大鼠慢性经颅电刺激与皮层内记录

摘要

本详细方案描述了在自由活动大鼠的颞骨上进行经颅刺激电极放置的方法，以研究经颅电刺激的短期和长期效应。

摘要

经颅电刺激（TES）是一种强大且相对简单的方法，可用于弥散性地影响大脑活动，既可随机进行，也可通过闭环事件触发的方式实施。尽管许多研究聚焦于 TES 在健康和病变大脑中的潜在益处及副作用，但关于其作用机制仍存在诸多尚未解决的基本问题。因此，迫切需要一种可靠且可重复的方法来检测 TES 在啮齿类动物中的急性和慢性效应。TES 可与常规的行为学、电生理学和成像技术相结合，用于在活体（in vivo）条件下研究神经网络。经颅刺激电极的植入不会对实验设计施加额外限制，同时提供了一种多功能且灵活的工具来调控脑活动。本文中，我们提供了一套详细、逐步的操作方案，用于制备并植入经颅刺激电极，以在数月时间内以时间精确的方式调控脑活动。

引言

经颅电刺激（TES）是一种能够在时间上精确调控脑活动的重要方法学手段。根据刺激电极的大小和放置位置，TES 可以影响较大的脑区体积，并广泛地同步神经元群体活动^1,2,3。经颅直流电刺激已获得医学批准用于治疗重度抑郁障碍^4,5，并且已有大量研究致力于揭示经颅刺激对人类认知功能的影响^6,7。此外，关于 TES 在控制癫痫发作方面的潜力，已有研究报道了令人鼓舞的结果^8,9。

尽管已有大量研究，但关于该方法的作用机制细节、潜在副作用以及长期应用效果仍存在许多未解的问题^10,11,12。因此，建立一种稳定且可重复的实验方案以在动物模型中研究经颅电刺激（TES）的影响至关重要。鉴于许多疾病（例如，抑郁症、癫痫和精神分裂症）只能在清醒动物中进行深入研究，且这些疾病的性质通常需要长期治疗，本文提供了一种在大鼠中进行经颅电极慢性植入的实验方案。本方法可用于行为学研究，也可与记录电极（即，导线、硅胶探针、近细胞电极）的植入或慢性颅窗的制备相结合，分别用于电生理实验和成像研究。根据实验设计的不同，刺激的时间可为随机给予，或由特定行为线索触发，或由特定脑状态的电生理特征（如癫痫发作、θ振荡）触发^8,11,13。

需要强调的是，与目前使用电极贴附于皮肤表面的人体方法不同，本文展示了一种在颞骨表面进行皮下植入的方法，因为大鼠几乎无法耐受任何通过其爪子即可轻易触及并放置于皮肤表面的装置。

根据替代、减少和优化的原则，由于植入具有慢性特征，该方法有助于减少动物使用数量，因为每只动物可在数月内参与不同的实验条件，从而能够使用较少的动物来验证多种假设。

在本研究中，我们提供了一种经颅刺激电极制造的详细逐步操作方案（图1A-B），并展示了将这些电极长期植入一只六个月大雄性Long-Evans大鼠颞骨区域的方法。

方案

本文所述所有方法均符合欧洲共同体理事会指令（86/609 ECC）的要求，并已获得塞格德大学阿尔伯特·森特-焦尔吉医药中心动物实验伦理委员会的批准（XIV/218/2016）。

1. 刺激电极的制备

1. 制作一个刺激电极时，剪取六段10 cm长的微型连接导线，一端剥去2 cm绝缘层，另一端剥去1 cm绝缘层。
2. 将两根导线绞合在一起，并在较短的裸露端进行焊接。
3. 取一段包含三个SOT-353封装集成电路的带状包装材料。
4. 将绞合的导线穿过封装材料上的三个孔，导线较长的裸露端应位于封装腔体内。调整导线位置，使绝缘层末端与孔边缘对齐。
5. 在孔上涂抹牙科水泥以固定导线。
   注意：牙科水泥必须足够致密，以防止渗入封装腔体内部。
6. 待水泥完全固化后（至少10分钟），翻转封装体，在孔内涂一层薄薄的瞬干胶，形成对多孔水泥的防水密封。注意避免将裸露导线粘连。
7. 在较短的裸露端将导线绞合后焊接（图1A）。
8. 用精细镊子夹住导线较长的裸露部分，将其卷绕并嵌入封装腔体内（图1B）。如有需要，剪去多余导线。

