视网膜色素上皮细胞可作为干性年龄相关性黄斑变性晚期的细胞替代疗法。本方案描述了地理样萎缩的大眼模型的建立，以及将人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞移植至该疾病模型的视网膜下腔的过程。
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方法文章
地理萎缩大眼模型中人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞的视网膜下移植 关键词：人胚胎干细胞，视网膜色素上皮细胞，地理萎缩，视网膜下移植，大眼模型
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
地理性萎缩（GA）是干性年龄相关性黄斑变性的晚期阶段，其特征是视网膜色素上皮（RPE）层的丧失，进而导致视网膜重要结构的继发性退化例如，光感受器）导致严重的视力损害。同样，在接受玻璃体内抗血管内皮生长因子（VEGF）治疗的晚期湿性年龄相关性黄斑变性（AMD）患者的长期随访中，也观察到视网膜色素上皮（RPE）的丧失以及视力下降。因此，一方面，从无限来源高效地获得可用于替代治疗的RPE细胞至关重要；另一方面，重要的是在一种接近人类临床应用的手术和成像方法的疾病模型中，评估所获得细胞的行为及其整合能力。本文基于我们先前发表的研究，提供了一项详细方案，描述了利用白化兔眼建立地理性萎缩（GA）的临床前模型，用于在具有临床相关性的环境中评估人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞（hESC-RPE）。将已分化的hESC-RPE移植至未经处理的眼睛或经NaIO₃处理诱导RPE损伤的眼睛中3采用25G经玻璃体平坦部技术诱导类似GA的视网膜变性。通过多模态高分辨率无创实时成像对变性区域及移植区域进行评估。
引言
本方案描述了一种用于评估人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞（hESC-RPE）在视网膜下腔移植后整合情况的大眼非临床地理样萎缩（geographic atrophy, GA）模型的建立方法。此处详述的技术已在最近发表的3篇论文中应用，证明了可从人胚胎干细胞高效生成富集、纯化且具有功能的RPE细胞群体。1，以及通过视网膜下注射生理盐溶液诱导产生外层视网膜损伤和类似地理性萎缩（GA）的表型即，BSS 和 PBS）或 NaIO₄3 在兔眼中2,3我们进一步证明，人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮（hESC-RPE）的视网膜下悬浮移植可形成广泛的功能性单层结构，并具有光感受器保护能力2.
使用兔眼构建地理性萎缩（GA）疾病模型具有多项优势。首先，兔眼的体积约为成人眼球体积的70%，可实现具有临床意义的细胞移植，且所需细胞密度远低于常规小鼠等小型啮齿类动物实验中所用的密度（1,000个细胞/µL）。 与 50,000 个细胞/µL4,5其次，啮齿类动物的手术通常经巩膜通过脉络膜进行，这会破坏视网膜屏障，....
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方案
以下方案遵循卡罗林斯卡学院的动物护理指南。所有使用新西兰白兔（材料表）的动物实验均已获得地区动物伦理委员会（Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd）批准（许可号：dnr 56/15）。使用人胚胎干细胞（hESC）（许可号：dnr 2011/745-31/3）以及人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞（hESC-RPE）的移植与操作（许可号：dnr 2013/813-31/2）也符合瑞典法律法规及卡罗林斯卡学院的相关规定，并已获得地区人类伦理委员会（Regionala Etikprövningsnämnden i Stockholm）的批准。
1. 向大眼动物模型中进行玻璃体下注射碘酸钠（NaIO3）
- 通过在大腿肌肉注射麻醉剂混合物使动物麻醉 使用30 G注射器将氯化钠溶液中的35 mg/kg氯胺酮和5 mg/kg赛拉嗪注射至动物体内，并使用含0.75%环戊通和2.5%去氧肾上腺素的眼药水进行点眼以扩大瞳孔。若动物后肢受到强力夹捏时不产生反应，则表明麻醉已达到适当深度。
- 将兔子置于手术显微镜下，使其头部朝向术者（图1A）。使用开睑器并用无菌纱布去除眼睑和瞬膜，以尽量降低污染风险。在麻醉状态下，使用平衡盐溶液（BSS）滴眼，防止双眼干燥。
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结果
代表性 体内 正常白化兔视网膜的BAF、IR-cSLO和SD-OCT图像如图所示 图2注意SD-OCT仪器捕获的不同视网膜层及其特有的光反射水平。
在图1A和图1B中，展示了创建视网膜下隆起的操作装置：放置眼睑拉钩以牵开眼睑，便于插入3个套管穿刺针（图1B），穿刺位置位于距角膜缘1-2 mm处，以避免接触晶状体，穿刺角度与角膜缘呈30-45˚平行方向。这些套管可用于插入可选的灌注导管，以及导光纤维和经巩膜注射针。在手术过程中，散大的瞳孔配合平接触镜可便于观察眼底及视网膜下间隙。
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讨论
在此方案中，大眼型地理萎缩模型的建立及其用于评估人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞整合的临床前研究 体内 被描述。
