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方法文章

一种由微控制器操作的装置，用于从传统香烟烟雾和电子烟气溶胶中生成液体提取物

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DOI：

10.3791/56709

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2018年1月18日

 ,  ,  ,  , 
1Cell & Molecular Biology, Tulane University, 2Biomedical Engineering, Tulane University, 3Cell & Molecular Biology & Ophthalmology, Tulane University

本文内容

摘要

本文介绍了一种可编程的实验装置，可用于制备传统香烟烟雾和电子烟气溶胶的提取物。该方法为传统香烟与电子烟之间的直接比较提供了有力工具，也是开展电子烟研究的便捷切入点。

摘要

电子烟是中学生和高中生中最流行的烟草制品，也是成年人中最受欢迎的替代性烟草产品。高质量且可重复的电子烟使用后果研究对于理解新出现的公共卫生问题并制定基于证据的监管政策至关重要。尽管讨论电子烟的论文数量日益增加，但各研究团队之间在方法学上缺乏一致性，研究结果也鲜有共识。本文介绍一种可编程的实验室装置，可用于制备传统香烟烟雾和电子烟气溶胶的提取物。本方案详细说明了该装置的组装与操作步骤，并展示了所制备提取物在两个示例应用中的使用： 体外 细胞活力检测和气相色谱-质谱联用。该方法为传统卷烟与电子烟之间的直接比较提供了工具，也是开展电子烟研究的便捷切入点。

引言

尽管卫生组织已投入大量努力，烟草制品的使用仍是全球可预防死亡的首要原因，其中大多数死亡归因于吸烟1。自2003年进入市场以来，电子烟在烟草制品使用者中的受欢迎程度持续上升。目前，电子烟是美国成年人中最流行的传统香烟替代品（约5%）2，也是初中生（约5.3%）和高中生（约16%）中最受欢迎的尼古丁递送系统3。如果当前趋势持续下去，电子烟有望在未来几代人中取代传统香烟。然而，使用电子烟对健康的影响仍不明确。

关于电子烟的研究直到2013年电子烟迅速流行后才真正开始3,4。自那时以来，已有多种不同模型被用于探讨其毒性问题。然而，许多研究的结果相互矛盾，尽管电子烟通常比传统香烟毒性更低，但目前对于电子烟使用对健康的影响尚无共识5,6,7。我们之前的研究表明，尽管电子烟可导致DNA损伤、氧化应激及细胞死亡，但其对血管内皮的毒性显著低于传统香烟8。然而，在得出关于电子烟使用健康影响的明确结论之前，仍需开展更多研究。

由于传统香烟是可预防性血管疾病的主要诱因9，电子烟使用对血管健康的潜在风险正受到越来越多的关注10,11,12为了研究电子烟对血管系统的影响，本实验室开发了一种由微控制器操控的吸烟/ vaping 装置（图1)8该装置能够使用水性或有机溶剂生成常规香烟烟雾或电子烟气溶胶的液体提取物。通过可调节的空气流量调节器与PBASIC定时程序共同控制气流，该装置可根据多种用户自定义方案生成提取物。本文详细介绍了该装置的组装与操作方法，以及两种潜在应用： 体外 细胞活力评估和气相色谱-质谱联用

用于比较分析的香烟和电子烟烟雾提取装置示意图。
图1：吸烟/ vaping 装置。 吸烟/ vaping 装置在香烟/类似香烟的电子烟（e-cig）配置（A）和储油罐式电子烟配置（B）下的物理组装示意图。组件说明：1）吸入端口；2）主收集捕集瓶；3）溢流捕集瓶；4）布氏烧瓶真空阱；5）常开电磁阀；6）BS1 微控制器；7）气流调节器；8）510 螺纹电子烟储油罐底座。 请点击此处查看此图的放大版本。

