利用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究突变型钙网蛋白在细胞因子依赖性造血细胞中的致癌活性

摘要

利用CRISPR/Cas9进行靶向基因编辑极大地促进了对基因生物学功能的理解。在此，我们采用CRISPR/Cas9技术在细胞因子依赖性造血细胞中构建钙网蛋白突变模型，以研究其致癌活性。

摘要

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）是原核生物中的一种适应性免疫系统，科学家已将其改造用于生成RNA引导的核酸酶，例如CRISPR相关蛋白9（Cas9），以实现真核生物基因组的位点特异性编辑。利用Cas9进行基因组工程改造，可高效、简便且稳健地修饰多种与生物医学相关的哺乳动物细胞系和生物体中的内源基因。本文展示了一个如何利用CRISPR/Cas9技术研究特定基因突变生物学功能的实例。我们通过向小鼠白细胞介素-3（mIL-3）依赖性前B细胞（Ba/F3）中递送靶向内源CALR基因座的单导向RNA（sgRNA），在骨髓增殖性肿瘤（MPN）患者中发生插入和/或缺失（indel）CALR突变的特定区域建立钙网蛋白（CALR）突变模型。这些sgRNA在靶向区域诱导产生双链断裂（DSBs），并通过非同源末端连接（NHEJ）修复机制形成不同大小的插入缺失突变。随后，我们采用标准的Ba/F3细胞转化实验，以研究生理水平表达的Calr突变对造血细胞转化的影响。该方法可推广至其他基因，用于研究其在多种哺乳动物细胞系中的生物学功能。

引言

CRISPR/Cas9 技术最近彻底改变了活细胞和生物体中的靶向基因组编辑。它已成为生物医学研究中一种极为强大的工具，并正在被探索作为治疗遗传性疾病的一种潜在途径¹。所有基因组编辑工具的基础都是在需要修饰的基因组位点处由核酸酶诱导产生DNA双链断裂（DSB）。这些双链断裂可通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）进行修复^2,3。与锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）等其他基因组工程核酸酶相比，Cas9核酸酶的优势在于其通过RNA引导核酸酶靶向特定DNA序列，而ZFNs和TALENs依赖的是蛋白质-DNA相互作用^2,3。

在发现CRISPR/Cas9核酸酶通路是原核细胞中的一种适应性免疫系统之后^4,5，大量研究致力于将该通路改造用于哺乳动物细胞系和模式生物^2,3。作为基因编辑工具，CRISPR/Cas9通路主要利用两个组分：....

方案

1. 使用在线工具设计sgRNA¹³

1. 使用免费的在线工具设计靶向目标基因的sgRNA。
   1. 将目标基因的NCBI参考序列复制并粘贴到Broad研究所sgRNA设计网页工具中：(http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design)。
      注意：该工具可识别位于外显子内的切割位点，以及跨越内含子/外显子边界但仍在外显子内进行切割的sgRNA序列。
   2. 下载文本输出文件，并在Excel中打开。
   3. 重点关注包含sgRNA序列和sgRNA上下文序列的列。请注意，sgRNA序列本身不包含原间隔序列邻近基序（PAM），但上下文序列包含PAM。
   4. 请注意，靶向效率评分以0到1的范围列出，预测切割效率，评分为1表示更高的切割效率。
   5. 使用Excel的“排序”功能，按效率评分或通过“Target Cut %”列按目标在基因内的位置对候选序列进行排序。
      注意：按基因内的位置排序有助于识别靶向特定功能域或感兴趣外显子的sgRNA。
   6. 选择3-6个靶向感兴趣区域且具有高（>0.6）靶向效率评分的sgRNA。了解可能导致预期表型的突变类型可能有助于设计（请参见图1

结果

本实验旨在通过在内源性Calr基因座中引入插入/缺失（indel）突变，研究其对造血细胞转化的功能影响。采用CRISPR/Cas9系统作为工具，在Ba/F3细胞中构建内源性Calr突变。选择两条sgRNA靶向Calr基因的第9号外显子（图1），该区域是CALR突变型骨髓增殖性肿瘤（MPN）患者中插入和/或缺失（indel）突变的常见发生区域^17,18。第一条sgRNA（m1）因其较高的切割效率和理想的脱靶评分而被选用（Table 1）。第二条sgRNA（m2）主要基于其在第9号外显子内的位置被选择，且该区域缺乏其他具备高切割效率和理想脱靶评分的可用sgRNA（Table 1）。在独立的感染实验中分别使用两条不同的sgRNA（m1或m2），以确保所观察到的效应源.......

讨论

本文演示了使用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究CALR突变在造血细胞中生物学功能的方法。该实验方案的成功高度依赖于多个因素。首先，必须明确哪些类型的突变可能导致预期的表型。在本方案中，检测指标是Ba/F3细胞转化为对mIL-3非依赖性生长，所关注的突变类型为CALR基因第9外显子中的插入或缺失（indel）。然而，如果目标是实现单碱基对替换，则应优先选择通过HDR介导的修复方式，因为该方法能够利用单链或双链DNA供体模板精确引入点突变或插入序列^2,3。若目标是完全敲除基因功能，则更推荐通过靶向早期编码外显子产生大规模基因组缺失的方法²⁰。

其次，细胞系必须具有细胞因子依赖性，以便在撤除细胞因子后施加正向筛选压力。需要注意的是，并非所有细胞系都能耐受Cas9的稳定表达（参见步骤6.3）。这可能是由于部分细胞系无法耐受杀稻瘟菌素（blasticidin）筛选。在此情况下，可能需要选.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BsmBI	新英格兰生物实验室	R0580L
杀稻瘟菌素	西格玛奥德里奇	15025
嘌呤霉素	生命技术公司	A1113803
Stbl3 细胞	生命技术公司	C737303
TransIT-LT1	赛默飞世尔科技	MIR2300
Opti-MEM	生命技术公司	51985034
RPMI	赛默飞世尔科技	MT10040CV
DMEM	赛默飞世尔科技	10-017-CV
胎牛血清 (FBS)	Omega 科学公司	FB-11
青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺	生命技术公司	10378016
mIL-3	Peprotech 公司	213-13
psPAX2	Addgene 公司	N/A
pCMV-VSV-G	Addgene 公司	N/A
pLX_TRC311-Cas9	Addgene 公司	N/A
聚凝胺	西格玛奥德里奇	H9268
pXPR-011	Addgene 公司	N/A
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Genessee 科学公司	25-507
TAE 缓冲液	赛默飞世尔科技	FERB49
LentiGuide-Puro	Addgene 公司	质粒 #52963
PNK	新英格兰生物实验室	M0201S
T4 连接酶	新英格兰生物实验室	M0202S
PCR 纯化试剂盒	Qiagen 公司	28104
质粒小提试剂盒	Qiagen 公司	27104