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方法文章

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究突变型钙网蛋白在细胞因子依赖性造血细胞中的致癌活性

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DOI：

10.3791/56726

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2018年1月5日

 , 
1Division of Hematology, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Broad Institute, 3Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School

本文内容

摘要

利用CRISPR/Cas9进行靶向基因编辑极大地促进了对基因生物学功能的理解。在此，我们采用CRISPR/Cas9技术在细胞因子依赖性造血细胞中构建钙网蛋白突变模型，以研究其致癌活性。

摘要

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）是原核生物中的一种适应性免疫系统，科学家已将其改造用于生成RNA引导的核酸酶，例如CRISPR相关蛋白9（Cas9），以实现真核生物基因组的位点特异性编辑。利用Cas9进行基因组工程改造，可高效、简便且稳健地修饰多种与生物医学相关的哺乳动物细胞系和生物体中的内源基因。本文展示了一个如何利用CRISPR/Cas9技术研究特定基因突变生物学功能的实例。我们通过向小鼠白细胞介素-3（mIL-3）依赖性前B细胞（Ba/F3）中递送靶向内源CALR基因座的单导向RNA（sgRNA），在骨髓增殖性肿瘤（MPN）患者中发生插入和/或缺失（indel）CALR突变的特定区域建立钙网蛋白（CALR）突变模型。这些sgRNA在靶向区域诱导产生双链断裂（DSBs），并通过非同源末端连接（NHEJ）修复机制形成不同大小的插入缺失突变。随后，我们采用标准的Ba/F3细胞转化实验，以研究生理水平表达的Calr突变对造血细胞转化的影响。该方法可推广至其他基因，用于研究其在多种哺乳动物细胞系中的生物学功能。

引言

CRISPR/Cas9 技术最近彻底改变了活细胞和生物体中的靶向基因组编辑。它已成为生物医学研究中一种极为强大的工具，并正在被探索作为治疗遗传性疾病的一种潜在途径1。所有基因组编辑工具的基础都是在需要修饰的基因组位点处由核酸酶诱导产生DNA双链断裂（DSB）。这些双链断裂可通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）进行修复2,3。与锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）等其他基因组工程核酸酶相比，Cas9核酸酶的优势在于其通过RNA引导核酸酶靶向特定DNA序列，而ZFNs和TALENs依赖的是蛋白质-DNA相互作用2,3。

在发现CRISPR/Cas9核酸酶通路是原核细胞中的一种适应性免疫系统之后4,5，大量研究致力于将该通路改造用于哺乳动物细胞系和模式生物2,3。作为基因编辑工具，CRISPR/Cas9通路主要利用两个组分：来自Streptococcus pyogenes（Sp）的Cas9核酸酶以及靶向目的基因的sgRNA2,3。sgRNA包含20个核苷酸，通过RNA-DNA碱基互补配对引导Cas9定位到基因组上的特定位点2,3。sgRNA的靶位点必须紧邻一个原间隔序列邻近基序（PAM），其序列为5' NGG，可被SpCas9核酸酶识别。利用这些工具，只需设计靶向目标区域的sgRNA，即可将Cas9引导至任意DNA序列。除了来源于Sp的Cas9外，还存在具有不同特性的Cas9变体，适用于特定应用场景。例如，某些Cas9变体具有更高的靶向编辑特异性，或具备单链切割能力用于DNA切口6,7。此外，催化失活的Cas9最近已被开发用于转录调控8。目前，科学家已将CRISPR/Cas9系统应用于多种研究领域，如基因敲入和敲除以研究基因的生物学功能9、功能缺失和功能获得性文库筛选10，以及模式生物的遗传工程改造11。

在本实验方案中，我们将CRISPR/Cas9技术与Ba/F3细胞转化实验相结合，以研究CALR突变的生物学功能。Ba/F3细胞是一种依赖小鼠白细胞介素-3（IL-3）的造血细胞系，当表达某些癌基因（如BCR-ABL12）时，可转变为IL-3非依赖性生长。为了明确突变型钙网蛋白是否能够使Ba/F3细胞获得细胞因子非依赖性生长能力，我们利用CRISPR/Cas9靶向内源性Calr基因的第9号外显子，引入插入/缺失（indel）突变，随后撤除培养基中的IL-3，施加正向选择压力，旨在模拟骨髓增殖性肿瘤（MPN）患者中所见的CALR功能获得性突变。本方案包括sgRNA的设计、克隆与递送，稳定表达Cas9的细胞系的构建，以及CRISPR靶向基因编辑效果的筛选。该方法可适用于不同基因及多种细胞因子依赖性细胞系的研究，尤其在建模和探究癌症相关基因的生物学功能方面具有重要价值。