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方案

1. 装置的组装

  1. 将一个 100 mL 的布氏烧瓶（图 1，#4）固定在钢制铁环架上，并通过在瓶内加入 50 g 氯化钙作为干燥剂，构建一个真空阱。用带打孔的橡胶塞密封烧瓶，将塞子与烧瓶的连接处用石蜡膜包裹，并将一根移液管穿过孔洞。
  2. 使用乙烯基软管，将从橡胶塞中引出的移液管连接至一个 T 型软管接头。
  3. 使用乙烯基软管，将两个捕集瓶（图 1，#2 和 #3）相互连接，并将第二个捕集瓶的出口连接至 T 型软管接头。
  4. 使用乙烯基软管，将第一个捕集瓶的入口作为吸入端口（图 1，#1）。
  5. 使用乙烯基软管，将布氏烧瓶的侧臂连接至气流调节器的入口（图 1，#7），并将气流调节器的出口连接至真空泵。
  6. 按照 图 2A 中的示意图组装整个系统。
  7. 通过串行适配器和制造商的软件，将 PBASIC 程序 SVL.bs1（图 2B，也可在 https://github.com/ChastainAnderson/SVL 获取）上传至 BS1 微控制器（图 1，#6）。
  8. 将 510 螺纹底座（图 1，#8）安装在铁环架的夹具中。
  9. 使用乙烯基软管，将电磁阀（图 1，#5）连接至 T 型软管接头的自由端。
    注意：装置应已完整组装并准备就绪，检查所有连接处以确保气密性，并根据需要使用软管夹和真空润滑脂。

微控制器电路图与加热线圈；过程控制的编程脚本。
图 2：电路原理图与 PBASIC 代码。 图 2A 展示了用于组装电路的电气原理图，该电路用于激活常开型电磁阀以及按钮式电子烟的加热线圈（通过 510 螺纹电子烟油仓底座）。加热线圈的电气参数（P：功率；R：电阻；I：电流）为理论预估值，组装完成后需使用万用表进行实测验证。图 2B 展示了用于控制 图 2A 中电路的 PBASIC 定时程序（亦可在 https://github.com/ChastainAnderson/SVL 获取）。定时常数 SVT 与 IPT（#5 与 #6）单位为 ms，设定值可提供 2 秒的激活时间与 28 秒的停机时间。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 样品储存与制备

  1. 将所有未开封的传统香烟和电子烟样品置于暗处，用密封塑料袋保存，并在室温下存放。
  2. 一旦开封，将样品用密封塑料袋在 4 ºC 条件下保存，并放入一张纸巾以吸收多余水分。
  3. 使用前，将所有样品在室温下、相对湿度约 60% 的加湿器中预平衡至少 30 分钟。

3. 香烟烟雾/电子烟气溶胶提取装置的一般操作

  1. 使用分析天平测定每支电子烟烟弹/烟油仓在 vaping 前的质量。通过比较 vaping 前后质量的差值，确定适当的给药剂量。
    注：3R4F 参比香烟假设含有 0.7 mg 尼古丁，商业香烟品牌的尼古丁含量可通过常规分析方法测定13。
  2. 对于样品应用 1，向一级捕集器的储液槽中加入 4.3 mL 血管内皮细胞培养基；对于样品应用 2，向储液槽中加入 5 mL 丙酮。
  3. 准备电子烟或传统香烟以进行提取：
    1. 若使用传统香烟，在滤嘴周围贴上透明胶带，并在烟纸与滤嘴连接处做一明显标记。
    2. 若使用类似电子烟的传统香烟，确保电池电量充足，并将烟弹牢固旋紧至电池上。
    3. 若使用电子烟烟油仓，确保仓内已注入适量电子烟液，并将烟油仓旋紧至 510 螺纹底座上。
  4. 将传统香烟或电子烟的末端插入吸入端口（图 1，#1），并用软管夹固定。
  5. 启动真空泵。
  6. 调节流量计，使每分钟抽吸 1.65 L，以确保在 2 秒内完成一次 55 mL 的抽吸。
  7. 启动微控制器。若使用传统香烟，在第一次抽吸时点燃香烟。
  8. 运行至达到预期的目标浓度（以 ppm 或 % 质量/体积表示）为止。
  9. 使用分析天平测定每支电子烟烟弹/烟油仓在雾化后的质量。将此测量值与步骤 3.1 中获得的测量值进行比较，以确定消耗的总质量。计算消耗质量与溶剂体积的浓度。使用消耗尼古丁的摩尔浓度对不同产品间的数据进行归一化处理。
    1. 若消耗质量不足，将电子烟重新装回装置并继续抽吸。
    2. 若消耗质量已足够或过量，则继续下一步操作。

4. 过滤与储存

  1. 如果提取物将用于细胞培养，需通过滤器过滤 0.22 µm PES 注射器滤器
  2. 立即使用提取物，或在 -80 ºC 下保存。作为安德森实验准备的一部分， 等8电子烟气溶胶被证实至少可稳定保存两周，而Crooks已证实香烟烟雾可稳定保存长达两年。 等13.

