本方案描述了记录新生大鼠幼崽听觉脑干反应的方法。为了研究外毛细胞的功能发育，本文逐步介绍了在分离的外毛细胞中进行全细胞膜片钳记录的实验步骤。
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摘要
摘要
外毛细胞是哺乳动物耳蜗中两种感觉毛细胞之一。它们会随着感受器电位改变细胞长度，从而放大低强度声音信号的微弱振动。外毛细胞（OHCs）的形态和电生理特性在出生后的早期阶段发育成熟。外毛细胞的成熟可能对听觉系统的发育具有重要作用。然而，目前对外毛细胞发育过程的研究仍不充分，部分原因在于难以通过电生理方法测量其功能。为了建立一种简单的方法来解决上述问题，本文介绍了一种逐步操作的实验方案，用于研究出生后大鼠急性分离耳蜗中外毛细胞的功能。利用该方法，我们能够评估耳蜗对纯音刺激的反应，并检测外毛细胞中运动蛋白prestin的表达水平及其功能。该方法也可用于研究内毛细胞（IHCs）。
引言
耳蜗感觉毛细胞具有两种不同的功能，对哺乳动物的听觉至关重要：机械电换能（MET）和电致运动1,2。内毛细胞（IHCs）和外毛细胞（OHCs）通过位于毛束中的MET通道，将声音振动转化为膜电位变化，进而产生传入螺旋神经节神经元的电信号。OHCs能够根据膜电位改变其细胞长度，从而放大低强度声音的振动。这种被称为电致运动的功能由位于OHC侧膜的马达蛋白prestin介导3。
在包括啮齿类在内的许多物种中，听觉功能在出生后的早期阶段尚未发育成熟4,5。在听觉功能启动之前，无法在听觉皮层检测到对声音信号产生反应的动作电位6,7。耳蜗形态与功能的发育已在小鼠、沙鼠和大鼠中得到广泛研究4,5,8。毛细胞的机械转导和电运动能力也在生命早期阶段逐步发育成熟5。
为了评估不同出生后年龄大鼠的听觉敏感性，我们建立了一种在幼鼠中记录听觉脑干反应（ABR）的方法。全细胞膜片钳是电生理研究外毛细胞（OHCs）的理想技术。然而，与在神经元和其他上皮细胞中进行的膜片钳记录相比，外毛细胞全细胞封接的成功率较低，限制了对分离的外毛细胞电运动性的研究。
本文介绍了一种对新生大鼠急性分离耳蜗中的外毛细胞进行形态学和电生理学研究的实验方法。该方法可经修改后用于研究调控内毛细胞发育与功能的分子机制。
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方案
所有涉及动物受试者的实验方案均经南方医科大学动物伦理委员会批准。
1. 准备实验用溶液
- 配制麻醉剂（参见材料表）：将1.5%戊巴比妥钠溶于ddH2O中。
- 配制解剖溶液（参见材料表）：将一袋Leiboviz's L-15粉末溶解于1 L ddH2O中。用1 M NaOH将pH值调节至7.3。使用渗透压计和10 mM HEPES在使用前将渗透压调节至300–330 mOsm。
- 将2 mg/mL IV型胶原酶（参见材料表）溶解于步骤1.2中配制的解剖溶液中。
- 配制免疫染色溶液（参见材料表）：将4%多聚甲醛溶解于磷酸盐缓冲液（PBS）中。
注意：多聚甲醛有毒性；操作时需佩戴适当的防护装备。 - 将0.3%通透剂用PBS稀释。将10%正常山羊血清用PBS稀释作为封闭缓冲液。将prestin抗体按1:200比例用封闭缓冲液稀释。将Alexa488标记的二抗按1:600比例用封闭缓冲液稀释。将异硫氰酸四甲基罗丹明标记的鬼笔环肽（Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate）按1:200比例用PBS稀释。
- 配制细胞外溶液（参见材料表）：按照上述方法（步骤1.2）配制Leiboviz's L-15培养基。
- 配制细胞内溶液（参见材料表）。
2. ABR 记录
注意：ABR 记录已在我们之前的研究中进行了详细描述9。
- 使用1.5%戊巴比妥钠单次腹腔注射（i.p.）麻醉Sprague Dawley（SD）大鼠（1-14日龄幼鼠和2月龄成年鼠，两性皆可），幼鼠剂量为22 mg/kg，成年鼠剂量为30 mg/kg。
- 将麻醉后的动物置于聚乙烯泡沫模具中以固定其身体，并放置于隔音室内防震台上。使用加热垫维持动物体温在37.5 °C。
- 用70%（体积/体积）乙醇擦拭头部区域。使用精细剪刀在外耳廓腹外侧做1-2 mm切口，用于放置参考电极或接地电极。记录电极采用皮下针电极，置于颅骨顶点上方（图1A）。
- 使用函数发生器产生经过校准的短声脉冲（上升/下降时间各1 ms，平台期3 ms），频率范围包括2、4、8、16、24和32 kHz，强度以5 dB为步长从85 dB SPL递减至10 dB SPL。可通过手动或计算机控制调节频率和振幅。通过位于动物头部前方10 cm处的静电扬声器传递声音刺激。
