腹腔内葡萄糖耐量试验、肺功能测定及肺组织固定以研究肥胖与代谢障碍对肺部结局的影响

摘要

肥胖的发病率不断上升，并增加慢性肺部疾病的风险。为了阐明其潜在机制并制定预防策略，需要建立明确的动物模型。本文提供了三种方法（葡萄糖耐量试验、体容积描记法和肺组织固定）用于研究肥胖对小鼠肺部功能的影响。

摘要

肥胖和呼吸系统疾病是重要的健康问题。预计到2030年，全球肥胖个体数量将超过10亿，肥胖正逐渐成为一种新兴的流行病，带来日益加重的社会经济负担。与此同时，与肥胖相关的共病，包括糖尿病以及心脏病和慢性肺部疾病，也持续上升。尽管肥胖已被证实与哮喘加重、呼吸系统症状恶化及控制不佳风险增加相关，但肥胖及其代谢紊乱在慢性肺部疾病发病机制中的功能作用常被低估，其潜在的分子机制仍不明确。本文旨在介绍评估肥胖对代谢以及肺结构和功能影响的方法。本文描述了适用于小鼠研究的三种技术：（1）腹腔葡萄糖耐量试验（ipGTT），用于分析肥胖对葡萄糖代谢的影响；（2）测定气道阻力（Res）和呼吸系统顺应性（Cdyn），以评估肥胖对肺功能的影响；（3）肺组织的制备与固定，用于后续定量组织学分析。与肥胖相关的肺部疾病可能具有多因素病因，源于全身性炎症和代谢失调，可能对肺功能及治疗反应产生不利影响。因此，建立标准化的研究方法以探讨其分子机制及评估新型治疗手段的效果至关重要。

引言

根据世界卫生组织（WHO）2008年的数据，全球有超过14亿名年龄在20岁及以上的成年人超重（体重指数（BMI）≥25）；其中，超过2亿名男性和近3亿名女性为肥胖（BMI≥30）。¹肥胖和代谢综合征是多种疾病的首要风险因素。尽管肥胖及其伴随的白色脂肪组织质量增加与2型糖尿病密切相关^2,3，心血管疾病，包括冠心病（CHD）、心力衰竭（HF）、心房颤动⁴ 和骨关节炎⁵，其在呼吸系统疾病发病机制中的功能作用仍不甚清楚。然而，流行病学研究表明，肥胖与多种慢性呼吸系统疾病密切相关，包括劳力性呼吸困难、阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSAS）、肥胖低通气综合征（OHS）、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、肺栓塞、吸入性肺炎及支气管哮喘^6,7,8,9肥胖与代谢紊乱的潜在关联机制 例如，胰岛素抵抗和2型糖尿病在慢性肺部疾病发病机制中的作用不仅包括体重增加对通气功能的机械性和物理性影响，还会诱发一种慢性的亚急性炎症状态^10,11近十年来，肥胖症与肺部疾病的发病率不断上升，加之缺乏有效的预防策略和治疗手段，凸显了深入研究其分子机制的必要性，以期为防治肥胖相关性肺部疾病开辟新的途径。

本文介绍了三种标准检测方法，这些方法是研究肥胖及其对小鼠模型肺结构和功能影响的重要基础：（1）腹腔注射葡萄糖耐量试验（ipGTT）；（2）气道阻力（Res）和呼吸系统顺应性（Cdyn）的测定；（3）肺组织的制备与固定，用于后续定量组织学评估。ipGTT是一种可靠的筛查方法，用于测量葡萄糖摄取情况，从而评估肥胖对代谢的影响。该方法操作简便，易于标准化，因此有利于不同实验室之间结果的比较。更复杂的方法，如高血糖钳夹技术或离体胰岛研究，可用于对代谢表型进行深入分析¹²。本文通过评估葡萄糖耐量，定义与肥胖相关的全身性及代谢紊乱状态，作为进一步研究肺部结局的基础。为评估肥胖和代谢紊乱对肺功能的影响，我们测定了气道阻力（Res）和呼吸系统顺应性（Cdyn）。为表征肺部疾病，目前已有多种评估肺功能的方法，包括非限制性和限制性测量方式。非限制性体积描记法在自由活动的动物中进行，可模拟自然状态，反映真实的呼吸模式；相比之下，侵入性方法（如在深度麻醉小鼠中通过输入阻抗法测定Res和Cdyn以评估动态肺力学）具有更高的准确性¹³。由于慢性呼吸系统疾病常表现为肺组织的组织学改变，因此对肺组织进行恰当的固定以供后续分析至关重要。组织固定和制备方法的选择取决于所研究的肺部区域，例如传导气道或肺实质¹⁴。本文描述了一种可用于传导气道定性和定量评估的方法，以研究肥胖对哮喘发生发展的影响。

