一种采用微型线圈狭窄法建立的轻度宫内低灌注大鼠模型

摘要

通过在大鼠胚胎发育第17天时，将金属微型线圈缠绕于子宫动脉和卵巢动脉周围以造成动脉狭窄，从而诱导轻度子宫内低灌注。该操作可导致产前低灌注及宫内生长受限。

摘要

宫内低灌注/缺血是导致宫内/胎儿生长受限、早产和低出生体重的主要原因之一。目前对这一现象的研究大多采用严重宫内缺血模型或不同程度宫内低灌注梯度模型。尚无研究采用均匀性轻度宫内低灌注（MIUH）模型。已有两种模型用于MIUH研究：一种是通过缝合结扎子宫动脉与卵巢动脉形成的动脉弓两侧实现，另一种是通过夹闭双侧卵巢动脉及保持通畅的主动脉建立的短暂性模型。这两种啮齿类动物MIUH模型均存在一定局限性，例如，并非所有胎儿都会受到MIUH影响，其程度取决于胎儿在子宫角内的位置。在我们的MIUH模型中，所有胎儿均处于相似程度的宫内低灌注状态。该模型通过轻度狭窄供应子宫的四条动脉（即双侧子宫动脉和卵巢动脉）来实现MIUH。

通过将金属微线圈缠绕在供血动脉上诱导动脉狭窄。使用微线圈制造动脉狭窄可实现对血流减少程度的控制、优化和可重复性，且动物间差异极小、死亡率低，从而能够进行准确评估。当使用内径为0.24 mm的微线圈时，胎盘和胎儿的血流量均轻度下降（胎盘血流量较狭窄前水平下降约30%）。本宫内发育迟缓（MIUH）模型的子代在神经功能、神经解剖学和行为学测试结果中均表现出持久的异常改变。

引言

宫内生长受限（IUGR）（亦称胎儿生长受限）（出生体重低于同胎龄平均体重的第10百分位）的婴儿，其围产期死亡率和发病率显著升高。这种生长受限通常由胎盘功能不全引起，导致向胎儿输送的氧气和营养物质减少。IUGR婴儿在新生儿期和远期均可能出现多种并发症，包括低血糖、体温不稳定、喂养困难、神经发育迟缓以及成年后患代谢综合征和心血管疾病的风险增加。早期识别和多学科管理对于改善IUGR婴儿的短期和长期预后至关重要。 关键词：宫内生长受限，胎儿生长受限，IUGR，胎盘功能不全，低出生体重，围产期并发症，神经发育，代谢综合征 <10^th 孕龄百分位数）、早产（出生时孕周小于 < 37周妊娠），和/或低出生体重（< 2500 g）约占新生儿总数的10% ^2,3许多这些婴儿会出现神经系统问题，例如脑性瘫痪和发育障碍（如注意缺陷多动障碍（ADHD）和学习障碍）。 ^3,4,5这些疾病的病因和预后具有相似性和差异性。宫内生长受限（IUGR）的病因是多因素的，其中与子宫内低灌注相关的胎盘功能不全被认为是非畸形胎儿中最常见的病因。 ⁷早产的病因也是多因素的，其中绒毛膜羊膜炎是最常见的原因。 ⁸.

轻度宫内低灌注（MIUH）对发育中大脑的影响尚不明确。目前可用的宫内低灌注/缺血动物模型主要涉及重度低灌注，或不同程度的低灌注（伴或不伴再灌注）^9,10,11。然而在临床实践中，MIUH 的病例被认为远比上述严重情况更为常见。目前可用的 MIUH 模型包括：通过结扎子宫动脉或卵巢动脉建立的啮齿类动物模型，以及通过夹闭双侧卵巢动脉和保持通畅的主动脉建立的啮齿类动物模型^{12,13,14,15,16,17}。这些模型的一个缺点是胎儿间变异程度较大，不同胎儿的低灌注程度差异显著，从严重低灌注到几乎完整的灌注均有，这取决于胎儿在子宫动脉与卵巢动脉弓状血管网络中的位置。另一个缺点是在出生后无法确定每个胎儿原先在子宫内的具体位置，因此研究人员无法在仔鼠出生后判断其个体所经历的宫内低灌注严重程度。

