地理萎缩大眼模型中人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞的视网膜下移植 关键词：人胚胎干细胞，视网膜色素上皮细胞，地理萎缩，视网膜下移植，大眼模型

摘要

视网膜色素上皮细胞可作为干性年龄相关性黄斑变性晚期的细胞替代疗法。本方案描述了地理样萎缩的大眼模型的建立，以及将人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞移植至该疾病模型的视网膜下腔的过程。

摘要

地理性萎缩（GA）是干性年龄相关性黄斑变性的晚期阶段，其特征是视网膜色素上皮（RPE）层的丧失，进而导致视网膜重要结构的继发性退化例如，光感受器）导致严重的视力损害。同样，在接受玻璃体内抗血管内皮生长因子（VEGF）治疗的晚期湿性年龄相关性黄斑变性（AMD）患者的长期随访中，也观察到视网膜色素上皮（RPE）的丧失以及视力下降。因此，一方面，从无限来源高效地获得可用于替代治疗的RPE细胞至关重要；另一方面，重要的是在一种接近人类临床应用的手术和成像方法的疾病模型中，评估所获得细胞的行为及其整合能力。本文基于我们先前发表的研究，提供了一项详细方案，描述了利用白化兔眼建立地理性萎缩（GA）的临床前模型，用于在具有临床相关性的环境中评估人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞（hESC-RPE）。将已分化的hESC-RPE移植至未经处理的眼睛或经NaIO₃处理诱导RPE损伤的眼睛中₃采用25G经玻璃体平坦部技术诱导类似GA的视网膜变性。通过多模态高分辨率无创实时成像对变性区域及移植区域进行评估。

引言

本方案描述了一种用于评估人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞（hESC-RPE）在视网膜下腔移植后整合情况的大眼非临床地理样萎缩（geographic atrophy, GA）模型的建立方法。此处详述的技术已在最近发表的3篇论文中应用，证明了可从人胚胎干细胞高效生成富集、纯化且具有功能的RPE细胞群体。¹，以及通过视网膜下注射生理盐溶液诱导产生外层视网膜损伤和类似地理性萎缩（GA）的表型即，BSS 和 PBS）或 NaIO₄₃ 在兔眼中^2,3我们进一步证明，人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮（hESC-RPE）的视网膜下悬浮移植可形成广泛的功能性单层结构，并具有光感受器保护能力².

使用兔眼构建地理性萎缩（GA）疾病模型具有多项优势。首先，兔眼的体积约为成人眼球体积的70%，可实现具有临床意义的细胞移植，且所需细胞密度远低于常规小鼠等小型啮齿类动物实验中所用的密度（1,000个细胞/µL）。 与 50,000 个细胞/µL^4,5其次，啮齿类动物的手术通常经巩膜通过脉络膜进行，这会破坏视网膜屏障，可能引发炎症反应及潜在的排斥反应⁶这两个因素共同作用可能导致移植细胞出现多层堆积和聚集，从而使得移植细胞在受损的原生视网膜组织中整体整合效果较差。然而，大眼兔模型允许使用与临床环境完全相同的手术器械进行操作。第三，大眼模型还能够实现高分辨率成像 体内 随时间对移植细胞及其上方视网膜进行成像与监测^1,2,3因此，我们描述了一种具有临床相关性且成本效益高的临床前模型，对于任何致力于正常及病变视网膜和视网膜下腔研究的研究人员而言，该模型应是一种颇具吸引力的啮齿类动物替代方案。

方案

以下方案遵循卡罗林斯卡学院的动物护理指南。所有使用新西兰白兔（材料表）的动物实验均已获得地区动物伦理委员会（Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd）批准（许可号：dnr 56/15）。使用人胚胎干细胞（hESC）（许可号：dnr 2011/745-31/3）以及人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞（hESC-RPE）的移植与操作（许可号：dnr 2013/813-31/2）也符合瑞典法律法规及卡罗林斯卡学院的相关规定，并已获得地区人类伦理委员会（Regionala Etikprövningsnämnden i Stockholm）的批准。