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方案

1. 使用在线工具设计sgRNA13

  1. 使用免费的在线工具设计靶向目标基因的sgRNA。
    1. 将目标基因的NCBI参考序列复制并粘贴到Broad研究所sgRNA设计网页工具中：(http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design)。
      注意：该工具可识别位于外显子内的切割位点，以及跨越内含子/外显子边界但仍在外显子内进行切割的sgRNA序列。
    2. 下载文本输出文件，并在Excel中打开。
    3. 重点关注包含sgRNA序列和sgRNA上下文序列的列。请注意，sgRNA序列本身不包含原间隔序列邻近基序（PAM），但上下文序列包含PAM。
    4. 请注意，靶向效率评分以0到1的范围列出，预测切割效率，评分为1表示更高的切割效率。
    5. 使用Excel的“排序”功能，按效率评分或通过“Target Cut %”列按目标在基因内的位置对候选序列进行排序。
      注意：按基因内的位置排序有助于识别靶向特定功能域或感兴趣外显子的sgRNA。
    6. 选择3-6个靶向感兴趣区域且具有高（>0.6）靶向效率评分的sgRNA。了解可能导致预期表型的突变类型可能有助于设计（请参见图1，解释用于钙网蛋白的靶向策略）。
      注意：当缺乏其他良好候选序列时，可考虑使用效率评分低于建议阈值0.6的sgRNA。
    7. 使用MIT gRNA分析网页工具筛选潜在的脱靶效应（http://crispr.mit.edu/）。对每个选定的sgRNA，运行其靶序列（包括PAM）。
      注意：Broad研究所sgRNA设计网页工具也可用于筛选脱靶效应（http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design）。
      1. 请注意，MIT sgRNA分析工具对每个sgRNA按1-100的评分标准进行打分，评分为100表示特异性更高。评分大于70为理想情况，代表该sgRNA具有最小的脱靶效应。该网站还会生成脱靶位点列表，包括其在基因组中的位置以及与候选引导序列的错配数量。
        注意：具有四个或更多错配的脱靶位点被认为是安全的14。若错配少于四个且位于外显子内，则可能存在问题14。
    8. 选择2-3个靶向目标基因感兴趣区域内不同位置、且具有最高成对切割效率和最佳脱靶评分的sgRNA（参见表1中靶向Calr基因第9外显子的sgRNA序列）。
      注意：根据实验目标的不同，可对上述工具获得的不同数值赋予不同的权重。

2. 克隆sgRNA寡核苷酸13

  1. 生成正向寡核苷酸
    1. 创建一个不含PAM位点的sgRNA序列列表。
    2. 如果sgRNA序列的5'端不是G，则在序列的5'端添加一个G。
      注意：此 G 对于最大化 U6 驱动的 sgRNA 转录水平是必需的。m1 sgRNA 必须添加一个 G。表1).
    3. 添加序列 "CACC" 到G优化的向导序列（无PAM）的5'端表2以产生连接退火寡核苷酸至 BsmBI 所需的突出末端 已消化的 lentiGuide 载体（参见步骤 3）。
  2. 生成反向引物
    1. 将G优化的引导序列（不含PAM）进行反向互补。
    2. 添加序列 "AAAC" 到反向互补的G优化向导序列的5'端（表2).
    3. 从引物合成公司订购设计好的寡核苷酸。
  3. 退火并磷酸化寡核苷酸
    1. 加入1 µL正向寡核苷酸（100 µM）、1 µL反向寡核苷酸（100 µM）、1 µL 10x T4连接酶缓冲液、0.5 µL T4多核苷酸激酶（PNK）和6.5 µL H₂O2加入PCR管中（总体积 = 10 µL）。
    2. 在热循环仪中运行以下程序：37 ˚C 反应 30 分钟，95 ˚C 变性 5 分钟，以 0.1 °C/s 的速率从 95 ˚C 降温至 25 ˚C。
    3. 将反应产物用 H 按 1:250 稀释2O.

