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方法文章

提高通量的基因枪轰击大麦糊粉层基因表达检测

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DOI：

10.3791/56728

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2018年3月30日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Colby College

本文内容

摘要

本文介绍了一种改进的实验方案，用于在基因枪轰击后测定大麦糊粉层细胞中报告基因构建体的瞬时表达。通过将自动化谷物研磨与96孔板酶活性检测相结合，显著提高了该方法的通量。

摘要

大麦籽粒的糊粉层是研究植物激素调控基因表达的重要模型系统。在糊粉细胞中，赤霉素（GA）可激活萌发或早期幼苗发育所需的基因，而脱落酸（ABA）则激活与应激反应相关的基因。通过粒子轰击法将报告基因构建体导入糊粉细胞，并利用酶活性检测分析瞬时表达水平，可深入探究GA与ABA信号转导机制。本文报道了一种改进的实验方案，部分实现了籽粒匀浆步骤和酶活性检测的自动化与流程化，显著提高了通量，优于现有方法。籽粒样品的匀浆采用自动组织匀浆仪完成，GUS（β-葡萄糖醛酸苷酶）检测则使用96孔板系统进行。采用该方案获得的代表性结果表明，磷脂酶D活性可能通过转录因子TaABF1，在ABA激活HVA1基因表达过程中发挥重要作用。

引言

大麦糊粉层是研究植物激素调控基因表达的成熟模型系统1。特别是，一些萌发或早期幼苗发育所必需的基因由赤霉素（GA）激活，而与应激反应相关的基因则由脱落酸（ABA）激活。GA和ABA信号通路相互交织，因为某些GA激活的基因的表达可被ABA抑制，反之亦然1。

理解特定因子在GA/ABA信号通路中作用的一个有效策略是通过粒子轰击法导入效应基因构建体，随后瞬时表达报告基因构建体，从而确定其对下游基因表达的影响。使用诸如GUS （β-葡萄糖醛酸酶）或Luciferase（荧光素酶）等报告基因，可在接收到效应构建体的细胞内实现对基因表达的高灵敏度和定量检测。例如，导入编码转录因子TaABF15,6的效应构建体后发现，TaABF1能够诱导ABA诱导型基因（如HVA1），同时抑制GA诱导型基因（如Amy32b）的表达。作为一种实验策略，粒子轰击法已被多个实验室用于研究GA/ABA信号通路的多个方面。相关研究已鉴定了对GA诱导基因2和ABA诱导基因3激活均具有重要作用的启动子元件，并发现了调控这些基因表达的蛋白激酶4和转录因子5。

现有的关于基因枪轰击及后续瞬时基因表达检测的方案2,3,4,5,6工作量较大，因为每组轰击后的裸麦颗粒需手工在研钵中研磨匀浆，且酶活性测定需逐个进行。本文报道了一种改进的方案，部分实现了匀浆步骤和GUS活性检测的自动化与流程化，显著提高了通量，使得在同一实验中可检测更多处理条件，和/或为每个处理增加更多重复，从而获得更具统计学意义的结果。文中展示了在转录因子TaABF1以及赤霉素（GA）、脱落酸（ABA）和其他调控分子调控下，HVA1 和 Amy32b 报告基因构建体表达的代表性结果。

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方案

1. 效应基因和报告基因载体的构建

  1. 构建效应子表达载体，使用组成型启动子（例如玉米泛素启动子 UBI）驱动目标开放阅读框的表达。例如，构建含有 UBI::TaABF1 的质粒，以实现 TaABF1 的强组成型表达5。
  2. 构建报告基因表达载体，将待检测活性的启动子置于报告基因开放阅读框上游，例如 GUS。例如，构建含有 HVA1::GUS 的质粒，用于检测 HVA1 启动子的表达活性2,5。
  3. 构建内参对照表达载体（例如 UBI::luciferase）。
  4. 采用硅胶结合柱法（参见材料表），制备高质量的各所需基因构建质粒。利用紫外分光光度法（参见材料表），精确测定每种质粒制备物的浓度。