方案

所有动物实验均按照当地政府部门批准的方案（Land NRW，编号：2012.A424）进行，符合德国动物福利法以及关于实验动物或其他科学用途动物福利的相关规定。由于肺功能分析可能影响肺组织结构，从而干扰后续的组织学分析，因此呼吸系统阻力（Res）和动态顺应性（Cdyn）的测定、以及用于组织形态计量学的肺组织制备与固定，应在不同的动物个体中分别进行。然而，在腹腔葡萄糖耐量试验（ipGTT）后进行Res和Cdyn的测定是可行的。由于ipGTT过程中产生的应激可能干扰肺功能检测所需的麻醉效果，建议在ipGTT后设置约2周的恢复期，以使小鼠恢复体重减轻及血液参数的变化¹²。

1. 腹腔注射葡萄糖耐量试验（ipGTT）的准备工作

注意：禁食 12 小时后，完整的腹腔葡萄糖耐量试验（ipGTT）大约需要 2 小时。

1. 由于应激会显著影响血糖水平，因此必须对小鼠进行适应性处理，并对科研人员进行相关操作培训。
2. 在安静且无应激的条件下将动物转移至实验区域。
3. 考虑采用高热量饮食诱导小鼠肥胖。有关进一步建议，请参见讨论部分。
4. 过夜禁食12小时，但不限制饮水。第二天，在禁食12小时后，按照制造商的说明书准备血糖仪（参见 材料表通过将新的试纸条插入试纸条端口。
5. 使用无菌剪刀剪取小鼠尾尖，同时轻轻固定小鼠尾部，立即取一滴自由流出的血液（最小样本量0.5 µL）滴加至血糖仪试纸，测定空腹血糖值。
   注意：在充分加样后，屏幕将开始倒计时。4 秒后，检测结果将显示在屏幕上。
6. 随后，使用彩色标记对动物进行个体称重并标记。
7. 按2 g葡萄糖/kg体重给药 通过 腹腔注射。确保注射体积为每10克体重0.1 mL（使用27 G针头和1 cc注射器）。
8. 随后，分别在15、30、60和120分钟时，将一滴自由流出的血液加至新的试纸上，测定血糖水平。
   注意：可通过轻柔地向尾尖方向按摩来增加血流量。如果尾部伤口结痂，使用浸有0.9%氯化钠溶液的无菌棉签清洁伤口。
9. 让动物在测量间隔期间回到各自的饲养笼中休息，并可自由获取饮水。

2. 肺功能分析以测量呼吸系统阻力和动态顺应性

注意：为了无干扰地测量 Res 和 cDyn，需要在深度麻醉下对小鼠进行通气。无应激的动物操作和对麻醉状态的适当监测至关重要。有关使用无菌技术的一般操作说明，请参阅 Hoogstraten-Miller et al.¹⁵ 的文章

