经尿道灌注是一种具有挑战性的操作，在文献中尚未得到充分描述。本文旨在介绍一种用于成年雄性小鼠经尿道插入导管的技术，以实现将含有活性物质的液体经膀胱内途径递送至尿 bladder 和/或前列腺的方法。
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本文内容
摘要
摘要
经尿道灌注可用于将含有不同活性成分（例如药物、化学物质、细菌和病毒）的溶液局部递送至膀胱，以建立膀胱病理的动物模型或评估膀胱内治疗的效果。大多数下尿路（LUT）病理的啮齿类动物模型均在雌性小鼠中建立，因其可通过雌性尿道更方便地进行膀胱内灌注。然而，由于雌雄下尿路在解剖结构上的差异，雄性小鼠的经尿道灌注被认为是一项极具挑战性的操作，此前尚未有相关描述。本文中，我们详细介绍了如何制备聚乙烯（PE）导管，以便后续插入雄性小鼠的尿道。此外，我们还讨论了根据目标接种部位选择最适PE导管类型的建议。同时，我们逐项说明了如何对动物进行准备，以成功实施经尿道灌注，避免尿道损伤，并确保溶液准确递送至目标位置。操作首先通过回缩包皮和龟头，暴露尿道外口。随后，使用钝性无创伤镊夹持龟头，以固定阴茎和PE导管。将PE导管首先平行于动物体轴方向插入尿道外口，然后通过倾斜导管调整其角度，使其顺应尿道的自然弯曲走向。该技术可用于建立雄性小鼠的膀胱病理模型和/或评估膀胱内治疗在雄性小鼠中的有效性。
引言
经尿道灌注法已在先前的研究中被用作建立啮齿类动物膀胱疾病模型的方法之一1,2,3,4，并可用于评估局部给药治疗在小鼠中的有效性。尽管动物模型无法完全模拟人类疾病，但在动物研究中识别其潜在机制有助于更好地理解人类下尿路功能障碍，例如间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征、神经源性膀胱炎、自身免疫性膀胱炎以及前列腺炎症5。
在成年雄性小鼠中进行经尿道灌注操作的技术难度高于在成年雌性小鼠中进行的膀胱内灌注6。雄性小鼠尿道的自然弯曲解剖结构及其较小的直径，使得经尿道插入导管在技术上更具挑战性。因此，以往关于通过膀胱插管进行经尿道诱导小鼠尿路感染6以及下尿路（LUT）炎症7,8,9,10,11,12,13,14,15的详细操作步骤仅针对雌性小鼠进行过描述。本论文旨在提供在雄性小鼠中进行经尿道灌注物质的分步技术说明，包括视频片段、图像和示意图。在成年雄性小鼠中进行的经尿道灌注操作可使用不同接种物完成，类似于此前在雌性小鼠中所描述的方法7，并可结合其他技术，如内脏运动反应（VMR）的肌电图记录16。
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方案
所有涉及动物的操作，包括麻醉方法和持续时间以及术后护理，均与兽医讨论并获得附属机构机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。本论文中所有操作均使用8至15周龄的C57BL/6雄性小鼠进行，实验方案遵循科罗拉多大学IACUC批准的动物护理指南。
1. 导管的准备
注意：接种物可通过连接聚乙烯（PE）导管的针头（图1A）或细规格（<24 G）套管针进行接种（图1G）。使用套管针仅需用70%乙醇（EtOH）灭菌，无需其他预处理。接种物是指被注入或植入泌尿道的物质，可以是含有细菌、病毒或化学物质的溶液。该溶液需按照研究方案提前配制。例如，若研究旨在评估大肠杆菌（E. coli）感染对下泌尿道的影响，则研究人员需提前制备含有该细菌的接种物，并将其接种或注入下泌尿道。
- 连接至PE导管的针头制备过程简单，步骤如下：根据靶器官及动物年龄选择合适尺寸的PE导管。对于年龄小于12周的动物，应使用PE-10导管（外径为0.024英寸，内径为0.011英寸）。建议PE-10导管适用于以下两种情况：（1）在前前列腺（AP）和精囊（SV）中进行接种物的初次接种；或（2）在年龄小于12周的动物膀胱中进行接种物的初次接种。对于年龄较大的动物，膀胱内初次接种可使用直径更大的PE导管，最大可达PE-50（外径最大为0.038英寸，内径最大为0.023英寸）。
