本方案描述了使用改良T型迷宫评估缺氧性心脏骤停所致脑缺血中功能学习/记忆的方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
背景：在全脑缺血（即心脏骤停）模型中，由于手术后运动能力较差，评估轻度至中度认知功能障碍可能较为困难。例如，接受手术操作的大鼠在进行莫里斯水迷宫实验时可能无法游泳，从而导致实验无效。
新方法：我们建立了一种改良的行为学自发交替T型迷宫测试。改良T型迷宫方案的主要优势在于其设计相对简单，但足以有效评估脑缺血后的功能学习/记忆能力。此外，数据分析过程简便直接。我们采用T型迷宫检测大鼠在轻度至中度（6分钟）窒息性心脏骤停（ACA）存在或不存在条件下的学习/记忆缺陷。大鼠具有天然的探索倾向，会交替进入T型迷宫的不同臂，而海马损伤的大鼠则倾向于选择固定一侧，导致自发交替率降低，从而揭示在有或无ACA情况下与海马相关的功能性学习/记忆能力。
结果：与对照组相比，ACA组的侧向偏好比率更高，而交替次数更低。
与现有方法的比较：莫里斯水迷宫和巴恩斯迷宫均常用于评估学习/记忆功能。然而，莫里斯水迷宫相比其他迷宫更具应激性。巴恩斯迷宫广泛用于测量参考记忆（长期记忆），而ACA诱导的神经认知缺陷与工作记忆（短期记忆）的关系更为密切。
结论：我们建立了一种简单而有效的方法，通过T型迷宫在全脑缺血模型（ACA）中界定工作记忆（短期记忆）。
引言
根据美国心脏协会（2017年）的数据，心脏骤停（CA）导致的死亡每四分钟发生一次，在美国每年影响超过40万人1。已有充分证据表明，心脏骤停会因血液灌注不足而导致神经元性脑损伤2,3,4。心脏骤停引起的脑损伤主要发生在海马体对缺血敏感的CA1区5,6,7，影响对学习和记忆至关重要的神经元8,9,10,11,12。此外，在缺血条件下海马体（即CA1神经元）树突棘密度的减少，在空间记忆障碍中起关键作用13,14,15
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有实验操作均按照美国国立卫生研究院的指南进行，并经机构动物护理和使用委员会（LSU Health Sciences Center-Shreveport）批准，用于使用雄性Sprague Dawley大鼠（300-350 g，9-10周龄）。在进行ACA手术前，大鼠禁食过夜。
1. T型迷宫装置的设计与设置
注意：T型迷宫的设计应基于Deacon和Rawlins在2006年提出的模型31。
- 使用 SketchUp32 设计迷宫的三维结构。为创建T型迷宫的三维结构，构建起始臂，其外部长度为200 mm，宽度为165 mm，高度为148 mm，以适应3D打印机的打印尺寸。壁厚设为5.5 mm，地板厚度设为8 mm。
- 使用3D打印机打印迷宫（参见材料表）32。如果实验室中没有3D打印机，可使用其他材料，如木材、中密度纤维板或塑料（例如聚氯乙烯），这些材料可在家居装修商店购买。
- 由于打印区域存在高度限制，将迷宫的墙壁分为两个独立的3D打印部件，并在组装迷宫时连接在一起（即，在迷宫部分上增加第二段墙体高度，使总高度增加140 mm，墙体总高度达到280 mm）。每个独立的3D打印底座均包含一个“T”形锁定机构，使一个部分与....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
全脑缺血（ACA）主要导致工作记忆（短期记忆）功能障碍28,29。为评估ACA后学习与记忆功能，我们采用改良的自发交替实验来评价工作记忆（短期记忆）30。自发交替实验结果显示，与对照组（62.96 ± 6.07%）相比，ACA组连续三天的交替率显著降低（26.19 ± 4.96%）（*p0.05）35，这是由于接受ACA处理的大鼠相较于对照组出现了明显的偏向行为（82.14 ± 4.57% 对 62.89 ± 2.86%，*p0.05） （图3a 和 3b）35，从而表现出较低的自发交替率。结果以均值 ± 标准误（S.E.M.）表示。数据采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
与Deacon和Rawlins的方案相比，本研究进行了若干修改31。使用3D打印机制造T型迷宫，3D打印为商业化T型迷宫提供了经济且成本效益高的替代方案。为降低大鼠在实验过程中的焦虑情绪，T型迷宫实验在光线最暗的暗室中进行。当大鼠进入其中一个目标臂后，我们轻柔地封闭相对的另一臂。这一操作可避免实验中可能引起的压力，同时防止在放下闸门时对大鼠尾巴造成损伤。任何不必要的应激都会抑制大鼠在后续实验中的表现。因此，本研究采用"T"型连接块作为闸门，以消除测试过程中塑料滑动闸门所产生的摩擦噪音。该步骤可显著降低大鼠在T型迷宫实验中的焦虑水平。
