方法文章

提高通量的基因枪轰击大麦糊粉层基因表达检测

6.3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/56728

⸱

2018年3月30日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Colby College

本文内容

摘要

本文介绍了一种改进的实验方案，用于在基因枪轰击后测定大麦糊粉层细胞中报告基因构建体的瞬时表达。通过将自动化谷物研磨与96孔板酶活性检测相结合，显著提高了该方法的通量。

摘要

大麦籽粒的糊粉层是研究植物激素调控基因表达的重要模型系统。在糊粉细胞中，赤霉素（GA）可激活萌发或早期幼苗发育所需的基因，而脱落酸（ABA）则激活与应激反应相关的基因。通过粒子轰击法将报告基因构建体导入糊粉细胞，并利用酶活性检测分析瞬时表达水平，可深入探究GA与ABA信号转导机制。本文报道了一种改进的实验方案，部分实现了籽粒匀浆步骤和酶活性检测的自动化与流程化，显著提高了通量，优于现有方法。籽粒样品的匀浆采用自动组织匀浆仪完成，GUS（β-葡萄糖醛酸苷酶）检测则使用96孔板系统进行。采用该方案获得的代表性结果表明，磷脂酶D活性可能通过转录因子TaABF1，在ABA激活HVA1基因表达过程中发挥重要作用。

引言

大麦糊粉层是研究植物激素调控基因表达的成熟模型系统1。特别是，一些萌发或早期幼苗发育所必需的基因由赤霉素（GA）激活，而与应激反应相关的基因则由脱落酸（ABA）激活。GA和ABA信号通路相互交织，因为某些GA激活的基因的表达可被ABA抑制，反之亦然1。

理解特定因子在GA/ABA信号通路中作用的一个有效策略是通过粒子轰击法导入效应基因构建体，随后瞬时表达报告基因构建体，从而确定其对下游基因表达的影响。使用诸如GUS （β-葡萄糖醛酸酶）或Luciferase（荧光素酶）等报告基因，可在接收到效应构建体的细胞内实现对基因表达的高灵敏度和定量检测。例如，导入编码转录因子TaABF15,6的效应构建体后发现，TaABF1能够诱导ABA诱导型基因（如HVA1），同时抑制GA诱导型基因（如Amy32b）的表达。作为一种实验策略，粒子轰击法已被多个实验室用于研究GA/ABA信号通路的多个方面。相关研究已鉴定了对GA诱导基因2和ABA诱导基因3激活均具有重要作用的启动子元件，并发现了调控这些基因表达的蛋白....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 效应基因和报告基因载体的构建

  1. 构建效应子表达载体，使用组成型启动子（例如玉米泛素启动子 UBI）驱动目标开放阅读框的表达。例如，构建含有 UBI::TaABF1 的质粒，以实现 TaABF1 的强组成型表达5。
  2. 构建报告基因表达载体，将待检测活性的启动子置于报告基因开放阅读框上游，例如 GUS。例如，构建含有 HVA1::GUS 的质粒，用于检测 HVA1 启动子的表达活性2,5。
  3. 构建内参对照表达载体（例如 UBI::luciferase）。
  4. 采用硅胶结合柱法（参见材料表），制备高质量的各所需基因构建质粒。利用紫外分光光度法（参见材料表），精确测定每种质粒制备物的浓度。

2. 准备受轰击的大麦籽粒

  1. 建立一个电子表格（示例见图1），列出将要进行基因枪轰击的质粒、相应的激素处理以及其他与实验中各处理组相关的必要信息。
  2. 使....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

此处所述技术可用于将任何测试基因构建体导入大麦籽粒的糊粉层细胞中。随后可方便地检测测试基因的表达水平（图2）。本文所述的高通量实验流程显著提高了种子研磨和酶活性检测步骤的效率。该方法已被用于评估转录因子TaABF15,6激活ABA诱导基因HVA17表达的能力。在本研究展示的代表性结果中，将HVA1::GUS报告基因构建体与UBI::TaABF1效应子构建体共同导入糊粉层细胞（图3A）。即使在无外源ABA存在的情况下，仅TaABF1/HVA1比例为0.01时即可引起HVA1报告基因3倍的诱导表达；而随着TaABF1构建体含量的增加，HVA1的表达水平进.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

通过粒子轰击法导入效应基因构建体，随后进行报告基因构建体的瞬时表达，是解析特定因子在GA/ABA信号转导及其介导的激素调控基因表达中作用的有效策略。
然而，目前在大麦糊粉细胞中开展此类实验的已有方案2,3,4,5,6 极为耗时费力。每组轰击后的大麦籽粒均需手工在研钵中研磨匀浆，所得提取物须分别检测GUS和荧光素酶活性。因此，现有方案限制了单次实验中可包含的独立处理组数量，也限制了每种处理所能合理设置的生物学重复次数。这些限制使得在多个处理间进行系统且同步的比较变得更加困难。若不同处理间的基因表达差异较小，则需要相对更多的生物学重复以达到统计学显著性，此类比较将尤为困难。

