显示反转的单通道图像。（C）绒毛细胞用兔多克隆α-微管蛋白抗体（红色）和大鼠单克隆EB3-KT36抗体（绿色）标记，并用DAPI（蓝色）染色DNA，显示顶-基底方向的微管结构及沿微管晶格分布的EB3信号。放大图像突出显示EB3与微管晶格的结合，而反转的单通道图像提示EB3既存在彗星状信号，也存在晶格结合信号。比例尺 = 5 μm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：用甲醇固定的分离结肠隐窝，经ninein和E-钙黏蛋白免疫标记，并用DAPI染色。 该图显示的是通过3 mM EDTA从结肠中分离并用甲醇固定的隐窝基底层及过渡扩增区域的共聚焦光学切片。样品经含1%山羊血清和0.1%去垢剂的PBS缓冲液洗涤，并在含10%山羊血清和0.1%去垢剂的PBS中封闭。随后使用兔多克隆ninein抗体（Pep3，参见参考文献8，红色）和鼠单克隆E-钙黏蛋白抗体（绿色）对隐窝进行标记，并用DAPI染色（蓝色）。反转的单通道图像仅显示ninein信号。图像显示隐窝结构保存良好，E-钙黏蛋白清晰勾勒出单个细胞轮廓，而ninein则集中在顶端中心体区域。这表明固定剂和抗体渗透良好，且抗原性得以有效保留。比例尺 = 5 μm。 请点击此处查看此图的放大版本。
图6：类器官的发育、固定及分离类器官的免疫标记 (A) 相差显微图像，显示类器官从细胞聚集体到形成芽起始的囊状结构，再到具有隐窝和绒毛结构域的完全成熟类器官的不同发育阶段。 (B-F) 使用细胞回收溶液从基底膜基质中分离类器官后，通过共聚焦光学切片观察 4 °C （10 分钟）后进行甲醛/甲醇固定，在含 10% 山羊血清和 0.1% 去垢剂的 PBS 中洗涤，用含 10% 山羊血清和 0.1% 去垢剂的 PBS 封闭，然后对微管、β-catenin 和 EB1 进行免疫标记。B) 类器官囊肿经微管蛋白（蓝色）和 β-catenin（红色）标记，显示大多数细胞中微管结构保存良好且标记清晰。C) 在类器官囊肿的这些增大的上皮细胞中，明显的顶-基底微管结构清晰可见。D) 标记微管的分裂细胞，显示包含星体（动态）微管（箭头）的纺锤体。E，F绒毛区域E）和隐窝区域（F类器官区域中可见部分 EB1 沿稳定微管晶格分布，尤其在绒毛部位较为明显，而即使在基底隐窝内也几乎看不到 EB1 亮点，提示动态微管未被保留。比例尺 = 20 μm (A) 2 μm (D) 5 μm （B，C，E-F）。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图7：在甲醛/甲醇中固定于基底膜基质内的类器官，经微管和ninein免疫标记。 类器官在甲醛/甲醇中固定后，用含10%山羊血清和0.1%去垢剂的PBS洗涤并封闭，随后在基底膜基质中直接进行免疫标记。共聚焦光学切片结果显示：（A-C）类器官囊泡经微管（绿色）和ninein（Pep3；参考文献8，红色）标记，并用DAPI染核（蓝色），图A为合并图像，图B和图C分别为微管和ninein的反色单通道图像。图像显示清晰的顶-基底方向微管结构以及顶膜定位的ninein，表明类器官结构保存良好，抗体渗透充分，且未结合的抗体已被有效清除。（D, E）正在形成隐窝结构的类器官，经相同方法固定与标记，同样显示出优异的结构保存、标记效果及抗体清除效果。可见明显的顶-基底方向微管及顶膜n-MTOC区域的ninein定位，在图D中框选区域的放大图像（E）中尤为清晰。比例尺 = 10 μm（A-D）；5 μm（E）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图8：在甲醇中固定并进行微管和EB1免疫标记的基底基质内类器官。 将完全发育的类器官在甲醇中固定后，用含10%山羊血清和0.1%去污剂的PBS洗涤并封闭，随后在保持于基底基质中的状态下进行标记，并获取共聚焦光学切片图像。（A）囊状结构域使用兔多克隆α-微管蛋白抗体（红色）和鼠单克隆EB1抗体（绿色）标记，显示顶-基底方向的微管、两个分裂细胞中的纺锤体（箭头）以及清晰的EB1彗星结构。部分未结合的EB1抗体滞留现象明显，但微管和EB1的整体结构保存良好且标记效果理想。EB1彗星结构的存在表明动态微管结构得以保留（A，反转图像）。（B）类器官囊状区域的反转图像，显示α-微管蛋白抗体标记过程中有较多抗体滞留在周围基底基质内（箭头）。比例尺 = 5 μm。 请点击此处查看该图的高清版本。
图9：在1% PFA中固定于基底膜基质中的类器官，经Lgr5和CD24免疫标记。 将类器官在含0.1%去污剂的PBS中以1%多聚甲醛（PFA）固定于基底膜基质内，随后在含1%山羊血清和0.1%去污剂的PBS中洗涤，并用抗Lgr5和抗CD24抗体进行标记，通过共聚焦显微镜获取光学切片图像。(A, B) 肠隐窝结构内的干细胞微环境，显示潘氏细胞表达CD24（红色）。图A为共聚焦图像与相差图像的叠加图；B显示CD24标记的单通道图像。(C) 肠隐窝结构内的干细胞区域，显示Lgr5阳性的干细胞。比例尺 = 10 μm。 请点击此处查看该图的高清版本。