1. 向大眼动物模型中进行玻璃体下注射碘酸钠（NaIO₃）

1. 通过在大腿肌肉注射麻醉剂混合物使动物麻醉 使用30 G注射器将氯化钠溶液中的35 mg/kg氯胺酮和5 mg/kg赛拉嗪注射至动物体内，并使用含0.75%环戊通和2.5%去氧肾上腺素的眼药水进行点眼以扩大瞳孔。若动物后肢受到强力夹捏时不产生反应，则表明麻醉已达到适当深度。
2. 将兔子置于手术显微镜下，使其头部朝向术者（图1A）。使用开睑器并用无菌纱布去除眼睑和瞬膜，以尽量降低污染风险。在麻醉状态下，使用平衡盐溶液（BSS）滴眼，防止双眼干燥。
3. 采用2通道（或可选3通道）25G经玻璃体平坦部技术，使用无阀套管插入显微外科器械进行显微手术图1B）。多功能玻璃体切除仪配有连接灌注套管、眼内照明、玻璃体切割头和眼内激光的接口。进行视网膜下注射时，仅需使用眼内照明，因此采用双通道装置即可。将眼内照明经左上方套管插入，右上方套管用于插入视网膜下注射套管。
   1. 对于三通道手术设置，使用下侧颞部套管针置入BSS灌注套管。若使用可选器械（如玻璃体切除仪），则通过右上方套管针插入。
   2. 使用有齿镊夹住并移开覆盖在穿刺部位上方的结膜，从角膜缘上方1-2 mm处插入上方的两个套管针。
   3. 确保套管针以与角膜缘平行的30–45°角经巩膜插入，进针至套管针尖端中点位置。随后将套管针旋转90°并推进入眼内，方向对准眼球后极。该操作可避免术后巩膜切口渗漏，并降低眼内炎风险。即， 眼部细菌感染）。另见 图2B 用于套管针位置。
   4. 将一次性平接触镜置于角膜上以观察视网膜，眼与接触镜之间使用人工泪液作为接触凝胶图1A).
   5. 吸取 500 µL NaIO₄ 溶液₃ 连接至延长管（由助手操作）和38G聚酰胺尖端套管针（由外科医生操作）的1 mL注射器中。
   6. 通过左上方套管插入眼内照明探头，通过右上方套管插入注射导管，并将导管经玻璃体腔向前推进至视网膜，目标位置为视盘下方区域。
   7. 让套管针尖端缓慢接触视网膜，直至出现局部变白现象。注射过程本身将穿透视网膜，实现视网膜下给药。切勿让套管针刺入视网膜，以免引起出血。
   8. 注入 50 µL NaIO₃ 在5秒内将液体缓慢注射至视网膜下腔。由于视网膜与下方脉络膜之间存在天然的解剖分离平面，注射过程中应逐渐形成一个清晰可见的半透明隆起。
   9. 注射过程中应缓慢回撤针头，但需确保针尖始终位于皮丘内，以尽量减少反流。
   10. 移除内照明装置和注射套管后，使用带齿镊子取出套管鞘，并用镊子尖端或钝端对可自行封闭的无缝线巩膜切口施加轻压30秒。
4. 术后给予10 皮下注射生理盐水以防止脱水。 不要给予 术后 局部用类固醇或抗生素。 术后以及术后次日，皮下注射0.5 mL浓度为0.3 mg/mL的丁丙诺啡作为镇痛剂。
5. 使用后，将所有器械依次浸入70%乙醇、45%乙醇和蒸馏水中，每步数秒。随后用纸巾彻底擦干。
6. 观察动物直至其恢复足够的意识，并将它们全部单独关养。如有需要（例如，用于免疫组织化学目的），通过静脉注射 100 mg/kg 戊巴比妥麻醉动物（参见 材料表).
7. 等待7天后，再进行hESC-RPE细胞的移植。