为了将再生疗法在GA及相关疾病中的临床转化7，开发并优化能够真实反映临床移植和影像学检查方法的技术至关重要。在这方面，兔子具有吸引力：其眼睛相对较大，可进行眼内手术并使用标准成像设备，且与其他大眼动物相比，价格低廉且易于饲养。
我们描述了采用标准的经玻璃体25号套管玻璃体切除术技术，以形成视网膜下隆起（sub-retinal blebs），用于诱导视网膜下损伤或移植hESC-RPE。最初，我们采用三通道设置，如图1B所示，原计划在手术过程中进行玻璃体切除时使用灌注通道（套管）。然而，由于我们发现实施视网膜下注射时无需进行玻璃体切除，因此已省略灌注通道。尽管如此，若将来进一步调整操作流程并需要进行玻璃体切除时，仍应保留第三个通道的选项。
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披露
所有作者均无竞争利益或利益冲突。
致谢
本研究得到了卡罗林斯卡学院、玛格丽特王储妃盲人基金会、埃德温·乔丹眼科研究基金会、瑞典眼科基金会、古斯塔夫五世国王基金会、ARMEC 林德伯格基金会和克朗奎斯特基金会的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NutriStem hESC XF 分化培养基 –bFGF 和 –TGFb | Biological Industries | 06-5100-01-1A | |
| TrypLE Select 1x | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 12563-011 | |
| 不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 14190-094 | |
| 细胞筛网 40 μm 尼龙 | VWR | 732-2757 | |
| 针头 30 G 0.5’’；0.3 mm × 13 mm | BD Microlance | 304827 | |
| Acrodisc 25 mm 注射器滤器 | Acrodisc | PN4612 | |
| 0.4% 台盼蓝 | ThermoFisher Scientific Corp | 15250061 | 使用浓度为 0.2% |
| NaIO3 | Sigma-Aldrich Corp | S4007 | |
| BSS | Alcon Nordic A/S | 65079550 | |
| 70% 乙醇 | Solveco AB | 1047 | |
| 氯胺酮，100 mg/mL | Intervet, Boxmeer | 511519 | 使用剂量为 35 mg/kg 氯胺酮 |
| Rompun vet，20 mg/mL | Bayer Animal Health | 22545 | 使用剂量为 5 mg/kg 赛拉嗪 |
| Triescence，40 mg/mL | Alcon Nordic A/S | 412915 | 玻璃体内注射 2 mg |
| 环戊醇苯肾滴眼液，0.75% + 2.5% | APL | 321968 | 每眼使用 1 滴 |
| Viscotears | Laboratoires Théa | 597562 | |
| 局部生理盐水 | Apotea AB | 7053249369080 | |
| Allfatal vet.，100 mg/mL | Omnidea | 77168 | 使用 100 mg/mL 戊巴比妥钠 |
| 延长管（Hammer） | MedOne Surgical Inc | 3223 | |
| 25 G/38 G 多尖端视网膜下套管 | MedOne Surgical Inc | 3219 | 25 G/38 G |
| 一次性平光镜 | Volk | #VWFD10 | |
| Barraquer Colibri 眼睑牵开器 | AgnTho's AB | 42-020-030 | |
| 无阀套管针 | Alcon Nordic A/S | 8065751448 | |
| 爪状镊 | Bausch & Lomb Nordic AB | ET1811 | |
| Alcon Accurus 400VS 玻璃体切除仪 | Alcon Nordic A/S | 8065740238 | |
| Accurus 25+ 规格玻璃体切除 TotalL Plus 套件 | Alcon Nordic A/S | 8065751493 | |
| SD-OCT 设备 | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA+OCT | 使用 Heidelberg Eye Explorer 版本 1.9.10.0 |
| 24 孔板 | Sarstedt | 83.3922 | |
| Neubauer 血细胞计数板 | VWR | 631-0925 | |
| 新西兰白兔 | Lidköpings Rabbit Farm, Sweden | ||
| hESC-RPE 细胞 | 参见参考文献编号 1 | ||
| Buprenodale Vet，0.3 mg/mL | Dechra | 660500 | 皮下注射 0.5 mL 布托啡诺 |
参考文献
- Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).
- Bartuma, H., et al.
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重印与许可