1. 每次实验前校准体积描记仪，并在软件中设置研究参数（参见 材料表).
2. 手术前，将动物深度麻醉 通过 腹腔注射赛拉嗪（10 mg/kg 体重）和氯胺酮（100 mg/kg 体重）（使用27 G针头和1 cc注射器）。确保注射体积为每10 g体重0.1 mL。
   注意：由于氯胺酮在小鼠中具有良好的镇痛效果，因此无需额外的镇痛处理。侵入性气管插管/体积描记术操作约需5-7分钟，之后即可开始数据采集。
3. 将小鼠仰卧置于加热垫上，以维持其体温。
4. 用眼膏涂抹眼睛以防止麻醉期间眼睛干燥。
5. 通过夹捏脚趾观察反应，持续监测麻醉深度。
   注意：可能需要追加麻醉剂以维持手术所需的麻醉水平。
6. 用70%乙醇润湿甲状腺手术区域的毛发。
7. 使用镊子提起皮肤，在胸骨颈静脉切迹与下颌骨联合突之间沿中线小心切开皮肤约1 cm，于直视下用钝头剪刀剪开皮肤图1A).
8. 观察皮下脂肪组织和甲状腺 gland。
9. 在峡部仔细钝性分离两侧甲状腺叶，并解剖胸骨甲状肌和胸骨舌骨肌，以暴露气管（图1B注意避免损伤任何血管而导致出血，因为这可能对心血管系统产生不良影响，进而影响测量结果。
10. 随后，使用钝头镊子将4-0编织外科缝线穿过气管与食管之间。用显微剪刀在靠近喉部的气管软骨环之间仔细切开气管。
11. 在可视控制下使用气管插管（直径0.04英寸/1.02毫米）进行插管图1C）。固定试管 通过 使用手术缝线进行结扎，以避免系统发生任何泄漏。
12. 接下来，将动物移至体腔室的加热床，并将气管插管连接至面罩板图1D）并通过按下控制器前面板上的通风按钮来开启通风图1E).
13. 通过观察胸廓运动与呼吸频率同步情况来评估通气效果。为确认气管插管位置正确，需确保胸廓两侧同步运动。
14. 在计算机屏幕上观察压力信号（图1F）。确保通气曲线均匀。若不均匀，需取下动物并检查手术侧，注意是否有血液或黏液阻塞气管插管。
    注意：对于体重为20-25 g的成年动物，呼吸机设置如图所示 图2 根据制造商的建议进行操作。
15. 为控制通气过程中跨肺压的变化，将一根食管导管（直径0.04英寸/1.02毫米）插入食管，深度应大致与肺部水平相当。置管时观察屏幕，选择屏幕上显示压力偏转最大且心脏伪影最小的位置放置导管。
16. 手术后，为动物做好测量准备。重新注射麻醉剂 通过 使用27号针头和1 cc注射器，按100 mg/kg体重剂量进行腹腔注射氯胺酮。确保注射体积为每10 g体重0.1 mL。
    注意：为评估支气管高反应性，需雾化吸入乙酰甲胆碱（methacholine），该物质为副交感神经系统非选择性毒蕈碱受体激动剂，可诱导支气管收缩。数据采集分为四个不同阶段（图3).
17. 根据制造商的说明书开始数据采集。
    注意：该软件会自动引导用户完成采集过程。
18. 在雾化器中加入10 µL PBS（溶剂），适应5分钟后开始雾化。随后进入3分钟的反应阶段，记录Res（cmH₂O/mL/s) 和 cDyn (mL/cmH₂O）进行测量。每次雾化结束后，给予动物 3 分钟的恢复期，然后再进行下一次雾化。
19. 按照软件提示，在呼吸机上逐步应用10 µL体积、浓度递增的乙酰甲胆碱（2.5 µg/10 µL、6.25 µg/10 µL 和 12.5 µg/10 µL）。
20. 完成所有测量并记录后，通过颈椎脱位法处死动物。

3. 成年小鼠肺组织分离用于定量组织形态计量学分析

1. 深度麻醉动物 通过 腹腔注射赛拉嗪（Xylazine，10 mg/kg 体重）和氯胺酮（Ketamine，100 mg/kg 体重）（使用27 G针头和1 cc注射器）。注射体积应为每10 g体重0.1 mL。
   注意：达到手术耐受状态后，准备工作约需5分钟，随后进行器官灌注和30分钟的固定。
2. 当动物达到手术耐受状态（脚趾捏压无反应）后，用70%乙醇对动物进行消毒，并用手术胶带将其固定在垫子上。
3. 通过心脏穿刺放血处死动物。简言之，使用钝头剪刀经皮肤和腹膜作正中切口打开腹腔。
4. 找到位于肝脏头侧的膈肌，并小心地将肝脏与膈肌分离。
5. 用钝头剪刀在膈肌上做一个小切口，然后用连接2 mL注射器的20 G针头穿刺心脏左心室，缓慢放血处死动物。
   注意：缓慢而仔细地放血至关重要，可防止心室因负压而塌陷，从而避免干扰正常的血流。
6. 通过胸骨旁切口，使用弯头钝头剪刀沿整个肋骨全长轻轻切开胸腔，解剖肺脏。
7. 随后，抬起肋骨以暴露胸膜腔（图3C). 移除胸腺以暴露心脏和肺。
   注意：可选的右心室注射，随后用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）灌注肺血管系统，再用固定液灌注例如，可以使用4%（质量/体积）多聚甲醛（PFA）。需注意，该方法可能导致肺泡隔破裂的风险增加，从而对肺组织结构产生不利影响。
8. 首先小心地移除心脏，然后解剖肺脏。
9. 随后，使用钝头镊子将4-0编织外科缝线穿过气管与食管之间。
10. 接下来，在靠近喉部的气管软骨之间小心切开气管，用静脉套管（26 G）进行插管，并在20 cm H₂O的恒定压力下通过压力固定法充气肺脏。₂O 使用固定剂例如4%（质量/体积）的PFA
11. 对于PFA固定，将固定液在室温下作用30分钟。随后结扎气管并移除插管。接着小心切除肺组织，避免损伤，将其置于固定液中于4 °C过夜保存。
    注意：根据ATS/ETS共识论文，可选用2.5%戊二醛（GA）缓冲的四氧化锇（OsO4）和尿嘧啶溶液进行适当的组织固定。有关进一步的组织制备步骤，请参见Hsia的共识论文。 等¹⁴