3. lentiGuide-Puro 载体的消化13

  1. 消化 lentiGuide-Puro 载体
    1. 将以下组分混合配制成50 µL的酶切反应体系：5 µg环状质粒、2 µL（30单位）BsmBI限制性内切酶、5 µL限制性内切酶缓冲液，加H₂O至终体积50 µL2O.
    2. 在55 °C下反应2小时。第一小时结束后，再加入1 µL BsmBI限制性内切酶。
  2. 对切割后的载体进行去磷酸化处理
    1. 向消化后的载体中加入7 µL磷酸酶反应缓冲液和2 µL磷酸酶酶。
    2. 37 °C 下孵育 30 分钟。
  3. 使用商业试剂盒对切割并去磷酸化的载体骨架进行PCR纯化。
    注意：由于蓝色柱子能更好地容纳较大的质粒尺寸，因此请用试剂盒提供的蓝色柱子替换图示的粉色柱子。为提高产量，可在洗脱前将洗脱缓冲液在90 ˚C金属浴中预热，并在最后一步对柱子进行两次洗脱（将第一次洗脱得到的DNA再次加入柱子中进行第二次洗脱）。

4. 将退火的寡核苷酸连接至酶切后的骨架13

  1. 在PCR管中加入50 ng酶切后的骨架质粒、1 µL退火寡核苷酸稀释液、1 µL 10x T4连接缓冲液、1 µL T4 DNA连接酶，并用H2O补至总体积10 µL。在室温下孵育1小时。
  2. 取2 µL连接反应产物转化Stbl3感受态细胞，涂布于含100 µg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板，37 °C过夜培养。
  3. 挑取3个单菌落，接种至小量培养液中进行培养。
  4. 验证寡核苷酸的正确插入
    1. 对每种培养物进行质粒小量提取，并使用商业试剂盒，以U6启动子内的引物起始，对寡核苷酸插入位点进行测序验证。
    2. 对测序验证正确的菌株进行中量或大量质粒提取。

5. 稳定表达 SpCas9 的细胞系的建立

注意：本实验方案涉及通过慢病毒感染递送 pLX_TRC311-Cas9 质粒。本方案以依赖小鼠白细胞介素-3（mIL-3）的前B细胞（Ba/F3）悬浮细胞系为例进行详细描述，但可根据不同类型细胞的适宜培养条件进行调整，适用于其他细胞类型。Ba/F3 细胞的培养基由 RPMI 培养基组成，添加 10% 胎牛血清、1% 青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺以及 10 ng/mL 小鼠白细胞介素-3。

  1. 转染 HEK-293T 细胞
    1. 每10 cm组织培养皿接种3 × 106个HEK-293T细胞。转染前将接种的细胞培养过夜。
      注意：HEK-293T细胞为贴壁细胞系，常用于病毒生产。细胞维持在含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺的DMEM培养基中。转染时细胞融合度应达到80%。
    2. 预热低血清培养基（Opti-MEM）和生长培养基。
    3. 在离心管中加入500 µL低血清培养基、7 µg pLX_TRC311-Cas9质粒、4 µg pCMV-VSV-G慢病毒包装质粒和4 µg psPAX2慢病毒包装质粒。
      注意：每10 cm培养皿293T细胞的总DNA用量为15 µg。
    4. 充分混匀DNA溶液，加入45 µL转染试剂，轻轻混匀后室温静置20分钟。
      注意：必须使用低血清培养基，因为血清会抑制转染试剂与质粒DNA之间的复合物形成。
    5. 吸除293T培养皿中的旧培养基，加入5 mL新鲜生长培养基。
    6. 将DNA与转染试剂的混合物逐滴加入293T培养皿中，轻轻摇晃混匀，于37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。
    7. 在转染后24小时和48小时收集病毒上清液，经0.22 µm滤器过滤后分装至冻存管中（每管1.6 mL，其中1.5 mL用于感染）。
    8. 将病毒上清液于-80 °C保存。
      注意：慢病毒上清液可在6个月内使用。如条件允许，应尽量使用新鲜病毒进行离心感染（spinfection）。
  2. Ba/F3细胞的慢病毒感染
    1. 若病毒上清液为冷冻状态，需在冰上解冻。
    2. 以300 × g离心4分钟。
    3. 吸除上清液，将细胞重悬于浓度为3 × 106个细胞/mL的新鲜培养基中。
    4. 在6孔组织培养板中加入500 µL重悬细胞、1.5 mL病毒上清液、4 µL聚凝胺（储存液：2 mg/mL）和10 ng/mL小鼠白细胞介素-3（m-IL3）。作为对照，需设置未感染孔，用1.5 mL培养基替代病毒上清液。
      注意：加入的病毒上清液体积应使感染复数（MOI）<1。
    5. 将6孔板于37 °C、440 × g离心120分钟。
    6. 从离心机中取出培养板，置于37 °C、5% CO2培养箱中过夜培养。
    7. 24小时后离心收集细胞，用5 mL新鲜预热培养基重悬，接种于6孔板中。
  3. Cas9感染细胞的筛选
    1. 在离心感染后48小时，离心收集细胞，并用含5 µg/mL杀稻瘟菌素（blasticidin）的新鲜预热培养基重悬。
    2. 用杀稻瘟菌素筛选细胞9天，或直至未感染的（阴性）对照组细胞完全死亡。
    3. 筛选完成后，将存活的抗性细胞转移至含较低浓度杀稻瘟菌素的培养基中继续培养。