表1：小肠隐窝和绒毛分离与固定的时序流程。 请点击此处查看此图的放大版本。
讨论
肠道组织的分离
小肠隐窝和绒毛以及结肠隐窝的分离包括暴露黏膜表面、用EDTA溶液处理以松解细胞间连接、分离（震荡）和离心。本实验方案中提供的肠道绒毛/隐窝分离方法已根据Belshaw et al. 和 Whitehead et al.17,18 进行了修改
暴露黏膜表面
在本实验方案的开发过程中，我们尝试了多种方法以暴露肠道的黏膜表面。一种经典的方法是将肠管外翻（即内外翻转），通常将肠管切成约100 mm长的节段，使用一根金属棒插入组织一端的褶皱中，然后将肠管其余部分沿金属棒滑动完成外翻19。对于小鼠组织，使用直径为2.4 mm、末端圆滑的金属棒最为理想。这种方法的优点是能够充分展开黏膜表面，便于PBS和EDTA更好地接触组织。我们最初采用此方法，但随后改用将肠管切成短段（约5 cm），再用解剖剪将每一段纵向剪开，因为后者操作更为简便。如果实验仅需处理少量肠道，该方法是合适的；但如果实验涉及较多动物，则采用Yoneda et al.14所述的专用纵向切开装置会更加高效。
绒毛和隐窝与肌层的分离
最初我们使用 PBS 中含 3 mM EDTA 的溶液，并采用相对较长的孵育时间（最长达 60 分钟），以使黏膜表面与下方组织松解17,18在此浓度的EDTA下，我们发现30分钟的孵育时间足以使隐窝从鼠结肠中松脱。然而，对于小肠隐窝/绒毛的分离，我们尝试使用更高浓度的EDTA并缩短处理时间，结果证明这是一种高效的方法。后续所有实验均采用30 mM EDTA法提取组织，以获得相应的绒毛或隐窝组分。对于隐窝，我们通常在固定前合并第3至第5组分，但需注意验证这些是否为合适的组分，因为分离时间会受到多种因素影响，例如肠道部位的位置、小鼠年龄、炎症状态以及先前的饮食情况。 等等。 类似地，在不同条件下，EDTA 处理后组织需要振荡的时间长度可能有所不同。结果会得到含有绒毛和隐窝混合物的分离组织组分，或主要为绒毛或隐窝的组分图2）。由于结肠中无绒毛结构，通过在试管中振荡组织30秒即可一步完成隐窝的提取。随后可对这些组分进行固定并进行免疫标记处理。
从基底膜基质中分离肠道类器官
可通过细胞回收溶液从基底膜基质圆顶中分离类器官。该溶液通过解聚凝胶化的基底膜基质发挥作用，但温度需保持在 2 - 8 °C。需注意的是，动态微管可能无法被保留。因此，若需对动态微管及 EBs 细胞等 +TIPs 进行免疫标记，不建议在固定前从基底膜基质中回收类器官。然而，分化中的类器官细胞中的大多数微管相对稳定，这些微管结构可被良好保留（图 6）。该方法也适用于中心体蛋白、连接蛋白以及细胞标志物的免疫标记。
固定方案
甲醛（由多聚甲醛PFA新鲜配制）是一种作用相对较快的固定剂，可形成可逆的交联结构。例如，4% PFA适用于微管和γ-微管蛋白的免疫标记，以及用鬼笔环肽染色肌动蛋白纤维。较低浓度的PFA溶液（如1%）在隐窝干细胞微环境内对干细胞标志物Lgr5和潘氏细胞标志物CD24进行免疫标记时效果良好，而较高浓度的PFA则无效。
加入戊二醛可更好地保存微管结构，而所谓的PHEMO固定液则由3.7% PFA、0.05%戊二醛和0.5%去垢剂溶于PHEMO缓冲液（68 mM PIPES、25 mM HEPES、15 mM EGTA和3 mM MgCl2）组成2 能很好地保存微管结构，同时不损害抗原性。该方法也适用于γ-微管蛋白、β-连环蛋白和E-钙黏蛋白的免疫标记，以及用鬼笔环肽染色肌动蛋白丝。然而，在三维组织和类器官培养中，PHEMO固定产生的结果不一致，因此未予采用。
甲醇是一种凝固性固定剂，具有相对较好的穿透性，并倾向于保留抗原性。使用100%甲醇（-20 °C）进行固定会引起一定程度的收缩，形态学保存效果中等，适用于二维细胞培养中的微管、+TIPs以及多种中心体抗体（包括ninein）。然而，某些类器官在使用该固定方法时会发生塌陷。此外，抗体穿透整个隐窝、绒毛或类器官最初存在困难，但通过在洗涤液中添加0.1%的去垢剂并延长洗涤时间，获得了更好的结果。
Rogers et al.20 之前曾使用甲醛与甲醇的组合对果蝇（Drosophila）中的 EB1 进行免疫标记。因此，我们基于 3% 甲醛和 97% 甲醇（预冷至 -20 °C）的混合液，开发了一种适用于肠道组织和类器官的固定方案，并省略了 Rogers et al.20 所用方案中的 5 mM 碳酸钠。此外，样品在 -20 °C 冰箱中进行固定。该方法对 +TIPs（如 CLIP-170 和 EB 蛋白家族）的免疫标记效果尤为理想，同时也非常适用于组织和三维类器官中微管与肌动蛋白的固定及免疫标记。组织结构保存良好，多种细胞骨架及其相关蛋白，以及中心体蛋白（如 γ-微管蛋白和 ninein）的抗原性均得以保留；尽管 ninein 的标记在甲醇单独固定时结果更为稳定。