2. 记录电极的制备

1. 制作一个记录三联电极（图1C-D）时，使用高速旋转锯切割一段1 cm长的不锈钢管。用锋利的针去除管子两端的毛刺，并确保管内无碎屑且完全通畅。
   注意：请勿使用钳子，因为它们会使管子变形。
2. 将一根长度不少于3 cm的镀金电路板间隔针弯曲成J形支架。剪短“J”形的长腿，并将其焊接回原状，以在长直部分（由立体定位仪夹持）与“U”形部分（用于固定电极并作为锚定点）之间形成可拆卸连接。将不锈钢管与“J”形支架的短腿粘合在一起。如有需要，可额外粘接一些1 cm长的小杆以增强稳定性。
3. 使用不锈钢超细剪刀切割3段长度为2.5 cm的电极导线。确保切口清晰整齐，电极导线断面处的绝缘层保持完整。同时确保切割时施加的力未导致导线尖端弯曲。将每根导线的一端弯折1至2 mm，角度各不相同（例如，一根保持直线，一根弯成45°，另一根弯成直角），以便于区分。
4. 将导线插入管中，根据实验需求选择合适的电极间距（例如，用于皮层局部场电位（LFP）和电流源密度（CSD）记录时，建议导线尖端从管口伸出的长度分别为：4.5 mm、4.1 mm 和 3.7 mm）。记录每根导线对应的深度，以维持正确的通道顺序。
5. 当导线彼此紧邻并平行于管轴排列后，用细针在管子两端各滴一滴液体超级胶水以固定电极导线。确保胶水因毛细作用渗入管内，但不要流向突出端的记录位点。
6. 准备一块带有合适微型连接器的电极接口板，该连接器需与所用记录系统兼容。
7. 将导线非记录端的弯曲部分插入电极接口板上对应所需记录通道的孔中。当所有导线就位后，用镊子将镀金插针推入孔内。
   注意：镀金插针可用牙科水泥固定，但在大多数情况下，即使不进行此额外固定步骤，其稳定性也已足够。

3. 麻醉

1. 将动物放入密封的麻醉诱导室中，并以每分钟2升的医用空气输送4-5%的异氟烷。
2. 当大鼠呈侧卧状态时，将其从诱导室中取出，并固定于立体定位仪上，连接合适的通气鼻罩。
3. 将异氟烷浓度调至2%，气流速率保持不变。检查麻醉深度：若夹捏足趾无回缩反射，则可继续操作；否则应加深麻醉。
4. 使用恒温监测系统将大鼠体温维持在37 ± 0.5 °C。在眼睛表面滴加石蜡油膏，防止角膜干燥。必要时，在手术过程中可多次重复此操作。
5. 皮下注射0.3 mg/kg的阿托品，以防止呼吸道黏液分泌。若为较长时间的手术，每四小时重复给药一次。密切监测呼吸情况，必要时调整蒸发器设置。

4. 刺激和记录电极的植入

注意：所有必要的手术器械均需进行高压灭菌，并在整个操作过程中严格遵守无菌和抗菌的一般规则。避免接触手术区域外的非无菌区域。 植入前将电极浸入70%乙醇中30分钟。

1. 使用电推剪去除头皮上的大部分毛发。将脱毛膏涂抹于头皮表面，均匀铺开，静置数分钟。用刮刀轻轻去除脱毛膏及残留毛发，随后先用清水冲洗皮肤，再用消毒剂冲洗。
2. 皮下注射1 - 2%利多卡因（总剂量不得超过7 mg/kg）以麻醉皮肤。在眼睛上涂抹少量兽用眼膏（例如，石蜡膏）。
3. 使用手术刀沿中线从额部至颈部做一条完整且较长（约2 cm）的矢状切口。分离包括骨膜在内的颅骨组织，然后使用凿子或齿状镊子清理两侧颞骨嵴之间的区域。使用四个止血钳牵开已分离的皮肤，使颅骨保持暴露状态。
4. 将精细镊子轻轻插入颞骨陡峭边缘与肌肉之间并进行分离。通过轻微抖动动作，尽可能暴露大面积的颞骨表面，理想范围从枕骨边缘延伸至冠状缝平面，注意避免损伤肌肉组织。
5. 双侧颞部放置牵开器，以维持颞骨的充分暴露。
6. 用1 - 2 mL 3% H₂O₂冲洗颅骨表面，随后用1 - 2 mL清水冲洗。
7. 极其小心地使颞骨表面自然风干，并用眼科棉签吸除残留湿气。测试刺激电极是否能贴合清洁后的颅骨垂直面（刺激电极上缘应与颞骨嵴边缘对齐）。如有必要，重新调整止血钳和牵开器，或用剪刀修整刺激电极形状。
8. 在刺激电极的腔内填充导电凝胶，并在电极边缘涂上一层薄胶水。
9. 以一次准确的动作将刺激电极放置于干燥的颞骨表面，并用精细镊子牢固按压一分钟。确保胶水未接触任何湿气，必要时用眼科棉签吸除湿气。
   注意：若发现电极存在任何不稳定性，应立即移除。清洁骨面后，使用新的刺激电极重复此步骤。
10. 在组织持续渗湿的情况下，用眼科棉签不断吸干，同时将牙科水泥覆盖于刺激电极边缘，并完全包埋整个刺激电极。
11. 待牙科水泥完全硬化后，在对侧重复上述步骤。
12. 在颅骨上钻多个小孔用于固定螺钉。将微型螺钉旋入孔中，并在其上覆盖牙科水泥。所用钻头直径应比螺钉直径小约10%。
13. 根据实验目的，可选择将连接器焊接到导线末端，置于表面并用牙科水泥覆盖；或继续植入记录电极和光学纤维；或在颅骨上制备颅窗。若采用后者，连接器的焊接和固定应在最后一步完成。如需长期同步进行经颅电刺激（TES）和局部场电位（LFP）记录，应植入前述的电极三联体而非单根导线。
    注：该装置可有效去除共模刺激伪迹⁸。有关记录电极植入的详细步骤，请参见先前的实验方案^14,15。
14. 用大量消毒剂冲洗暴露的组织。皮下注射1 - 2%利多卡因（总剂量不得超过7 mg/kg）。
15. 清创伤口边缘，并在连接器/植入物周围采用间断缝合法关闭切口。使用聚维酮碘对伤口进行消毒。
16. 皮下注射5 mg/kg卡洛芬，必要时可重复给药。
    注：也可使用其他符合当地伦理审查委员会要求的镇痛药物。
17. 停止麻醉，松开耳杆和鼻夹，将动物放入术后恢复笼中使其苏醒。
18. 确保在术后最初几小时内对动物进行密切监护，并定期检查植入部位。
    注：在动物恢复足够意识以维持胸卧位之前，不得无人看护。动物应单独饲养直至完全康复。