5. 清洁设备

  1. 每次提取后，用70%乙醇和去离子水冲洗装置的管路和储液槽，以防止样品间的交叉污染。
  2. 冲洗后，短暂运行空装置，使气流促进管路干燥。

6. 示例应用1：中性红摄取细胞活力检测

  1. 将提取物按上述方法加入到 4.3 mL 内皮细胞生长培养基中。
  2. 前一日，将人脐静脉内皮细胞以每 100 µL 内皮细胞生长培养基中 1 × 104 个细胞的密度接种至 96 孔板中。
  3. 通过更换旧的内皮细胞培养基处理细胞：每孔加入 100 µL 新鲜内皮细胞培养基作为对照组，或加入 75 µL 内皮细胞生长培养基与 25 µL 浓度为 2 mM 消耗性尼古丁提取物（将 1.4 mg 消耗性尼古丁溶于 4.3 mL 内皮细胞生长培养基）的混合液，使终浓度为 500 µM，作为处理组。
  4. 由于香烟烟雾和电子烟气溶胶中的许多组分具有挥发性，应使用铝箔密封以确保孔板密闭。
  5. 将培养板在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 18–24 小时。
  6. 配制中性红染色液：
    1. 通过将 33 mg 中性红染料溶解于 10 mL 缓冲盐溶液中，配制 100 倍浓度的中性红储备液。
    2. 使用前短时间内，将 100 倍储备液按 1:100 比例用细胞培养基稀释，制成 1 倍浓度的中性红染色液。
    3. 使用前将中性红染色液在 37 °C 预热至少 30 分钟，并立即使用。
      注意：孵育过程中可能出现少量晶体析出，属正常现象。操作时应避免将这些晶体加入细胞培养孔中。如有需要，可使用 0.22 µm 滤器过滤中性红储备液及染色液。
  7. 移除提取液，每孔加入 100 µL 中性红染色液，并额外多加几孔作为空白对照（至少三个空白孔），以确保准确定量。
  8. 将培养板在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 2–4 小时。
  9. 移除中性红染色液，用 PBS 浸泡洗涤 3 次。
  10. 加入中性红脱色液（50% 去离子水、49% 乙醇、1% 乙酸）。
  11. 室温下振荡孵育至少 10 分钟。
  12. 在 540 nm 波长处测定吸光度。
  13. 数据分析时，扣除空白孔的平均值，并以经空白校正后的对照孔平均值为基准进行归一化处理。

7. 示例应用 2：气相色谱-质谱联用

  1. 按照上述方法将样品提取至5 mL丙酮中。
  2. 运行设备，使样品在丙酮中的最终浓度约为100 ppm（电子烟液消耗重量/丙酮体积）。
  3. 使用精密玻璃注射器，将1 µL样品注入气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）的进样口。在250 °C下以1:20的分流比进样，进入配备ZB-5色谱柱的气相色谱-四极杆质谱系统，并采用以下程序升温条件：50 °C保持1 min；以10 °C/min升至140 °C；再以20 °C/min升至300 °C，保持10 min。
  4. 将获得的质谱图与目标谱库进行比对，以鉴定气溶胶组分。

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结果

人脐静脉内皮细胞暴露于传统香烟烟雾提取物（CSE）或电子烟气溶胶提取物（EAE）后24小时内，细胞活力显著下降（对照组 vs. CSE P <0.001；对照组 vs. EAE P <0.01；n = 6）（图3A）。提取物采用每分钟2次、每次2秒、55 mL抽吸量的抽吸模式生成，并根据设备消耗的尼古丁摩尔浓度进行归一化。暴露于500 µM尼古丁消耗当量的CSE后，活细胞比例降至对照组的11.06 ± 0.28%；暴露于500 µM尼古丁消耗当量的EAE后，活细胞比例降至对照组的86.65 ± 4.60%。

图3B 展示了通过气相色谱法对市售电子烟中的组分进行基于挥发性的分离。随后通过四极杆质谱法对这些组分进行鉴定。按挥发性顺序鉴定出的组分包括：丙二醇、乙酰丙酸、氯丁醇、甘油、尼古丁和3...