6. Cas9 活性的报告基因检测15

  1. 通过慢病毒感染，将 pXPR-011 载体转导至亲本细胞及稳定表达 Cas9 的细胞中（参见步骤 5.1–5.2）。
    注意：该载体同时包含 GFP 及靶向 GFP 的向导序列。含有活性 Cas9 的细胞将导致 GFP 表达减少（图 2）。
  2. 在离心感染后 48 小时，使用 2 µg/mL 嘌呤霉素对细胞进行为期 3 天的筛选。
  3. 通过流式细胞术分析样品的 GFP 表达水平。
    注意：GFP 表达减少 50% 或以上表明 Cas9 活性处于理想水平。若观察到的减少幅度低于 50%，可使用更高浓度的杀稻瘟菌素进行筛选以提高 Cas9 活性。但并非所有细胞系均能耐受杀稻瘟菌素筛选；在此情况下，可能需要使用携带其他筛选标记盒的 Cas9 载体。此外，并非所有细胞系均可耐受 Cas9 的稳定表达；此时可采用 Cas9 的瞬时转染方式。

7. 将sgRNA转导至表达Cas9的细胞中

  1. 按照步骤 5.1–5.2 对目标细胞进行慢病毒 sgRNA 感染。
    注意：在步骤 5.1.3 中，将 pLX_TRC311-Cas9 载体替换为第 4 部分中已验证的 lentiGuide-Puro 载体。
  2. 离心感染后 48 小时，用 2 µg/mL 嘌呤霉素对细胞进行 3 天的筛选。
  3. 将抗性细胞转移至抗生素浓度较低的培养基中，继续筛选 4 天，以确保充分编辑。

8. 使用 m-IL3 撤除法进行 Ba/F3 细胞转化与阳性筛选

注意：本实验以依赖mIL-3的Ba/F3细胞为例进行描述，但可适用于任何依赖细胞因子的细胞系。

  1. 离心收集稳定表达Cas9及目的sgRNA的对数生长期Ba/F3细胞。
  2. 吸除上清液，用5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
  3. 离心收集细胞，并重复步骤8.2中的洗涤步骤共四次（此步骤可确保完全去除培养基中的IL-3）。
  4. 吸除PBS，将细胞重悬于5 mL不含IL-3的新鲜培养基中。
  5. 使用血细胞计数板或细胞活力分析仪对细胞进行计数。
  6. 将细胞以1 × 105 个/mL的浓度接种于6孔组织培养板中，每孔总体积为2 mL不含IL-3的新鲜培养基，每组设三个重复孔。
  7. 每隔2天观察并计数细胞，持续共8天。
    注意：缺乏IL-3的Ba/F3细胞通常在撤除IL-3后2天内死亡。实验中必须设置阴性对照（通常使用非靶向性向导RNA作为对照）。