结果

腹腔注射葡萄糖耐量试验（ipGTT）（图4）、肺功能检测（图5）以及苏木精-伊红染色肺组织的代表性图像（图6）的代表性结果。

在高脂饮食（HFD）喂养7周后的肥胖小鼠（蓝色）中进行腹腔注射葡萄糖耐量试验（ipGTT）。以标准饮食喂养的小鼠作为对照组（黑色）。肥胖小鼠在腹腔注射葡萄糖后15分钟和30分钟血清葡萄糖水平升高，表明细胞葡萄糖摄取能力受损（图4）。

为了研究肥胖对肺功能的影响，对高脂饮食（HFD）喂养7周后的肥胖小鼠（蓝色）进行了侵入性肺功能分析。与对照小鼠（黑色）相比，肥胖小鼠的气道阻力...

讨论

本报告提供了三种不同的方法，用于分析肥胖对葡萄糖代谢和肺部结局的影响。首先，葡萄糖耐量试验可用于分析细胞内葡萄糖摄取情况，并可提示是否存在胰岛素抵抗。其次，全身体积描记法是一种测量肺功能的技术，有助于评估新型治疗方法的有效性。第三，标准化的固定方案对于进行定量形态计量分析以评估肥胖对结构改变的影响至关重要。

动物研究中饮食诱导的肥胖

与现有方法及未来应用的相关性：为了模拟导致肥胖的人类饮食习惯，饮食诱导肥胖（DIO）模型在啮齿类动物中被广泛应用。与使用模拟代谢性疾病的基因修饰小鼠相比，DIO模型能够更有效地分析疾病的病因、病理机制以及未来的治疗方案。Heydemann近期的一篇综述 等，概述了糖尿病研究中不同的小鼠高脂饮食模型¹⁶特定营养成分的调整为未来研究微量和宏量营养素对肥胖分子机制的影响，以及对肺部结构和功能的影响提供了可能。

修改与故障排除：已有多种研究报告表明，通过改变饮食中营养成分的组成可诱导肥胖

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
GlucoMen LX	A.Menarini 诊断公司，意大利佛罗伦萨	38969	血糖仪
GlucoMen LX 传感器	A.Menarini 诊断公司，意大利佛罗伦萨	39765	试纸条
葡萄糖 20%	B. Braun，德国梅尔松根	2356746
FinePointe 软件	DSI, MC s´Hertogenbosch，荷兰	601-1831-002
FinePointe RC 单点小鼠实验台	DSI, MC s´Hertogenbosch，荷兰	601-1831-001
FPRC 控制器	DSI, MC s´Hertogenbosch，荷兰	601-1075-001
FPRC 气溶胶模块	DSI, MC s´Hertogenbosch，荷兰	601-1106-001
Aerogen 雾化头-5.2-4μm	DSI, MC s´Hertogenbosch，荷兰	601-2306-001
镊子	FST，加拿大不列颠哥伦比亚省	11065-07
钝头剪刀	FST，加拿大不列颠哥伦比亚省	14105-12
显微剪刀	FST，加拿大不列颠哥伦比亚省	15000-00
Perma-Hand 4-0	Ethicon，美国波多黎各	736H	外科缝合线
Roti-Histofix 4%	Roth	P087.1	4% 多聚甲醛
Ketaset	Zoetis，德国柏林	10013389	氯胺酮
Rompun 2%	Bayer，德国勒沃库森	770081	赛拉嗪