2. 准备受轰击的大麦籽粒

  1. 建立一个电子表格（示例见图1），列出将要进行基因枪轰击的质粒、相应的激素处理以及其他与实验中各处理组相关的必要信息。
  2. 使用砧板和无菌剃刀片，从喜马拉雅大麦籽粒中切下胚（每个处理组准备40粒）。剔除颜色异常或明显小于平均大小的籽粒。
  3. 将所有去胚的籽粒放入一个50 mL离心管中，加入40 mL水，轻轻摇动10分钟。
  4. 小心倒出水分（避免损失籽粒），加入40 mL 10%次氯酸钠溶液，摇动20分钟进行表面消毒。
  5. 倒出次氯酸钠溶液，加入40 mL无菌水，摇动5分钟。重复此无菌水洗涤步骤共五次。
  6. 加入40 mL吸胀液（20 mM琥珀酸钠，20 mM氯化钙，pH 5.0）和40 μL氯霉素储备液（10 mg/mL）。
  7. 将大部分含氯霉素的吸胀液从离心管转移至蛭石板中（见材料表），然后将籽粒转移至蛭石板内湿润滤纸表面，均匀铺开。加入适量吸胀液，使籽粒部分（而非完全）浸没。盖上蛭石板盖子。
  8. 将去胚籽粒在24 °C条件下，于荧光灯照射下孵育约48小时。根据需要补充吸胀液。
  9. 打开一个90 mm塑料培养皿，向皿底加入20 mL吸胀液，向倒置的皿盖中也加入20 mL吸胀液，并分别加入20 μL氯霉素溶液（10 mg/mL）。将两对精细尖头镊子浸入酒精中进行灭菌处理。
  10. 将少量去胚籽粒放入培养皿盖中，用镊子轻轻去除每粒籽粒的（透明）种皮。在剥离籽粒光滑面种皮时，注意不要损伤下方的（糊粉层）细胞。将去皮后的籽粒转移至含有吸胀液的培养皿中。
  11. 完成所有籽粒的种皮剥离后，将其重新放回蛭石板中，在24 °C条件下继续孵育16–20小时。
  12. 在进行基因枪轰击前，将籽粒置于培养皿中的滤纸间轻轻震荡，以去除表面多余水分。

3. 基因枪轰击用质粒DNA的制备

  1. 为基因枪实验中包含的每种处理标记一个1.5 mL离心管。向每根离心管中加入2.5 µg的UBI::luciferase内参对照质粒、2.5 µg的GUS报告基因质粒，以及所需量（通常为0.025 µg至2.5 µg）的效应质粒。加入水使总体积达到5 µL。
  2. 按照已发表的实验方案6制备1.6 µm金微载体（见材料表）。
  3. 对于每种处理，将50 µL悬浮的微载体加入含有质粒DNA的1.5 mL离心管中。根据生产商的说明书6，使微载体与质粒DNA进行包被。
  4. 在最后一步，当质粒包被的微载体悬浮于48 µL 100%乙醇中时，用移液器将8 μL悬浮液转移至五个宏载体中的每一个上，并使其自然风干。

4. 胚乳缺失大麦籽粒的微粒轰击

  1. 安装基因枪装置（参见材料表）6。
  2. 将1550 psi的破裂盘放入固定帽中，并将其安装到仪器上。
  3. 将含有目标质粒组合的宏载体（连同阻挡筛）放入微载体发射组件中，再将该组件插入轰击室顶部的插槽。将破裂盘固定帽与宏载体盖之间的距离设为标准距离（6 mm），并将阻挡筛支架置于（标准）中间位置，使宏载体的运动距离为11 mm（图2A）。
  4. 将8粒去胚籽粒紧密地呈放射状排列在滤纸圆片上（较细的一端朝内），并将滤纸用胶带平整固定于90 mm培养皿盖上（参见图2B）。
  5. 将装有籽粒的培养皿放入轰击室中，使其距离阻挡筛6 cm。
  6. 将轰击室抽真空至95 kPa，然后对样品进行轰击。
  7. 释放真空后，将轰击过的籽粒转移至已标记的60 mm培养皿中，其中含有4 mL含1 mg/mL氯霉素的吸胀溶液。
  8. 重复上述步骤，直至完成全部轰击。在24 °C下于摇床（100 rpm）中孵育24小时。