- 截取约2.5英寸长的PE导管。
- 选择能够适配所选PE导管直径的针头。27 G针头可插入PE-10导管的管腔内，而22 G针头适用于PE-50导管的管腔。
- 在将针头插入PE导管前，使用市售油石摩擦针头的锋利边缘（图1A-B），使其变钝，或直接使用市售的钝头针。
- 将钝化后的针头（图1C）插入PE导管的管腔中。操作时应确保针头始终保持在管腔中央，以避免损伤管腔或误入假腔（图1D-E）。若在插入钝头针过程中造成PE导管损坏，应剪除受损端并重新开始制备。
- 将连接针头的PE导管置于70%乙醇中消毒，直至用于实验操作。用70%乙醇冲洗针头-PE导管系统，以消毒管腔，并确认在针头插入过程中未造成PE导管破损而导致泄漏。如发现泄漏，应弃用该针头-PE导管组合。
注意：在进行导尿操作前，PE导管末端必须光滑。为避免将PE导管插入尿道时出现问题，建议在导尿前立即修剪PE导管的末端（图1F）。建议PE导管的最小长度为1.5英寸，该长度包括包裹针头的部分。
2. 导管插入术操作步骤
- 在麻醉诱导前，排空小鼠的膀胱。
- 对小鼠下腹部施加轻柔的压力并进行按摩。这些操作通常可引发自主排尿。膀胱充盈可能导致灌注的接种物被稀释或立即泄漏。
注意：确保小鼠膀胱排空的另一种可选方法是在经尿道灌注操作开始前至少1小时限制动物饮水。限制饮水需经所在机构批准，作为动物实验方案的一部分。
- 对小鼠下腹部施加轻柔的压力并进行按摩。这些操作通常可引发自主排尿。膀胱充盈可能导致灌注的接种物被稀释或立即泄漏。
- 使用异氟烷气流（2%）的麻醉机诱导麻醉。
- 动物麻醉后，将其置于加热垫上，并用蓝色垫巾覆盖，鼻部置于鼻罩内以维持持续麻醉。
- 通过检查足底反射（脚趾夹捏）确认动物处于麻醉状态。
- 当足底反射消失后，开始回缩包皮。
- 用一只手的拇指和食指按压耻骨区域（图2A 和 2B），用另一只手的拇指和食指将阴茎头拉出（图2C）。正确操作后，包皮、阴茎头和阴茎体将保持外露状态（图2D 和 图2F）。切勿使用镊子拉出阴茎头，以免造成组织损伤。
- 插入导管前，用无菌外科润滑剂润滑导管尖端和阴茎头。这有助于聚乙烯导管的插入。
注意：建议每次使用单独包装的润滑剂小方块，而非使用一大管润滑剂，以维持无菌条件。 - 用钝头镊子轻轻夹住阴茎尖端，并轻轻挤压阴茎头，使尿道外口张开。
- 手持连接针头的聚乙烯导管或直接手持聚乙烯导管，将其经尿道外口插入。
注意：建议采用拇指、食指和中指的三脚架式握持法握持连接针头的聚乙烯导管或导管本身，以确保稳定性。
注意：由于成年雄性小鼠尿道在阴茎头和阴茎体包围下具有自然弯曲，插管路径应呈弧形，如 图3A 和 图3B 所示。插管过程中聚乙烯导管可能会遇到阻力，因此建议通过上下倾斜导管调整角度，以帮助导管进一步推进至目标器官。必要时，可轻微旋转导管以帮助其通过尿道的多个急转弯。当阻力过大时，应将导管稍许回撤，再以最小压力重新推进。完全撤出聚乙烯导管并增加润滑可能有所帮助。 - 当聚乙烯导管到达目标器官后，推动注射器活塞，灌注所需体积的接种物（建议体积为5–200 µL），完成接种物灌注。
- 若需将接种物灌注至膀胱，应推进聚乙烯导管，直至插入约0.75英寸的导管长度（图3A）。
注意：若需将接种物灌注至前叶前列腺（AP）和精囊（SV），通常当导管插入至前叶前列腺开口处时会遇到阻力。通过上下倾斜导管调整角度，可使聚乙烯导管进一步推进，直至插入约1英寸的导管长度（图3B）。
- 若需将接种物灌注至膀胱，应推进聚乙烯导管，直至插入约0.75英寸的导管长度（图3A）。
3. 在体 内 下尿路与肾脏成像
注意：本步骤的目的是 体内 本文中成像的目的为：（1）确认接种物的空间定位；（2）评估接种物反流至肾脏的发生情况。为此，可使用麻醉或安乐死的小鼠。
- 为了观察成年雄性小鼠的下泌尿道，进行下腹部正中腹腔切开术，以暴露膀胱、前列腺和精囊。
- 使用剪刀从耻骨至剑突下方沿正中线切开皮肤。
- 将皮肤从皮下组织上方抬起。
- 辨认位于正中线的无血管区——白线，并切开此区域以进入容纳所有器官的腹膜腔。