- 使用多功能处理器对诱发的电位信号进行滤波（100–1,000 Hz）、放大并平均叠加256次，以获取听觉脑干反应（ABR）。ABR波形实时监测并储存，供后续离线分析。完成一只动物的ABR记录约需40分钟。
注意：通常可识别出3至7个潜伏期小于15 ms的波峰（波I至波VII）（图1B）。ABR阈值定义为能够明确辨认波I和波II的最低声音强度。 - 在动物从麻醉中苏醒前实施安乐死（腹腔注射0.3 mL 1.5%戊巴比妥钠）。
3. 耳蜗柯蒂氏器（OC）解剖
- 麻醉幼鼠。对于出生小于6天的幼鼠（<P6），将动物置于100 mm培养皿中，并在皿上覆盖冰块10分钟。对于出生大于6天的幼鼠（>P6），通过腹腔注射1.5%戊巴比妥钠（22 mg/kg）进行麻醉。麻醉后将幼鼠断头处死。
- 用70%（体积/体积）乙醇喷洒头部进行消毒。
- 用剪刀沿矢状中线打开颅骨；取出脑组织以暴露内耳。
- 将内耳转移至盛有3 mL冰冻L-15培养基的35 mm培养皿中（图2A）。
- 在解剖显微镜下，用精细镊子去除耳蜗的骨性囊壳（图2B）。
- 将耳蜗柯蒂氏器（OC）及其相连的血管纹（SV）从蜗轴上剥离展开。
- 用镊子夹住SV的基部，从基部向顶端缓慢旋开，将OC与SV完全分离（图2C）。
- 用精细剪刀将OC均匀地剪成三段（图2D）。
4. 免疫荧光染色
- 使用200 µL移液器吸头将耳蜗组织片段（步骤3.8）转移至载玻片上，加入100 µL 4%多聚甲醛，在4 °C固定至少4小时。
注意：多聚甲醛具有毒性，请佩戴适当的防护装备。 - 用100 µL新鲜PBS置换多聚甲醛以洗涤组织，共洗涤三次，每次10分钟。
- 将组织在含0.3%通透剂的PBS中室温孵育30分钟。
- 弃去含通透剂的PBS，并用PBS洗涤组织三次。
- 用含10%正常山羊血清的PBS在室温下封闭1小时。
- 在封闭液中加入抗prestin-C末端抗体（1:200），室温孵育2小时或4 °C过夜。
- 用PBS洗涤三次，每次5分钟。
- 在封闭液中加入Alexa488标记的二抗（1:600），室温避光孵育1小时。
- 避光条件下用PBS洗涤三次，每次5分钟。
- 加入罗丹明-鬼笔环肽（1:200），室温避光孵育10分钟。
- 避光条件下用PBS洗涤三次，每次5分钟。
- 用含DAPI的封片剂将样品封片于载玻片上，使用共聚焦显微镜结合405 nm、488 nm和594 nm激光器进行成像。激光功率设置为0.1–0.5 mW，扫描速度设置为0.5帧/秒。
5. 分离外毛细胞的膜片钳记录
- 使用拉针仪和微 forge 器制备尖端直径为 2-3 µm 的记录电极。用细胞内液反向灌注电极。通常，电极在浴液中的初始电阻为 2.5-3.5 MΩ。
- 使用 200 µL 枪头将一块耳蜗组织（来自步骤 3.8）转移至一个 35 mm 培养皿中。加入 100 µL 酶消化液（胶原酶 IV，参见材料表），在室温下消化 5 分钟。
- 吸除酶消化液，加入 100 µL L-15 液。使用显微手术刀将组织切成小块，以分离毛细胞。
- 经轻柔吹打后，将细胞转移至一个自制的小型塑料腔室（直径约 1.5 cm），腔室内预先加入无酶的灌流液（约 1.5 mL，参见材料表）。
- 将腔室置于倒置显微镜载物台上，寻找形态健康的单个外毛细胞。
- 将记录电极装入 700B 放大器的电极架中。通过显微操作器小心移动电极，将其定位至外毛细胞底部附近（图 3A）。
- 通过将电极与细胞体侧壁形成封接，实现外毛细胞的全细胞记录模式。施加轻微负压，直至细胞膜破裂。将钳制电位设为 -70 mV。当细胞的通路电阻在 10 至 17 MΩ 之间，膜电阻在 100 至 500 MΩ 之间时，视为成功建立全细胞记录构型。
- 通过计算机控制，向细胞施加超极化和去极化电压脉冲（持续时间为 250 ms，以 13 mV 为步长，从 −140 mV 至 +94 mV），以诱发全细胞电流。
- 使用 700B 放大器放大全细胞电流，并以 5 kHz 截止频率进行滤波。通过 1440A 转换器将数据数字化后储存，用于离线分析。
- 使用膜片钳软件控制的双正弦电压刺激程序测量外毛细胞的膜电容。设定刺激电压范围为 -140 至 110 mV。储存数据以供离线分析。
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结果
使用纯音短声刺激可从出生后第7天（P7）以上的麻醉幼鼠中引出听性脑干反应（ABR）（图1A）。如图1B所示，从幼鼠记录到的ABR波形仅显示3至4个振幅较小的明显波峰。通常在成年动物的ABR波形中可观察到多达7个峰（图1B）。
为进行后续的免疫染色和电生理测量，将大鼠内耳从颞骨中新鲜解剖获得。我们展示了从血管纹（SV）和蜗轴分离耳蜗柯蒂氏器（OC）的连续解剖步骤（图2A-2C）。使用显微剪刀将OC均匀地切成三段（图2D）。为显示毛细胞的形态，对组织片段进行鬼笔环肽（phalloidin）、pr...