结果

慢性刺激电极的植入（图1B）可与记录电极的额外植入相结合（图1C-D）。此类配置适用于构建按需记录与刺激系统，以干预特定的脑部活动。本文展示了在自发癫痫发作的Long-Evans大鼠上应用的闭环癫痫检测与干预系统的代表性结果（图2A）⁹。该品系以表现出失神（小发作）癫痫的脑电图和行为学症状而著称（图2B）。当发生癫痫发作时，记录到的皮层内信号会被实时分析，并在适当时机向隔离的刺激发生器发送触发信号，以干扰大脑的棘-慢波活动。随后，刺激发生器通过双侧颞部刺激电极传递电荷平衡的三相刺激，以中断癫痫样放电活动。

讨论

该方案最关键的步骤是将电极组件粘附到骨表面。如果密封不当，电极与骨之间会形成间隙，继发性瘢痕组织可能长入此间隙，从而降低刺激质量。在粘贴组件的过程中，骨表面必须完全干燥；若发现电极不稳定，必须将其移除并更换新的组件，以获得最佳效果。

该方法的一个局限性是，由于手术后皮肤并未完全闭合，因此感染风险相对较高。术后恢复的最初4至5天内使用消毒液进行护理，随后使用粉末，有助于预防感染。根据我们的经验，这种处理方式可促进瘢痕组织的形成，从而将伤口完全与外界隔绝。

本文介绍了一种成本最低、最容易实现的电极制备方法，但根据特定实验的特殊需求，可能需要对导电材料进行适当修改。 例如，用非极化电极界面材料涂覆电缆表面， 例如，PEDOT:PSS。电极封装可由实验人员根据需要进行定制、3D打印和修改，以防我们的建议不符合特定研究的要求。根据我们的经验，本研究中制备的经颅电极尺寸适用于体重超过300 g的雄性和雌性大鼠，但若需要更小尺寸的刺激电极，可在方案步骤1.3中通过裁剪更小的条带来轻松实现。此外，方案中列出...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氰基丙烯酸酯液体	Henkel	Loctite 401
氰基丙烯酸酯凝胶	Henkel	Loctite 454
刺激电极用导线	Phoenix Wire Inc.	36744MHW - PTFE 微型连接导线
板间隔器	E-tec Interconnect	SP1-020-S378/01-55
连接器	E-tec Interconnect	P2510I-02
刺激电极的带状封装	Nexperia	74HC1G00GW	任何采用 SOT-353 封装的集成电路的带状封装均可使用
工业级 Grip Cement	Caulk Dentsply	675571（粉末）675572（溶剂）
导电凝胶	Rextra	ECG 凝胶
记录电极导线	California Fine Wire Co.	.002（50 微米）钨丝 99.95%（CFW 材料编号：100-211），HMl-天然，切成 3.0 英寸长段，圆形，切段导线
超细剪刀	Hammacher Instrumente	不锈钢 HSB 544-09
不锈钢管	Vita Needle Company	29 RW，304SS 管材，T.I.G. 焊接并带堵头
高速旋转锯	Dremel	型号 #395
旋转锯夹持器	Dremel	型号 #220
旋转锯切割片	Dremel	型号 #409
眼科棉签	Lohmann-Rauscher	Pro-ophta 眼科棉签
湿性消毒剂	Egis	Betadine
干性消毒剂	Wagner Pharma	Reseptyl-urea
钻孔机	NSK-Nakanishi United Kingdom	Vmax35RV Pack
固定螺钉	Antrin Miniature Specialties, Inc.	000-120x1/16 SL BIND MS SS