本方案描述了记录新生大鼠幼崽听觉脑干反应的方法。为了研究外毛细胞的功能发育，本文逐步介绍了在分离的外毛细胞中进行全细胞膜片钳记录的实验步骤。
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本文内容
摘要
摘要
外毛细胞是哺乳动物耳蜗中两种感觉毛细胞之一。它们会随着感受器电位改变细胞长度，从而放大低强度声音信号的微弱振动。外毛细胞（OHCs）的形态和电生理特性在出生后的早期阶段发育成熟。外毛细胞的成熟可能对听觉系统的发育具有重要作用。然而，目前对外毛细胞发育过程的研究仍不充分，部分原因在于难以通过电生理方法测量其功能。为了建立一种简单的方法来解决上述问题，本文介绍了一种逐步操作的实验方案，用于研究出生后大鼠急性分离耳蜗中外毛细胞的功能。利用该方法，我们能够评估耳蜗对纯音刺激的反应，并检测外毛细胞中运动蛋白prestin的表达水平及其功能。该方法也可用于研究内毛细胞（IHCs）。
引言
耳蜗感觉毛细胞具有两种不同的功能，对哺乳动物的听觉至关重要：机械电换能（MET）和电致运动1,2。内毛细胞（IHCs）和外毛细胞（OHCs）通过位于毛束中的MET通道，将声音振动转化为膜电位变化，进而产生传入螺旋神经节神经元的电信号。OHCs能够根据膜电位改变其细胞长度，从而放大低强度声音的振动。这种被称为电致运动的功能由位于OHC侧膜的马达蛋白prestin介导3。
在包括啮齿类在内的许多物种中，听觉功能在出生后的早期阶段尚未发育成熟4,5。在听觉功能启动之前，无法在听觉皮层检测到对声音信号产生反应的动作电位6,7。耳蜗形态与功能的发育已在小鼠、沙鼠和大鼠中得到广泛研究4,5,8。毛细胞的机械转导和电运动能力也在生命早期阶段逐步发育成熟5。
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方案
所有涉及动物受试者的实验方案均经南方医科大学动物伦理委员会批准。
1. 准备实验用溶液
- 配制麻醉剂（参见材料表）：将1.5%戊巴比妥钠溶于ddH2O中。
- 配制解剖溶液（参见材料表）：将一袋Leiboviz's L-15粉末溶解于1 L ddH2O中。用1 M NaOH将pH值调节至7.3。使用渗透压计和10 mM HEPES在使用前将渗透压调节至300–330 mOsm。
- 将2 mg/mL IV型胶原酶（参见材料表）溶解于步骤1.2中配制的解剖溶液中。
- 配制免疫染色溶液（参见材料表）：将4%多聚甲醛溶解于磷酸盐缓冲液（PBS）中。
注意：多聚甲醛有毒性；操作时需佩戴适当的防护装备。 - 将0.3%通透剂用PBS稀释。将10%正常山羊血清用PBS稀释作为封闭缓冲液。将prestin抗体按1:200比例用封闭缓冲液稀释。将Alexa488标记的二抗按1:600比例用封闭缓冲液稀释。将异硫氰酸四甲基罗丹明标记的鬼笔环肽（Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate）按1:200比例用PBS稀释。
- 配制细胞外溶液（参见
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结果
使用纯音短声刺激可从出生后第7天（P7）以上的麻醉幼鼠中引出听性脑干反应（ABR）（图1A）。如图1B所示，从幼鼠记录到的ABR波形仅显示3至4个振幅较小的明显波峰。通常在成年动物的ABR波形中可观察到多达7个峰（图1B）。
为进行后续的免疫染色和电生理测量，将大鼠内耳从颞骨中新鲜解剖获得。我们展示了从血管纹（SV）和蜗轴分离耳蜗柯蒂氏器（OC）的连续解剖步骤（图2A-2C）。使用显微剪刀将OC均匀地切成三段（图2D）。为显示毛细胞的形态，对组织片段进行鬼笔环肽（phalloidin）、pr.......
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讨论
在出生后11天之前的幼鼠中，听觉皮层无法观察到对声音刺激产生的动作电位6,7。因此，出生后第11天被定义为"听力 onset"10。然而，听力 onset 之前的听觉功能发育过程尚未得到充分研究。采用与成年动物ABR记录相似的方法，我们证明了在出生后11天之前的幼鼠中，纯音短声刺激可诱发出听性脑干反应（ABR）（图1）。然而，从幼鼠记录到的ABR波形与成年动物存在一些差异。幼鼠的ABR反应振幅较小，阈值相对较高。该结果提示，发育中的听觉系统对声音信号的敏感性较低。在幼鼠记录到的ABR波形中观察到显著差异。通常，成年动物的ABR波形中可观察到多达七个峰9。这些具有不同潜伏期的峰由听觉通路中不同脑干核团产生11。我们的结果表明，在幼鼠的ABR中仅能检测到I-IV波（图.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了973计划（2014CB943002）和国家自然科学基金（11534013，31500841）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 麻醉剂 | |||
| 戊巴比妥钠 | Sigma | P3761 | 水中配制成1.5% |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 解剖溶液 | |||
| Leiboviz's L-15 培养基 | Life Technologies | 41300-039 | 1包溶于1 L水中 |
| 胶原酶IV | Sigma | C5138 | 在L-15中配制成2 mg/mL |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 免疫染色溶液 | |||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | pH 7.3 |
| 多聚甲醛 | Sigma | 158127 | 在PBS中配制成4% |
| 吐温X-100 | Amresco | ZS-0694 | 在PBS中配制成0.3% |
| 正常山羊血清 | Thermo Fisher Scientific | 10000C | 在PBS中配制成10% |
| prestin 抗体 | Santa Cruz | SC-22694 | 稀释比例1:200 |
| Alexa Fluor 488 标记抗体 | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | 稀释比例1:600 |
| 鬼笔环肽-四甲基罗丹明异硫氰酸酯 | Sigma | P1951 | 稀释比例1:200 |
| DAPI | Solarbio | C0060 | 稀释比例1:20 |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 细胞外溶液 | |||
| Leiboviz's L-15 培养基 | Life Technologies | 41300-039 | 1包溶于1 L水中 |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 细胞内溶液 | |||
| CsCl | Sigma | 7647-17-8 | 140 mM |
| MgCl2 | Sigma | 7791-18-6 | 2 mM |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | 10 mM |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 设备 | |||
| 渗透压仪 | Gonotec | OSMOMAT 3000 basic | |
| 镊子 | WPI | 14095 | Dumont 镊子 |
| 微电极拉制仪 | Sutter Instrument | MODLE-P97 | |
| 微电极抛光仪 | Narishigen | MF-830 | |
| 微型操作系统 | Sutter Instrument | MP-285 | |
| MultiClamp | Axon | 700B | |
| 低噪声数据采集系统 | Axon | 1440A | |
| ES1 扬声器 | Tucker-Davis Technologies | ||
| TDT system 3 | Tucker-Davis Technologies | ||
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 软件 | |||
| SigGenRP 软件 | Tucker-Davis Technologies | ||
| BioSigRP 软件 | Tucker-Davis Technologies | ||
| jClamp | Scientific Solutions | ||
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 动物 | |||
| SD 大鼠 | 南方医科大学实验动物中心 |
参考文献
- He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. antos-, J, Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout. J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).
- Dallos, P. Cochlear amplification, outer hair cells and prestin. Curr Opin N....
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