我们建立了一种涉及多条动脉狭窄的宫内发育迟缓（MIUH）大鼠模型¹。将内径为0.24 mm的金属微线圈包裹在卵巢动脉和子宫动脉周围，可导致血管狭窄但不完全阻塞（图1）。在胚胎第17天（相当于人类胚胎第20-25周¹⁸），于供应子宫的所有动脉（即双侧子宫动脉和卵巢动脉）的近端位置施加这些微线圈，可引起胎盘和胎儿血流显著但轻度的减少。当四个供应子宫的动脉均放置线圈后，各胎盘和胎儿的血流下降程度基本一致。胎儿死亡率低于20%。幼鼠通常比正常情况下提前1-2天（胚胎第21-22天）经自然分娩出生。几乎所有出生幼鼠均表现出显著的低出生体重¹。其灰质和白质体积减少，但无明显组织损伤¹。幼鼠表现出新生儿反射获得延迟、肌力减弱以及自发活动异常¹。该模型模拟了早产儿或宫内生长受限（IUGR）患儿的临床体征和症状；早产儿无论是否伴有白质损伤，均表现为灰质和白质体积减少⁶，出现神经发育里程碑延迟，并可能出现如注意力缺陷多动障碍（ADHD）等行为问题^3,5；IUGR患儿则表现为轻微的神经解剖学改变，并有更高的风险出现运动和认知发育迟缓等神经发育障碍^4,7。早产和IUGR是两种不同的病理状态，但二者具有共同的基本机制，即在足月妊娠之前对未成熟大脑造成损伤。

方案

所有实验均按照日本吹田市国立循环器官与脑血管中心实验动物护理与使用委员会批准的方案进行。

1. 准备以下动物和材料用于MIUH手术

1. 准备妊娠17天的Sprague-Dawley大鼠，即胚胎发育第17天（E17）。母鼠平均体重为307.0 ± 40.7 g（均值 ± 标准差，n = 9）。
2. 准备金属微线圈；内径0.24 mm，由镀金钢制成。
3. 根据材料表准备所有材料。

2. 准备MIUH手术

1. 将加热垫预热至 37 °C 用于放置大鼠
2. 在加热垫上放置无菌尿垫
3. 将无菌生理盐水置于 37 °C 水浴中预热

3. 实施 MIUH 手术

1. 在无菌条件下进行手术操作。使用前用70%乙醇对线圈、镊子和针头进行灭菌。佩戴无菌手套，并定期使用乙醇喷雾进行消毒。
2. 将大鼠放入麻醉诱导箱中，向箱内通入4%异氟烷（约5分钟）。
3. 当动物在诱导箱中完全麻醉后，将其仰卧位放置于加热垫上的无菌尿垫上。通过夹捏脚趾无反应来确认麻醉深度。通过鼻罩维持1.5–2.0%异氟烷麻醉。
4. 将脱毛泡沫涂抹于从肚脐向下至骨盆弓区域的腹部皮肤。数分钟后，用纸巾擦去脱毛泡沫。可使用剃须刀代替脱毛泡沫。
5. 用浸有碘消毒液的纱布擦拭脱毛区域的皮肤。
6. 放置带有圆形开口的手术巾，覆盖除手术切口区域外的腹部。可用数块纱布代替手术巾。
7. 使用手术刀从耻骨上缘垂直向上至肚脐处，在下腹部做一条长约2.5 cm的切口。随后切开下方的肌层。
8. 在手术巾开口周围放置数块无菌纱布，并用温热的生理盐水润湿纱布。
9. 轻柔地向两侧推开腹部，使部分子宫角从切口处露出。
10. 用70%乙醇对术者双手进行消毒。
11. 手动轻柔地将整个子宫角从腹腔中拉出，避免使用镊子。不建议使用手术镊，因其可能因施加不均匀且过强的压力而容易损伤脆弱的子宫、胎鼠及血管。
12. 将子宫角放置于湿润的纱布上。
13. 对另一侧子宫角执行相同操作。
14. 计数胎鼠数量。
15. 频繁使用温热的生理盐水润湿子宫，以在整个手术过程中保持子宫温暖和湿润。
    1. 当尿垫吸收过多生理盐水时应及时更换。为保持无菌状态，需重复使用70%乙醇对手套及器械尖端进行消毒，并用碘液消毒器械尖端。关键是要避免非无菌的手指接触器械的无菌部分。
16. 在体视显微镜下辨认卵巢动脉和子宫动脉主干弓的近端部分。
    注意：必须将主干弓与通往胎盘的分支区分开。请注意，当翻转子宫角时，手术操作可能更为方便。有时由于主干弓位置较深，且通往胎盘的动脉分支紧邻其近端，难以在主干弓最靠近近端的位置放置线圈。在此情况下，可将线圈置于主干弓第一个分支分出后的部位。
17. 用镊子将与动脉并行的静脉分离，并在两者之间制造间隙。
18. 将一段细线（4.0号丝线，长5 cm）置于动脉下方。
19. 用镊子提起细线两端，使动脉被抬起并与脆弱的静脉分离。
20. 另一只手持精细镊子夹住微线圈边缘，将微线圈放置于被抬起的动脉旁（图2.1）。
21. 利用细线围绕微线圈旋转被抬起的动脉，使微线圈缠绕于动脉上。围绕线圈旋转动脉比围绕动脉旋转线圈更为容易（图2.2）。
22. 旋转动脉3至4圈（线圈共5圈）后，更换镊子夹持线圈的位置至另一侧边缘。用镊子夹住已缠绕在动脉上的线圈边缘。同时将细线提起动脉的位置移至线圈的另一侧。继续围绕线圈旋转动脉，使线圈完全（5圈）包裹动脉（图2.3, 2.4）。
23. 移除细线。
24. 对另外三条动脉执行相同操作。
25. 注意必须频繁使用温热的生理盐水润湿子宫；否则胎鼠死亡率会升高，而低体温可能具有神经保护作用。
26. 轻柔地将子宫角复位回腹腔内。用镊子提起腹壁切口的一侧边缘可使此操作更简便。
27. 先缝合腹肌层，再用缝线（4.0号丝线）缝合腹部皮肤。每缝一针后打结，即采用间断单缝合。
28. 用浸有碘消毒液的纱布覆盖手术切口及其周围区域。
29. 皮下注射镇痛药美洛昔康，剂量为0.5 mg/kg体重。
30. 在加温的笼子中恢复30分钟。确认动物完全清醒并在笼内活动后，将其送回饲养笼。