5. 从轰击后的谷粒中提取可溶性蛋白

  1. 用镊子从60 mm培养皿中取出8个轰击过的籽粒，并用纸巾吸干。将籽粒分成两份，分别放入两个已标记的2.0 mL离心管中（每管4个籽粒），每管中加入800 μL研磨缓冲液（100 mM Na磷酸盐缓冲液，pH 7.2，5 mM DTT，10 µg/mL亮抑蛋白酶肽，20%甘油）和一个5 mm不锈钢研磨珠。对所有轰击过的籽粒重复此操作。
  2. 将最多48个2.0 mL离心管放入珠磨匀浆器的两个支架中（参见材料表）。将支架安装到匀浆器上。
  3. 以30 Hz频率震荡样品3分钟。
  4. 从匀浆器上取下支架，置于冰上（5分钟），使样品重新冷却。
  5. 将支架以相反方向重新装回匀浆器。再次以30 Hz频率震荡样品3分钟。
  6. 将支架放回冰上冷却，然后重复步骤5.3至5.5。总震荡时间累计达到12分钟。
  7. 在4 °C条件下，以16,000 x g离心籽粒提取物10分钟。
  8. 离心后立即将澄清的上清液转移至另一组微量离心管中。每管短暂涡旋混匀。将离心管置于冰上保存。
  9. 转移上清液后，从沉淀中回收钢珠，以便清洗后重复使用。

6. 从谷物提取物中检测荧光素酶活性

  1. 针对每个待检测的谷物提取物样品，准备一支12 mm × 75 mm的玻璃试管，其中含有200 μL荧光素酶检测混合液（45 mM 硫酸Tris，pH 7.7，15 mM MgCl2，20 mM DTT，1.5 mM EDTA，1 mM 荧光素，1 mM ATP）。
  2. 向第一支检测试管中加入100 μL第一个谷物提取物样品，迅速涡旋混匀。立即将试管放入化学发光仪的试管架中并关闭仪器门。当测量完成后，从化学发光仪中取出试管——保持仪器门打开，以便放入下一支试管。
  3. 重复此过程，直至所有样品均完成检测。

7. 从籽粒提取物中测定GUS活性

  1. 向96孔板的每个孔中加入200 μL GUS检测缓冲液（50 mM Na磷酸盐，pH 7.2，2.5 mM 4-甲基伞形基-β-D-葡萄糖醛酸苷，10 mM DTT，2 mM EDTA，10 µg/mL亮抑蛋白酶肽，20%甲醇，0.02%叠氮化钠）。
  2. 将每种谷物提取物各50 μL加入对应的孔中。加样后用枪头混匀，并用封板膜密封板孔。
  3. 将96孔板在黑暗条件下于37 °C孵育20小时。
  4. 将96孔板在4 °C下以4,000 × g离心10分钟，然后置于冰上。
  5. 向黑色96孔板的每个孔中加入250 μL 0.2 M Na2CO3。
  6. 将每种离心后的GUS检测反应混合物各6.25 μL加入黑色96孔板中对应的孔（含0.2 M Na2CO3）中。加样后用枪头混匀。同时设置标准品孔，分别加入6.25 μL的10 μM、40 μM和100 μM 4-甲基伞形酮溶液。
  7. 将黑色96孔板放入酶标仪中检测甲基伞形酮的荧光强度。激发波长设为360 nm，发射波长设为460 nm。调节仪器增益，使含有6.25 μL 40 μM 4-甲基伞形酮和250 μL 0.2 M Na2CO3的孔荧光读数为1000荧光单位。

