在部分乳腺癌中可观察到HER2阳性细胞的异质性分布，这会带来临床诊疗上的难题。本文介绍了一种可靠且经济高效的方案，用于在大量经过异质性处理的乳腺癌样本中定义、量化并比较HER2肿瘤内的遗传异质性。
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本文内容
摘要
摘要
针对人表皮生长因子受体2（HER2）的靶向治疗已显著改善HER2阳性乳腺癌患者的预后。然而，少数病例中HER2阳性细胞呈异质性分布，这给临床诊疗带来重大挑战。迄今为止，尚无可靠且标准化的方案用于此类情况的表征与定量分析。 HER2 大规模队列中异质性基因扩增的研究已被提出。本文中，我们介绍一种高通量方法，可同时评估多个乳腺癌不同空间区域的HER2状态。具体而言，我们阐述了构建增强型组织微阵列（TMAs）的实验室操作流程，该流程整合了对肿瘤的靶向定位 mapping。所有TMA参数均针对银染 原位 福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）乳腺组织的杂交（SISH）。预后和预测性生物标志物的免疫组织化学分析（即，ER、PR、Ki67 和 HER2）应采用自动化程序进行检测。本研究已建立一种定制化的SISH方案，可在经历不同固定、处理和储存流程的多种组织上实现高质量的分子分析。本研究提供了原理性证据，表明可通过一种高效且经济的方法，在经不同方式处理的多种乳腺癌样本的不同解剖区域中，同时定位特定的DNA序列。
引言
HER2 是一种原癌基因，在所有浸润性乳腺癌中约有 15 - 30% 存在该基因的过表达和扩增1,2。HER2 过表达通过免疫组织化学（IHC）检测显示强膜阳性染色（3+）的细胞比例超过 >10% 来推断；而基因扩增则需通过原位杂交（in situ hybridization, ISH）计数至少 20 个细胞进行评估，当 HER2/着丝粒比值 ≥2 或基因拷贝数 ≥6 时可判定为扩增3。
肿瘤内遗传异质性在乳腺癌中已有广泛描述，可能对生物标志物评估和治疗反应产生不利影响4。根据美国病理学家学院（CAP）的定义，当HER2在超过>5%且少于<50%的浸润性肿瘤细胞中发生扩增时，即存在HER2异质性5。遗憾的是，乳腺癌中HER2空间异质性的实际发生率在病理学家之间仍存在争议，一些研究者认为这是一种极为罕见的现象，而另一些研究则提示高达40%的病例存在HER2异质性1,5,6....
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方案
本研究已获得意大利米兰IRCCS卡格兰达基金会综合医院机构审查委员会的批准。
1. 患者与组织标本的选择
- 获取所有待分析病例的存档切片，包括原始诊断时所有的苏木精-伊红（H&E）染色切片和免疫组化（IHC）切片，若存在，还需获取一份配对的非肿瘤性乳腺组织的H&E切片（例如，手术切缘）。
- 进行病例复核。
注意：此项工作应由至少两名具有乳腺病理学经验的病理学家共同讨论诊断切片，并以协作方式解决分歧。可使用传统显微镜或远程病理学工具（多中心研究中推荐使用后者）。如有分歧无法达成一致，应排除所有存在争议的病例。- 根据最新版《世界卫生组织（WHO）乳腺肿瘤分类》对所有病例进行组织学重新分类18。
- 确保每个病例的正常组织（如存档临床样本中存在）至少包含一个非肿瘤性的终末导管小叶单位。
- 使用明场显微镜识别所有显示细胞学、结构或免疫组化特征异质性的肿瘤区域（由病理学家与将构建组织微阵列（TMA）的技术人员共同完成）。
- 使用标记笔在玻璃切片上，或使用数字切片软件中的相应工具，标出明确的解剖位置区域（图1A）。
- 根据所选切片，从档案....