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讨论

本方案最关键的要素是在每次提取开始和结束时确保设备清洁，并确保所有密封完好，以维持气流的稳定性。如果设备未彻底清洁，可能导致样品间的交叉污染。此外，若设备长时间未清洁，冷凝的气溶胶和干燥的溶剂可能堵塞系统。需要注意的是，在抽吸传统香烟时出现压力下降是正常现象，此时应调节气流计，使其在抽吸过程中提供所需的气流，而不是在设备抽取环境空气时调节。本方法的一个重要特点是能够适应电子烟技术的不断进步。例如，许多电子烟需要通过按压按钮来激活加热线圈。本设备将加热线圈直接集成到控制电路中（图 2A），可在用户设定的时间间隔内模拟按钮按压操作。该方法的主要局限性在于目前尚缺乏针对电子烟使用的标准化操作规程。尽管我们可以采用研究用参考香烟14以及国际通用的测试协议15,16来研究传统香烟，但将这些方法应用于电子烟时仅属于适应性调整，无法保证其能准确模拟电子烟使用者的真实行为。此外，本方案所产生的提取物为液态介质。虽然这种形式适用于某...

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披露

由杜兰大学管理的烟草产品监管科学研究奖学金项目由奥驰亚客户服务监管事务部提供资金支持。

致谢

作者感谢杜兰大学细胞与分子生物学系的 Robert Dotson 博士在手稿编辑方面提供的帮助，以及杜兰大学化学系的 James Bollinger 博士在质谱实验方案设计方面的协助。作者还感谢杜兰大学细胞与分子生物学系和杜兰大学化学系提供的支持，以及实验空间和设备的使用许可。本研究得到了杜兰大学理学院与工程学院向 C. Anderson 提供的烟草产品监管科学研究奖学金的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12 V 交流/直流壁挂式适配器Digi-KeyT1099-P5P-ND
2.2 欧姆电阻Digi-KeyA105635-ND成对使用，用于在图 2A 中产生 4.4 欧姆的电阻
330 欧姆电阻Digi-Key330QBK-ND
510 螺纹底座NJoyN/A通过拆解第二代 NJoy 电子烟获得
冰醋酸Sigma-AldritchA6283
丙酮（色谱级）Sigma-Aldritch34850
Basic Stamp 项目板Digi-Key27112-ND该电路板包含 BS1 微控制器、串行适配器、电源开关以及用于连接交流/直流壁挂式适配器的筒形插孔
Basic Stamp USB 转串行适配器Digi-Key28030-ND可选组件，用于使 BS1 串行适配器通过 USB 通信
布氏烧瓶（真空烧瓶），250 mLVWR10545-854
透明胶带3MS-9783
透明乙烯基软管，内径 3/8"Watts443064
EGM-2 内皮细胞培养基LonzaCC-3162
乙醇Pharmco-Aaper111000200
流量调节器DwyerVFA-23-BV
气相色谱仪Varian450-GC
玻璃注射器，10 mLSigma-AldritchZ314552
玻璃注射器，10 µLHamilton80300
高真空硅脂Dow Corning146355D
软管夹Precision Brand35125
人脐静脉内皮细胞ATCCPCS-100-013 
质谱仪Varian300-MS
小型撞击式采样器ChemglassCG-1820-01
中性红Sigma-AldritchN4638
石蜡膜3MPM-992
板封滚压机BioRadMSR0001
板封膜；铝箔Thermo276014
铁架台，20"美国教育产品公司7-G15-A
电磁阀（常开型）US SolidUSS2-00081
固态继电器Digi-KeyCLA279-ND
夹具夹EiscoCH0688
注射器滤器，PES 材质，0.22 µmMilliporeSLGP033RS
注射器，10 mLBD Syringe309604
通孔橡胶塞，6 号VWR59581-287
真空泵KNF NeubergerN86KTP

参考文献

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