8. 数据分析

  1. 将荧光素酶和GUS检测的数值输入电子表格中。排除荧光素酶读数低于20,000 相对光单位 s-1 的任何样品，因为这表明基因构建物未能成功递送至糊粉层细胞。
  2. 对于每个成功进行基因枪轰击的谷粒提取物（代表四粒去胚谷粒的组合），根据原始GUS和荧光素酶数据计算标准化的GUS表达量，公式如下：标准化GUS = [(GUS表达量 - GUS空白值) × (2,000,000)] / (荧光素酶表达量 - 荧光素酶空白值)。
    注：此步骤将GUS活性标准化至相当于荧光素酶读数为2,000,000时的水平。
  3. 通过比较在存在待测效应因子构建物或激素处理条件下与不存在效应因子或激素时特定报告基因构建物的表达水平，报告其相对表达水平。

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结果

此处所述技术可用于将任何测试基因构建体导入大麦籽粒的糊粉层细胞中。随后可方便地测定测试基因的表达水平（图2）。本文所述的高通量实验流程显著提高了种子研磨和酶活性检测步骤的效率。该方法已被用于评估转录因子TaABF15,6激活ABA诱导基因HVA17表达的能力。在本研究展示的代表性结果中，将HVA1::GUS报告基因构建体与UBI::TaABF1效应子构建体共同导入糊粉层细胞（图3A）。在无外源ABA存在的情况下，仅需0.01的TaABF1/HVA1比例即可使HVA1报告基因的表达升高3倍；而随着TaABF1构建体用量的增加，HVA1的表达水平进一步逐...

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讨论

通过粒子轰击法导入效应基因构建体，随后进行报告基因构建体的瞬时表达，是解析特定因子在GA/ABA信号转导及其介导的激素调控基因表达中作用的有效策略。
然而，目前在大麦糊粉细胞中开展此类实验的已有方案2,3,4,5,6 极为耗时费力。每组轰击后的大麦籽粒均需手工在研钵中研磨匀浆，所得提取物须分别检测GUS和荧光素酶活性。因此，现有方案限制了单次实验中可包含的独立处理组数量，也限制了每种处理所能合理设置的生物学重复次数。这些限制使得在多个处理间进行系统且同步的比较变得更加困难。若不同处理间的基因表达差异较小，则需要相对更多的生物学重复以达到统计学显著性，此类比较将尤为困难。