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结果
总体而言，共有444例浸润性乳腺癌被纳入15个专门优化用于原位杂交（ISH）分析的组织微阵列（TMA）中。在采集的2,664个点中，2,651个（99.5%）代表了先前选定的区域，因此被认为适用于后续分析。通过免疫组织化学（IHC）和原位杂交（SIH）评估肿瘤内异质性，特别关注HER2阳性克隆在肿瘤不同拓扑区域中的异质性分布。 表3 展示了所分析病例的生物学特征，重点关注不同组织学类型中ER、PR、Ki67和HER2的表达状态。特别是，18%的病例被发现存在HER2阳性细胞 >10%的肿瘤细胞，因此符合HER2阳性评估的特征。有趣的是，该数值接近于文献报道的HER2阳性乳腺癌发病率范围的下限。另一方面，HER2状态在HER2阳性和HER2阴性乳腺癌的不同区域中均表现出异质性。图3, 表4)，进一步支持了乳腺癌在基因组水平上是一种高度异质性疾病的观念。SISH分析的失败率为0.8%，共有2,629/2,651个位点显示二硝基苯酚标记的探针与靶.......
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讨论
本文详细介绍了在异质性处理的乳腺癌高产出组织微阵列（TMA）中进行HER2基因及其相应着丝粒SISH分析的实验室策略。该方法成本效益高，可在大多数实验室中实施，适用于从病理档案中获取的大样本乳腺癌队列中HER2基因扩增异质性的研究。
由于HER2检测在乳腺癌临床诊疗中的重要性及其异质性表达带来的挑战，我们开发了一种高通量检测方案，用于评估肿瘤内和肿瘤间HER2基因异质性。所分析的区域包括基于特定细胞学、组织结构和免疫组化特征的癌前病变及浸润性病变成分。
在本方案中，有几个关键阶段需要谨慎管理。其中一个关键步骤是感兴趣区域的选择。我们发现，通过多学科方法对不同地形区域进行注释，对于确保最终分子分析的质量至关重要。特别是，由病理学家和技术人员共同复查诊断切片，可极大增加合格位点的数量即，这些点反映了载玻片上识别的区域），从而降低单个点分析的失败率。然而，在进行连续切片以完成多重免疫组化（IHC）和原位杂交（ISH）分析后，部分肿瘤组织点可能丢失。为克服这一问题.......
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Surgipath Paraplast | 德国韦茨拉尔，Leica Biosystems，欧盟 | 39601006 | 组织包埋介质，56 °C 熔点 |
| 伊红Y 1% 水溶液 | Bio Optica，意大利米兰，欧盟 | 510002 | 伊红黄，水溶性 |
| Carazzi’苏木精染色 | Bio Optica，意大利米兰，欧盟 | 506012 | 使用碘酸钾成熟的明矾苏木精 |
| 钻石品质 | Laboindustria，意大利阿尔泽尔格兰德，欧盟 | 33533 | 26x76 mm 显微镜载玻片 |
| Leica CV包埋机 | 德国韦茨拉尔，徕卡生物系统公司，欧盟 | 14046430011 | 一种不含单体的封片介质，基于丁基甲基丙烯酸酯聚合物溶于二甲苯 |
| FLEX IHC 显微镜载玻片 | 安捷伦科技（Dako）， 美国加利福尼亚州圣克拉拉 | K8020 | 用于免疫组化中福尔马林固定石蜡包埋组织黏附的包被载玻片 |
| BenchMark ULTRA | Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市 | N750-BMKU-FS | 染色片系统 |
| CONFIRM 抗雌激素受体（ER）（SP1）兔单克隆一抗 | Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市 | 790-4324 | 一抗，即用型 |
| CONFIRM 抗孕激素受体（PR）（1E2）兔单克隆一抗 | Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市 | 790-2223 | 一抗，即用型 |
| CONFIRM 抗 Ki-67 (30-9) 兔单克隆一抗 | Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市 | 790-4286 | 一抗，即用型 |
| PATHWAY HER2 (4B5) 兔单克隆一抗 | Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市 | 790-4493 | 一抗，即用型 |
| ultraView Universal DAB 检测试剂盒 | Ventana医疗系统公司，图森，亚利桑那州，美国 | 760-500 | 用于检测小鼠 IgG、小鼠 IgM 和兔一抗的间接、无生物素系统 |
| INFORM HER2 双重 ISH DNA 探针混合液 | Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市 | 780-4422 | INFORM HER2 双重 ISH 检测——一种双色原位杂交的 FDA 批准自动化检测方法，用于确定乳腺癌患者的 HER2 基因状态 |