9. CRISPR 靶向编辑的筛选

  1. 在sgRNA切割位点的上游和下游设计CRISPR筛选引物
    注意：引物应距离预测的切割位点至少100 bp，以确保在sgRNA靶位点发生较大插入和/或缺失（indel）时仍能有效检测。
  2. 从转化后的细胞（生长曲线末期）以及细胞因子撤除前的细胞中提取基因组DNA（gDNA）。
    注意：始终将过表达非靶向引导RNA的细胞作为基因编辑的对照。分别在转化前和转化后提取gDNA，可识别出被正向筛选并具有增殖优势的克隆。
  3. 配制50 µL的PCR反应体系，包含以下组分：25 µL 2x PCR混合液，1 µL正向引物（10 µM），1 µL反向引物（10 µM），50–100 ng gDNA，加H2O至50 µL。
    注意：步骤9.3中可使用多种高保真聚合酶。
  4. 在热循环仪中运行样品，程序如下：95°C预变性1分钟，30个循环（94°C变性1分钟，52°C退火30秒，72°C延伸30秒），最后72°C延伸10分钟。本PCR程序针对表3中列出的Calr引物进行了优化。应根据在gDNA上的测试结果，对步骤9.1中设计的引物对优化PCR条件。
  5. 取5 µL PCR产物，在1x Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液中，以10 V/cm的电压在2%琼脂糖凝胶上电泳。观察样品中是否存在与目标基因大小相符的扩增条带。
  6. 使用剩余的PCR反应产物（45 µL）进行PCR纯化。
  7. 使用PCR克隆试剂盒将扩增产物克隆至质粒载体中。例如，通常使用pGEM T-easy载体。
  8. 将质粒转化至Stbl3细胞或其他相容性细胞中，并涂布于含相应抗生素的LB琼脂平板上。挑选10–20个单菌落，分别进行质粒小提，并对每个克隆进行Sanger测序，以鉴定CRISPR/Cas9编辑产生的indel类型。
    注意：如有需要，可对混合编辑的细胞群体进行单细胞荧光激活细胞分选（FACS），以分离具有特定indel的克隆。此外，也可采用下一代测序（NGS）方法，通过对跨越sgRNA靶区域的PCR扩增子进行深度测序，更可靠地定量分析靶向编辑效率。例如，可使用“通过分解追踪indel”（Tracking of Indels by Decomposition，TIDE）方法替代亚克隆，精确测定细胞群体中靶向突变的谱型和频率（https://tide.nki.nl/#about）16。

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结果

本实验旨在通过在内源性Calr基因座中引入插入/缺失（indel）突变，研究其对造血细胞转化的功能影响。采用CRISPR/Cas9系统作为工具，在Ba/F3细胞中构建内源性Calr突变。选择两条sgRNA靶向Calr基因的第9号外显子（图1），该区域是CALR突变型骨髓增殖性肿瘤（MPN）患者中插入和/或缺失（indel）突变的常见发生区域17,18。第一条sgRNA（m1）因其较高的切割效率和理想的脱靶评分而被选用（Table 1）。第二条sgRNA（m2）主要基于其在第9号外显子内的位置被选择，且该区域缺乏其他具备高切割效率和理想脱靶评分的可用sgRNA（Table 1）。在独立的感染实验中分别使用两条不同的sgRNA（m1或m2），以确保所观察到的效应源...

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讨论

本文演示了使用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究CALR突变在造血细胞中生物学功能的方法。该实验方案的成功高度依赖于多个因素。首先，必须明确哪些类型的突变可能导致预期的表型。在本方案中，检测指标是Ba/F3细胞转化为对mIL-3非依赖性生长，所关注的突变类型为CALR基因第9外显子中的插入或缺失（indel）。然而，如果目标是实现单碱基对替换，则应优先选择通过HDR介导的修复方式，因为该方法能够利用单链或双链DNA供体模板精确引入点突变或插入序列2,3。若目标是完全敲除基因功能，则更推荐通过靶向早期编码外显子产生大规模基因组缺失的方法20。

其次，细胞系必须具有细胞因子依赖性，以便在撤除细胞因子后施加正向筛选压力。需要注意的是，并非所有细胞系都能耐受Cas9的稳定表达（参见步骤6.3）。这可能是由于部分细胞系无法耐受杀稻瘟菌素（blasticidin）筛选。在此情况下，可能需要选...

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披露

我们与本报告无任何利益冲突。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（R01HL131835）、达蒙·鲁尼恩临床研究员奖以及斯塔尔癌症联盟资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BsmBI新英格兰生物实验室R0580L
杀稻瘟菌素西格玛奥德里奇15025
嘌呤霉素生命技术公司A1113803
Stbl3 细胞生命技术公司C737303
TransIT-LT1赛默飞世尔科技MIR2300
Opti-MEM生命技术公司51985034
RPMI赛默飞世尔科技MT10040CV
DMEM赛默飞世尔科技10-017-CV
胎牛血清 (FBS)Omega 科学公司FB-11
青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺生命技术公司10378016
mIL-3Peprotech 公司213-13
psPAX2Addgene 公司N/A
pCMV-VSV-GAddgene 公司N/A
pLX_TRC311-Cas9Addgene 公司N/A
聚凝胺西格玛奥德里奇H9268
pXPR-011Addgene 公司N/A
磷酸盐缓冲液 (PBS)Genessee 科学公司25-507
TAE 缓冲液赛默飞世尔科技FERB49
LentiGuide-PuroAddgene 公司质粒 #52963
PNK新英格兰生物实验室M0201S
T4 连接酶新英格兰生物实验室M0202S
PCR 纯化试剂盒Qiagen 公司28104
质粒小提试剂盒Qiagen 公司27104

参考文献

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