本文介绍了一种简化的实验流程，该流程部分实现了谷物提取物制备和GUS检测的自动...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢Greyson Butler和Margaret Barrett在实验实施过程中提供的帮助，感谢Judy Stone对谷物均质化的建议，以及感谢Lynn Hannum对荧光测定法的建议。本工作由美国国家科学基金会（IOB 0443676）资助，由美国国立卫生研究院下属国立普通医学科学研究所的机构发展奖（IDeA）在资助号P20GM0103423下资助，并由科尔比学院自然科学部的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
GeneElute HP 质粒大提试剂盒SigmaNA0310-1KT
紫外-可见分光光度计NanodropND-1000
喜马拉雅青稞籽粒//一种裸粒大麦品种（于4°C避光保存）
琥珀酸钠SigmaS2378吸胀液试剂
氯化钙（二水合物）FisherC79-500吸胀液试剂
吸胀液自制/20 mM 琥珀酸钠，20 mM 氯化钙，pH 5.0。使用前高压灭菌。
氯霉素SigmaC0378用70%乙醇配制10 mg/mL的储存液。
蛭石FisherNC0430369用于蛭石平板。
滤纸圆片（90 mm）Whatman1001 090用于蛭石平板及轰击前籽粒处理
蛭石平板自制/将50 mL蛭石加入玻璃培养皿中，在蛭石上放置一张90 mm滤纸圆片，高压灭菌。
镊子（尖头）Fisher13-812-42用于去除青稞籽粒的种皮。
镊子（超细尖）Fisher12-000-122用于去除青稞籽粒的种皮。
金微载体（1.6 μm）BioRad1652264
宏载体BioRad1652335
氯化钙（二水合物）FisherC79-500配制2.5 M储存液，分装1 mL至离心管中，于-20°C保存。
亚精胺SigmaS0266配制100 mM储存液，分装500 μL至离心管中，于-20°C保存（2个月内使用）。
破裂盘（1550 psi）BioRad1652331
阻挡筛网BioRad1652336
宏载体支架BioRad1652322
基因枪粒子递送系统BioRadPDS-1000/He
一水合磷酸二氢钠SigmaS96381M 磷酸钠缓冲液 pH 7.2 的试剂
磷酸氢二钠SigmaS97631M 磷酸钠缓冲液 pH 7.2 的试剂
1M 磷酸钠缓冲液 pH 7.2自制/将6.9 g一水合磷酸二氢钠与7.1 g磷酸氢二钠混合，加水至100 mL，用NaOH调节pH至7.2。
二硫苏糖醇（DTT）Sigma43819溶于水配成1 M溶液，分装1 mL至离心管中，于-20°C保存。
亮抑蛋白酶肽SigmaL2884溶于水配成10 mg/mL溶液，于-20°C保存。
甘油SigmaG5516用水配制成50%溶液。
研磨缓冲液自制/取10 mL 1 M 磷酸钠缓冲液 pH 7.2，500 μL 1 M DTT，100 μL 10 mg/mL 亮抑蛋白酶肽，40 mL 50%甘油，加水至100 mL。
不锈钢珠（5 mm）Qiagen69989
2.0 mL 离心管Eppendorf22363352推荐使用此特定型号离心管与均质器配合使用。
珠磨均质器（TissueLyser）Qiagen85210
12 mm × 75 mm 玻璃试管Fisher
荧光素GoldbioLUCK-100配制25 mM储存液，分装1 mL至离心管中，于-20°C保存。
ATPSigmaA7699配制100 mM储存液，分装250 μL至离心管中，于-20° C保存。
Tris碱SigmaT15031M Tris硫酸盐缓冲液 pH 7.7 的试剂。
硫酸Sigma2581051M Tris硫酸盐缓冲液 pH 7.7 的试剂。
1M Tris硫酸盐缓冲液 pH 7.7自制/将12.1 g Tris碱溶于100 mL水中，用硫酸调节pH至7.7。
氯化镁SigmaM9397溶于水配成2 M溶液。
荧光素酶检测缓冲液（LAB）自制/取3 mL 1 M Tris硫酸盐缓冲液 pH 7.7，500 μL 2 M 氯化镁，1 mL 1 M DTT，200 μL 0.5 M EDTA，加水至50 mL。
荧光素酶检测混合液自制/取15 mL LAB，800 μL 25 mM 荧光素，200 μL 100 mM ATP，4 mL 水。此配方可制备20 mL检测混合液，足够进行100次荧光素酶检测。
发光仪（Sirius）Berthold/
4-甲基伞形基-β-D-葡萄糖苷酸（MUG）GoldbioMUG1溶于DMSO配成100 mM溶液。
叠氮化钠SigmaS8032用水配制2%储存液，分装1 mL至离心管中，于-20°C保存。
96孔板（标准）Fisher12565501
GUS检测缓冲液自制/取2.5 mL MUG，5 mL 1 M 磷酸钠缓冲液 pH 7.2，400 μL 0.5 M EDTA，1 mL 1 M DTT，100 μL 10 mg/mL 亮抑蛋白酶肽，20 mL 甲醇，1 mL 2% 叠氮化钠，加水至100 mL。
TempPlate 密封膜USA Scientific2921-1000
96孔板（黑色）Costar3916
碳酸钠SigmaS7795用水配制成200 mM溶液。
4-甲基伞形酮SigmaM1381用水配制成100 μM溶液，分装1 mL至离心管中，于-20° C冷冻保存。
微孔板荧光读数仪Bio-TekFLX-800

参考文献

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