- 通过观察蓝色染料或其他合适的示踪剂来确认空间定位。
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结果
经尿道通过PE 50导管灌注蓝色染料，成功将染料注入膀胱内图 4A），以及通过PE 10导管对精索静脉（SV）和动脉（AP）进行染色（图4B），以评估经尿道灌注是否立即引起接种物反流至肾脏。灌注后观察肾脏和输尿管，以判断是否存在反流。 100 µL 蓝色染料和荧光染料的图 4A- B）。使用两种不同规格的聚乙烯导管和两种不同染料进行灌注操作，均未导致输尿管或肾脏着色。
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讨论
本手稿详细描述了一种在成年雄性小鼠中进行经尿道灌注的方法。通过使用不同直径的PE导管，可到达不同的主要接种区域。建议使用PE-50导管以成功进入膀胱腔，而较大直径的PE-10导管则用于到达精囊和前列腺（图3A-B）。除了PE导管尺寸的选择和接种靶器官外，其他因素（如灌注液的体积）也会影响溶液最终的分布位置。我们的实验表明，使用PE-10或PE-50导管经尿道灌注100 µL蓝色染料，并不会立即引起染料反流至肾脏。然而，在灌注后的时期内，尿液仍可能发生向肾脏的反流，从而导致肾脏感染，这一点此前已在成年雌性小鼠中得到证实8。因此，强烈建议对肾脏进行组织学评估，以确认经尿道灌注未造成肾脏的间接污染。
进行成功的经尿道接种物灌注有几个关键步骤需要注意。首先，PE导管应具有足够的长度——至少2.5英寸。这样可以在导管制备过程中或经尿道灌注操作后根据需要对导管长度进行额外调整。在本方案第9步中若多次尝试失败，可能导致PE导管插入端被体液堵塞。此时，应剪去...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者没有需要致谢的内容。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BD INTRAMEDIC 聚乙烯导管/PE 10 | BD Medical | 63019-004 | |
| BD INTRAMEDIC 聚乙烯导管/PE 50 | BD Medical | 63019-048 | |
| BD Insyte-N Autoguard/ Angiocath | BD Medical | 311411 | |
| 乙醇（EtOH） | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| BD 22 号（G）1 英寸针头 | Becton Dickson | 205155 | |
| BD 27 号（G）1/2 英寸针头 | Becton Dickson | 305129 | |
| Luer 接头，22 G × 0.5 英寸 / 钝头针 | Instech | LS22 | |
| Luer 接头，27 G × 0.5 英寸 / 钝头针 | Instech | LS27 | |
| 6" 长 × 2" 宽 × 1" 厚，氧化铝磨刀石 / 油石 | Norton | 40204034 | |
| 外科润滑剂，无菌抑菌型 Folilpac | Surgilube | 281020543 | |
| 异氟烷 | Fluriso | 13985-528-60 | |
| SomnoSuite 低流量麻醉系统 | Kent Scientific | SS-01 | |
| 弯头解剖镊 | vwr | 82027-392 | |
| BD 1 ml 注射器 | BD Medical | 309626 | |
| 印度墨水溶液，0.2% PBS 缓冲液 | Alfa Aesar | J61007 | |
| 8~12 周龄雄性 C57B/6 小鼠 | Jackson Lab | #000664 |
参考文献
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重印与许可