适应是T型迷宫实验成功的关键步骤，因为焦虑的大鼠缺乏在迷宫中奔跑的动力。因此，必须确保大鼠在实验前已适应人类的触摸、高度以及从笼子转移到迷宫的过程。当操作者试图接触焦虑的大鼠时，它们会发出吱吱声或嘶嘶声。此外，焦虑的大鼠在T型迷宫实验过程中通常表现出长时间的僵直反应，或拒绝进入迷宫奔跑，且大部分时间停留在起始臂，不探索迷宫其他区域。如果大鼠不进入迷宫奔跑，可轻触其尾部以促使其移动。另一种可.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作得到了美国国立卫生研究院/国家神经疾病与卒中研究所资助项目1R01NS096225-01A1、美国心脏协会资助项目AHA-13SDG1395001413、AHA-17GRNT33660336、AHA-17POST33660174、路易斯安那州立大学研究委员会资助项目、马尔科姆·费斯特心血管研究奖学金以及伊芙琳·F·麦克奈特脑研究所的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3D 打印机 | MakerBot | Replicator | 第五代 |
| 3D 打印机耗材 | Hatchbox | PLA，1.75 mm 线径 | |
| 200 证明纯乙醇 | Koptec | V1005SG | |
| Sani-Chips | PJ Murphy-Forest Products | 粒径：8 至 20 目；2.2 立方英尺/包；可高压灭菌袋装 | |
| 大鼠 | Charles River Laboratories | Sprague-Dawley | |
| 维库溴铵溴化物 | Sun Pharmaceutical | 47335-931-40 | 10 mg |
| 肾上腺素 | Par Pharmaceutical | 42023-103-01 | 肾上腺素氯化物溶液 1 mg/mL，1:1000 |
| 盐酸丁丙诺啡注射液 | Pfizer | 00409-2012-32 | 0.3 mg/mL |
| SketchUp | Trimble Inc. | 三维建模软件 | |
| VentElite 小动物呼吸机 | Harvard Apparatus | 55-7040 | 适用于从小鼠到豚鼠（10 g 至 1 kg）体型范围的动物 |
| PowerLab 8/35 | Adinstruments | PL3508 | 8 个模拟输入通道 – 其中 4 个可用于差分模式。 |
| Bio Amps | Adinstruments | FE132 | Bio Amp 是一种电隔离的高性能差分生物放大器，专为测量多种生物信号（如心电图、肌电图和脑电图记录）而优化。 |
| Quad Bridge Amp | Adinstruments | FE224 | 四通道非隔离桥式放大器，设计用于使 PowerLab 能够连接大多数直流桥式换能器。 |
| LabChart 8 | Adinstruments | ||
| ABL80 FLEX CO-OX 血气分析仪 | Radiometer | pH / p CO2 / p O2 | |
| SURFLO 聚四氟乙烯静脉导管 | Terumo | sc-361556 | 仅使用柔性薄壁导管（49 mm 长） |
| 移液/输注针头 | Hamilton | 7748-03 | 17 号；93 mm 长；10 度角 |
| Classic T3 蒸发器 | SurgiVet | VCT302 | Classic T3 异氟烷漏斗加注型 |
| ENVIRO-PURE 活性炭罐 | SurgiVet | 32373B10 | 设计用于吸收废气麻醉气体 |
| O2 单流量计 | SurgiVet | 32375B1 | 0–1000 mL |
| N2O 流量计 | VetEquip | 401721 | 0–4 LPM |
| Clay Adams Intramedic 鲁尔短管接头（无菌） | Becton Dickinson | 427565 | 23 号 |
| 微型镊子 | Black and Black 外科 | B3FRC-18 RM-8 | 7 1/4"（18 cm），8 mm 右弯，带配重和 2 mm 导引销，平台尺寸 6 × 0.3 mm，弯曲型。 |
| Halstead 蚊式止血钳 | Roboz | RS-7111 | 弯曲型；5" 长，1.3 mm 尖端直径，2.1 mm 颌宽 |
| Mixter 镊子 | Roboz | RS-7291 | 5.25" 弯曲超精细，1.1 mm 尖端 |
| Castroviejo 微型解剖弹簧剪 | Roboz | RS-5650 | 直型，尖锐端头；9 mm 刃口；0.15 mm 尖端宽度；3 1/2" 总长度 |
| Mayo-Stille 剪刀 | Roboz | RS-6891 | 5.5" 圆弧弯曲 |
| Dumont #5 镊子 | Roboz | RS-5058 | 45 度 Dumoxel 尖端尺寸 0.10 × 0.06 mm |
| Olsen-Hegar 剪刀与持针器组合 | Roboz | RS-7884 | 交叉锯齿尖端；5.5" 长 |
| Moloney 镊子 | Roboz | RS-8254 | 带齿；轻微弯曲；4.5" 长 |
参考文献
- Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133, e38-e360 (2016).
- Beuret, P., et al. Cardiac arrest: prognostic factors and outcome at one year. R....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