2. 在经处理的动物中进行hESC-RPE细胞的视网膜下移植

1. 在移植 hESC-RPE 前 1 周，对麻醉动物使用 30 号注射针头，在下颞象限距角膜缘 1-2 mm 处注入 2 mg（100 µL）玻璃体内曲安奈德，此后每 3 个月重复给药一次。注射时针尖应朝向眼球后极，以避免接触晶状体。
2. 按照先前所述方法培养hESC-RPE单层细胞¹.
3. 去除细胞分化培养基（参见 材料表24 孔板中汇合的 hESC-RPE 单层细胞的孔中加入 500 µL PBS（不含 Ca）洗涤每孔²⁺ 和 Mg²⁺重复此操作一次，共计洗涤2次。
4. 弃去上清液，每孔加入 500 µL 胰蛋白酶，于 37 °C 培育 12 分钟。
5. 倾斜培养板，小心吸除胰蛋白酶（细胞应仍附着在培养板上）。加入800 µL新鲜的、37 °C预热的分化培养基，轻轻吹打混悬细胞，必要时可刮取，以获得单细胞悬液。
   注意：若观察到细胞团块，应使用40 µm细胞滤网。
6. 使用0.2%台盼蓝，按照制造商说明书在血细胞计数板中对细胞进行计数。
7. 加入5 mL分化培养基，室温下以300 × g离心5分钟。
8. 弃去上清液，将沉淀重悬于新鲜过滤除菌的PBS（经25 mm注射器滤器过滤）中，调整细胞终浓度为1,000个细胞/µL。
9. 将之前的细胞悬液分装成每份600 µL，置于冰上保存，直至手术期间并保持在冰上。
10. 通过在大腿肌肉注射麻醉剂混合物使动物麻醉 使用30 G注射器将氯化钠溶液中的35 mg/kg氯胺酮和5 mg/kg赛拉嗪注射给药。使用0.75%环戊通和2.5%去氧肾上腺素的混合滴眼液进行瞳孔扩张。若动物后肢受到强力夹捏时无反应，则表明麻醉效果适当。
11. 将兔子置于头朝向术者的位置。使用开睑器并用无菌布去除眼睑和瞬膜，以尽量降低污染风险。在麻醉期间，使用BSS保持双眼湿润，防止干燥。
12. 进行显微手术时，采用双通道（或可选三通道）25G经玻璃体平坦部技术，套管针的位置应与步骤1.3中所述位置相同，并 图2若先前的巩膜切口可见，则应在紧邻但不穿过这些切口的位置进行套管插入，以尽量降低术后渗漏的风险。
    1. 将一次性平接触镜置于角膜上以观察视网膜，使用人工泪液作为眼球与接触镜之间的接触凝胶图1A).
    2. 在正确放置针头后（参见步骤 1.3.5 和 1.3.6），将 50 µL 轻柔混匀的人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞悬液（50,000 个细胞）注射至视网膜下腔。注射位置应以 NaIO₃ 处理区域的中心为目标。₃ 经预处理区域，其特征可辨 "金属的" 内照反射。神经感觉层视网膜应易于分离，形成清晰可见的视网膜下隆起。用无菌 H 冲洗针头₂在兔子之间/使用后，用O冲洗以避免因细胞团块导致针头堵塞。一旦发现堵塞，立即更换针头。
    3. 注射过程中，缓慢回撤针头，但需确保针尖始终位于皮丘内，以最大限度减少反流。
    4. 移除内照明器和注射套管后，使用带爪镊子取出套管针，并用镊子尖端或钝端对无需缝合的自封闭巩膜切口施加轻柔压力，持续30秒。
13. 术后给予10 皮下注射生理盐水以防止脱水。 不要给予 术后 局部类固醇或抗生素。 术后以及术后次日，皮下注射0.5 mL浓度为0.3 mg/mL的丁丙诺啡作为镇痛剂。
14. 使用后，将所有器械依次浸入70%乙醇、45%乙醇和蒸馏水中，每种液体中浸泡数秒。随后用纸巾彻底擦干。
15. 在动物恢复足够意识前持续看护，并将它们单独关养。如需（例如 为免疫组织化学目的，通过静脉注射100 mg/kg戊巴比妥处死动物。

3. 在体 内 视网膜及视网膜下成像

1. 使用谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）设备及其配套软件（见材料表），按照制造商说明获取经处理动物的横截面b-scan图像。为避免图像模糊，需每隔30-60秒用表面生理盐水冲洗角膜，以保持其湿润。
   1. 将已麻醉且瞳孔散大的动物（参见步骤1.1和2.10）置于可调节的固定装置中，以确保仪器光源至兔视网膜之间具有无障碍的光路。
   2. 获取至少3次OCT扫描，同时采集注射区域上部、中部和下部的红外共焦扫描激光眼底显微镜（IR-cSLO）反射参考图像。
   3. 使用cSLO蓝光、绿光、红外光及多色激光反射获取眼底表面图像（即，多种同时使用的激光颜色）
   4. 使用SD-OCT设备的蓝光激光功能采集蓝光自发荧光（BAF）图像。