| ultraView Silver ISH DNP 检测试剂盒 | Ventana医疗系统公司，图森，亚利桑那州，美国 | 800-098 | |
| ultraView Red ISH DIG 检测试剂盒 | Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市 | 800-505 | |
| ISH蛋白酶3 | Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市 | 780-4149 | 在原位杂交（ISH）过程中用于去除目标DNA序列周围蛋白质的试剂 |
| 苏木精 | Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市 | 760-2021 | 改良吉尔苏木精复染试剂 |
| 苏木精 II 复染 | Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市 | 790-2208 | 改良梅耶苏木精复染试剂 |
| 显色试剂 | Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市 | 760-2037 | 用于玻璃载片上苏木精染色切片返蓝的缓冲碳酸锂水溶液 |
| HybReady | Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市 | 780-4409 | 原位杂交实验用甲酰胺缓冲液 |
| EZ Prep (10x) | Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市 | 950-102 | 用于免疫组化（IHC）和原位杂交（ISH）反应中去除组织样本石蜡的浓缩溶液，并按1:10比例稀释使用。 |
| SSC缓冲液（10X） | Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市 | 950-110 | 氯化钠-柠檬酸钠缓冲液用于杂交后的严格性洗涤、染色步骤间的玻片冲洗，并为原位杂交反应提供稳定的水相环境。使用时按1:5稀释。 |
| ULTRA LCS | Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市 | 650-210 | 预稀释（即用型）盖玻片溶液，用于免疫组化（IHC）和原位杂交（ISH）反应中水相试剂与空气之间形成屏障，防止蒸发 |
| 10倍反应缓冲液 | Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市 | 950-300 | Tris 缓冲液（pH 7.6） ± 0.2）用于免疫组化（IHC）和原位杂交（ISH）染色步骤之间冲洗载玻片。按1:10稀释。 |
| ULTRA 细胞培养条件优化（ULTRA CC2） | Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市 | 950-223 | 免疫组织化学和原位杂交中组织样本处理的预处理步骤。即用型。 |
| ULTRA 细胞培养条件优化（ULTRA CC1） | Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市 | 950-224 | |
| ultraView Silver Wash II | Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市 | 780-003 | 即用型溶液，用于免疫组化与原位杂交染色步骤之间的玻片冲洗 |
| 切片机 | 德国韦茨拉尔，徕卡生物系统公司，欧盟 | RM 2255 | 自动旋转切片机 |
| 多染色仪 | 德国韦茨拉尔，徕卡生物系统公司，欧盟 | ST 5020 | 自动染色与封片工作站 |
| 微核心 1 | Alphelys，法国普莱西，欧盟 | 00-MICO-1 | 带有嵌入式 TMA Designer 2 软件的半自动组织芯片阵列仪 |
| Aperio ScanScope CS2 | 德国韦茨拉尔，徕卡生物系统公司，欧盟 | K080254 | 图像采集设备 - 数字病理扫描仪 |
| Tissue-Tek III Uni-Cassette | Sakura Finetek Europe B.V | 4135 | 盒式结构 |
| Tissue-Tek Paraform 标准包埋模具 | Sakura Finetek Europe B.V | 7055 | 不锈钢基底金属模具 |
参考文献
- Allison, K. H., Dintzis, S. M., Schmidt, R. A. Frequency of HER2 heterogeneity by fluorescence in situ hybridization according to CAP expert panel recommendations: time for a new look at how to report heterogeneity. Am J Clin Pathol. 136 (6), 864-871 (2011).
- Montemurro, F., Scaltriti, M.
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