披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
作者感谢 Paul Thomas 在显微镜使用方面的建议和帮助。本研究工作得到了英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC）的资助（资助编号 BB/J009010/1，授予 M.M.M. 和 T.W.）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) | Sigma | D8537-500ML | 洗涤和PFA处理 |
| 细胞回收溶液 | Corning | 354253 | 类器官分离 |
| lobind 微量离心管 | Eppendorf | 30108116 | 防止细胞粘附 |
| 0.5 M EDTA 溶液，pH 8.0 | Sigma | 03690-100ML | 隐窝分离 |
| 70 μm 细胞筛 | Fisher Scientific | 11517532 | 从绒毛中分离隐窝 |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | 去垢剂 |
| 山羊血清 | Sigma | G6767 | 封闭剂 |
| 胎牛血清 (FBS) | Sigma | 用作防粘附剂 | |
| 4% 磷酸盐缓冲多聚甲醛 | Alfa Aesar | J61899 | 固定剂 |
| 甲醛溶液（36.5–38% H2O） | Sigma | F8775 | 用作固定剂 |
| 甲醇 99.9% 分析纯 | Fisher | M/4000/17 | 用作固定剂 |
| MaxFluor 小鼠免疫荧光检测试剂盒（Mouse on Mouse） | Maxvision Biosciences | MF01-S | 商用免疫荧光试剂盒；用于减少非特异性标记 |
| 旋转仪 SB2 或 SB3 | Stuart | 微量离心管旋转仪 | |
| 柠檬酸钠 | 抗原修复 | ||
| Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | 封片剂 |
| DABCO - 1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷 | Sigma | D27802 | 抗淬灭剂 |
| 永久性正电荷、预清洗、90度磨边载玻片 | Clarity | N/C366 | 载玻片 |
| 玻璃盖玻片 - 厚度1号，22 × 50 mm | Clarity | NQS13/2250 | 盖玻片 |
| Matrigel | Corning | 356231 | 三维类器官培养的基底膜基质 |
| 50 mL 锥形管 | Sarstedt | 62.547.254 | 用于组织/类器官处理 |
| 15 mL 锥形管 | Sarstedt | 62.554.502 | 用于组织/类器官处理 |
| 1.5 mL LoBind 管 | Eppendorf | 30108051 | 用于分离的类器官 |
| 小鼠单克隆抗E-钙黏蛋白抗体 | BD Biosciences | 610181 | 一抗 1:500 |
| 大鼠单克隆抗微管蛋白 YL1/2 抗体 | Abcam | ab6160 | 一抗 1:100 |
| 兔抗α-微管蛋白抗体 | Abcam | ab15246 | 一抗 1:100 |
| 兔抗β-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab8227 | 一抗 1:100 |
| 大鼠单克隆抗p150Glued抗体 | BD Bioscience | 610473/4 | 一抗 1:100 |
| 大鼠单克隆EB3KT36抗体 | Abcam | ab53360 | 一抗 1:200 |
| 小鼠单克隆EB1抗体 | BD Bioscience | 610535 | 一抗 1:200 |
| 兔抗Lgr5抗体 | Abgent | AP2745d | 一抗 1:100 |
| Dylight 抗大鼠 488 | Jackson | 112545167 | 二抗 1:400 |
| Dylight 抗小鼠 488 | Jackson | ST115545166 | 二抗 1:400 |
| Dylight 抗兔 647 | Jackson | 111605144 | 二抗 1:400 |
参考文献
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