结果

代表性 体内 正常白化兔视网膜的BAF、IR-cSLO和SD-OCT图像如图所示 图2注意SD-OCT仪器捕获的不同视网膜层及其特有的光反射水平。

在图1A和图1B中展示了构建视网膜下隆起的装置：放置开睑器以固定眼睑，便于插入3个套管针（图1B），套管针位于距角膜缘1-2 mm处，以避免触碰晶状体，进针角度与角膜缘呈30-45˚平行。套管针可用于经巩膜插入灌注导管（可选）、照明光纤以及注射针头。在手术过程中，散大的瞳孔配合平接物镜可便于观察眼底及视网膜下间隙。

注射50 µL的1...

讨论

在此方案中，大眼型地理萎缩模型的建立及其用于评估人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞整合的临床前研究 体内 被描述。

为了将再生疗法在GA及相关疾病中的临床转化⁷，开发并优化能够真实反映临床移植和影像学检查方法的技术至关重要。在这方面，兔子具有吸引力：其眼睛相对较大，可进行眼内手术并使用标准成像设备，且与其他大眼动物相比，价格低廉且易于饲养。

我们描述了采用标准的经玻璃体25号套管玻璃体切除术技术，以形成视网膜下隆起（sub-retinal blebs），用于诱导视网膜下损伤或移植hESC-RPE。最初，我们采用三通道设置，如图1B所示，原计划在手术过程中进行玻璃体切除时使用灌注通道（套管）。然而，由于我们发现实施视网膜下注射时无需进行玻璃体切除，因此已省略灌注通道。尽管如此，若将来进一步调整操作流程并需要进行玻璃体切除时，仍应保留第三个通道的选项。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NutriStem hESC XF 分化培养基 –bFGF 和 –TGFb	Biological Industries	06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x	Gibco, ThermoFisher Scientific Corp	12563-011
不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS	Gibco, ThermoFisher Scientific Corp	14190-094
细胞筛网 40 μm 尼龙	VWR	732-2757
针头 30 G 0.5’’；0.3 mm × 13 mm	BD Microlance	304827
Acrodisc 25 mm 注射器滤器	Acrodisc	PN4612
0.4% 台盼蓝	ThermoFisher Scientific Corp	15250061	使用浓度为 0.2%
NaIO3	Sigma-Aldrich Corp	S4007
BSS	Alcon Nordic A/S	65079550
70% 乙醇	Solveco AB	1047
氯胺酮，100 mg/mL	Intervet, Boxmeer	511519	使用剂量为 35 mg/kg 氯胺酮
Rompun vet，20 mg/mL	Bayer Animal Health	22545	使用剂量为 5 mg/kg 赛拉嗪
Triescence，40 mg/mL	Alcon Nordic A/S	412915	玻璃体内注射 2 mg
环戊醇苯肾滴眼液，0.75% + 2.5%	APL	321968	每眼使用 1 滴
Viscotears	Laboratoires Théa	597562
局部生理盐水	Apotea AB	7053249369080
Allfatal vet.，100 mg/mL	Omnidea	77168	使用 100 mg/mL 戊巴比妥钠
延长管（Hammer）	MedOne Surgical Inc	3223
25 G/38 G 多尖端视网膜下套管	MedOne Surgical Inc	3219	25 G/38 G
一次性平光镜	Volk	#VWFD10
Barraquer Colibri 眼睑牵开器	AgnTho's AB	42-020-030
无阀套管针	Alcon Nordic A/S	8065751448
爪状镊	Bausch & Lomb Nordic AB	ET1811
Alcon Accurus 400VS 玻璃体切除仪	Alcon Nordic A/S	8065740238
Accurus 25+ 规格玻璃体切除 TotalL Plus 套件	Alcon Nordic A/S	8065751493
SD-OCT 设备	Heidelberg Engineering	Spectralis HRA+OCT	使用 Heidelberg Eye Explorer 版本 1.9.10.0
24 孔板	Sarstedt	83.3922
Neubauer 血细胞计数板	VWR	631-0925
新西兰白兔	Lidköpings Rabbit Farm, Sweden
hESC-RPE 细胞			参见参考文献编号 1
Buprenodale Vet，0.3 mg/mL	Dechra	660500	皮下注射 0.5 mL 布托啡诺