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讨论
在出生后11天之前的幼鼠中，听觉皮层无法观察到对声音刺激产生的动作电位6,7。因此，出生后第11天被定义为"听力 onset"10。然而，听力 onset 之前的听觉功能发育过程尚未得到充分研究。采用与成年动物ABR记录相似的方法，我们证明了在出生后11天之前的幼鼠中，纯音短声刺激可诱发出听性脑干反应（ABR）（图1）。然而，从幼鼠记录到的ABR波形与成年动物存在一些差异。幼鼠的ABR反应振幅较小，阈值相对较高。该结果提示，发育中的听觉系统对声音信号的敏感性较低。在幼鼠记录到的ABR波形中观察到显著差异。通常，成年动物的ABR波形中可观察到多达七个峰9。这些具有不同潜伏期的峰由听觉通路中不同脑干核团产生11。我们的结果表明，在幼鼠的ABR中仅能检测到I-IV波（图...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了973计划（2014CB943002）和国家自然科学基金（11534013，31500841）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 麻醉剂 | |||
| 戊巴比妥钠 | Sigma | P3761 | 水中配制成1.5% |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 解剖溶液 | |||
| Leiboviz's L-15 培养基 | Life Technologies | 41300-039 | 1包溶于1 L水中 |
| 胶原酶IV | Sigma | C5138 | 在L-15中配制成2 mg/mL |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 免疫染色溶液 | |||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | pH 7.3 |
| 多聚甲醛 | Sigma | 158127 | 在PBS中配制成4% |
| 吐温X-100 | Amresco | ZS-0694 | 在PBS中配制成0.3% |
| 正常山羊血清 | Thermo Fisher Scientific | 10000C | 在PBS中配制成10% |
| prestin 抗体 | Santa Cruz | SC-22694 | 稀释比例1:200 |
| Alexa Fluor 488 标记抗体 | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | 稀释比例1:600 |
| 鬼笔环肽-四甲基罗丹明异硫氰酸酯 | Sigma | P1951 | 稀释比例1:200 |
| DAPI | Solarbio | C0060 | 稀释比例1:20 |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 细胞外溶液 | |||
| Leiboviz's L-15 培养基 | Life Technologies | 41300-039 | 1包溶于1 L水中 |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 细胞内溶液 | |||
| CsCl | Sigma | 7647-17-8 | 140 mM |
| MgCl2 | Sigma | 7791-18-6 | 2 mM |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | 10 mM |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 设备 | |||
| 渗透压仪 | Gonotec | OSMOMAT 3000 basic | |
| 镊子 | WPI | 14095 | Dumont 镊子 |
| 微电极拉制仪 | Sutter Instrument | MODLE-P97 | |
| 微电极抛光仪 | Narishigen | MF-830 | |
| 微型操作系统 | Sutter Instrument | MP-285 | |
| MultiClamp | Axon | 700B | |
| 低噪声数据采集系统 | Axon | 1440A | |
| ES1 扬声器 | Tucker-Davis Technologies | ||
| TDT system 3 | Tucker-Davis Technologies | ||
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 软件 | |||
| SigGenRP 软件 | Tucker-Davis Technologies | ||
| BioSigRP 软件 | Tucker-Davis Technologies | ||
| jClamp | Scientific Solutions | ||
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 动物 | |||
| SD 大鼠 | 南方医科大学实验动物中心 |
参考文献
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