结果

在对所有供应子宫的动脉（即双侧子宫动脉和卵巢动脉）放置微线圈后，所有胎儿均受到相似程度的低灌注。使用内径为0.24 mm的微线圈可导致这些动脉轻度狭窄，从而引起胎盘和胎儿血流轻度减少（图3；胎盘血流量较狭窄前减少约30%，详见参考文献1）。母鼠所产仔鼠表现出宫内生长受限（Table 1）。

术后数天内，母鼠似乎表现出活动减少。除此之外，母鼠未出现任何明显并发症，并在术后一周内完全恢复。母鼠在分娩后可长期存活（观察期间死亡率为0%），并能正常哺育仔鼠。线圈保持在原位不变。

表1. 出生时（出生后第0天，P0）及相当于胚胎第29天（E29）时的体重，E29对应P6-P8。 无手术对照组幼崽出生于E23，假手术组...

讨论

对双侧卵巢动脉和子宫动脉在双侧子宫角处进行微线圈缩窄，可在所有胎盘和胎儿中产生一致且可重复的子宫内低灌注。通过使用不同内径的微线圈，可调节低灌注的程度。使用内径为0.24 mm微线圈建立动脉缩窄的母鼠所产下的仔鼠表现出宫内生长受限（IUGR）和早产（详见参考文献1）。这些仔鼠表现出类似早产儿临床表现的神经解剖学和行为学改变。这些神经解剖学改变包括脑室扩大、皮层和胼胝体变薄，以及脑重量减轻，但无明显细胞丢失或囊性病变¹。所观察到的行为学改变包括新生儿反射延迟、肌力下降以及自发活动异常¹。

为了研究子宫内缺血，通常采用基于严重缺血并在短时间内再灌注的动物模型^10,11。当由卵巢动脉和子宫动脉形成的动脉弓两端被夹闭阻断时，子宫角（包括胎盘和胎儿）的血液供应将完全中断。因此，夹闭时间必须较短，否则胎儿将会死亡。然而，在临床情况下，我们推测更常见的是长时间的轻度低灌注，而非子宫血流...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
体视显微镜
异氟烷麻醉机
麻醉诱导箱
加热垫
尿布 30x40 cm
脱毛泡沫或剃毛器
碘伏消毒液
纱布 10x20 cm
手术洞巾 45x45 cm，中央圆形开口直径 5 cm
乙醇喷雾瓶（用于消毒）
棉签
大头钝端镊子
弯头精细镊子
剪刀
手术刀片，刀片长度 27 mm（型号10，Axel，AS ONE Corporation，大阪，日本）
外科缝合针
金属微线圈；内径 0.24 mm，由镀金钢制成（SAMINI Co. Ltd.，静冈，日本）
4-0 丝线缝合线
无菌生理盐水（0.9% 氯化钠）
加热水浴锅
塑料注射器（50 ml）和针头（18G）