本文介绍了一种简化的实验流程，该流程部分实现了谷物提取物制备和GUS检测的自动.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢Greyson Butler和Margaret Barrett在实验实施过程中提供的帮助，感谢Judy Stone对谷物均质化的建议，以及感谢Lynn Hannum对荧光测定法的建议。本工作由美国国家科学基金会（IOB 0443676）资助，由美国国立卫生研究院下属国立普通医学科学研究所的机构发展奖（IDeA）在资助号P20GM0103423下资助，并由科尔比学院自然科学部的资助支持。

....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
GeneElute HP 质粒大提试剂盒SigmaNA0310-1KT
紫外-可见分光光度计NanodropND-1000
喜马拉雅青稞籽粒//一种裸粒大麦品种（于4°C避光保存）
琥珀酸钠SigmaS2378吸胀液试剂
氯化钙（二水合物）FisherC79-500吸胀液试剂
吸胀液自制/20 mM 琥珀酸钠，20 mM 氯化钙，pH 5.0。使用前高压灭菌。
氯霉素SigmaC0378用70%乙醇配制10 mg/mL的储存液。
蛭石FisherNC0430369用于蛭石平板。
滤纸圆片（90 mm）Whatman1001 090用于蛭石平板及轰击前籽粒处理
蛭石平板自制/将50 mL蛭石加入玻璃培养皿中，在蛭石上放置一张90 mm滤纸圆片，高压灭菌。
镊子（尖头）Fisher13-812-42用于去除青稞籽粒的种皮。
镊子（超细尖）Fisher12-000-122用于去除青稞籽粒的种皮。
金微载体（1.6 μm）BioRad1652264
宏载体BioRad1652335
氯化钙（二水合物）FisherC79-500配制2.5 M储存液，分装1 mL至离心管中，于-20°C保存。
亚精胺SigmaS0266配制100 mM储存液，分装500 μL至离心管中，于-20°C保存（2个月内使用）。
破裂盘（1550 psi）BioRad1652331
阻挡筛网BioRad1652336
宏载体支架BioRad1652322
基因枪粒子递送系统BioRadPDS-1000/He
一水合磷酸二氢钠SigmaS96381M 磷酸钠缓冲液 pH 7.2 的试剂
磷酸氢二钠SigmaS97631M 磷酸钠缓冲液 pH 7.2 的试剂
1M 磷酸钠缓冲液 pH 7.2自制/将6.9 g一水合磷酸二氢钠与7.1 g磷酸氢二钠混合，加水至100 mL，用NaOH调节pH至7.2。
二硫苏糖醇（DTT）Sigma43819溶于水配成1 M溶液，分装1 mL至离心管中，于-20°C保存。
亮抑蛋白酶肽SigmaL2884溶于水配成10 mg/mL溶液，于-20°C保存。
甘油SigmaG5516用水配制成50%溶液。
研磨缓冲液自制/取10 mL 1 M 磷酸钠缓冲液 pH 7.2，500 μL 1 M DTT，100 μL 10 mg/mL 亮抑蛋白酶肽，40 mL 50%甘油，加水至100 mL。
不锈钢珠（5 mm）Qiagen69989
2.0 mL 离心管Eppendorf22363352推荐使用此特定型号离心管与均质器配合使用。
珠磨均质器（TissueLyser）Qiagen85210
12 mm × 75 mm 玻璃试管Fisher
荧光素GoldbioLUCK-100配制25 mM储存液，分装1 mL至离心管中，于-20°C保存。
ATPSigmaA7699配制100 mM储存液，分装250 μL至离心管中，于-20° C保存。
Tris碱SigmaT15031M Tris硫酸盐缓冲液 pH 7.7 的试剂。
硫酸Sigma2581051M Tris硫酸盐缓冲液 pH 7.7 的试剂。
1M Tris硫酸盐缓冲液 pH 7.7自制/将12.1 g Tris碱溶于100 mL水中，用硫酸调节pH至7.7。
氯化镁SigmaM9397溶于水配成2 M溶液。
荧光素酶检测缓冲液（LAB）自制/取3 mL 1 M Tris硫酸盐缓冲液 pH 7.7，500 μL 2 M 氯化镁，1 mL 1 M DTT，200 μL 0.5 M EDTA，加水至50 mL。
荧光素酶检测混合液自制/取15 mL LAB，800 μL 25 mM 荧光素，200 μL 100 mM ATP，4 mL 水。此配方可制备20 mL检测混合液，足够进行100次荧光素酶检测。
发光仪（Sirius）Berthold/
4-甲基伞形基-β-D-葡萄糖苷酸（MUG）GoldbioMUG1溶于DMSO配成100 mM溶液。
叠氮化钠SigmaS8032用水配制2%储存液，分装1 mL至离心管中，于-20°C保存。
96孔板（标准）Fisher12565501
GUS检测缓冲液自制/取2.5 mL MUG，5 mL 1 M 磷酸钠缓冲液 pH 7.2，400 μL 0.5 M EDTA，1 mL 1 M DTT，100 μL 10 mg/mL 亮抑蛋白酶肽，20 mL 甲醇，1 mL 2% 叠氮化钠，加水至100 mL。
TempPlate 密封膜USA Scientific2921-1000
96孔板（黑色）Costar3916
碳酸钠SigmaS7795用水配制成200 mM溶液。
4-甲基伞形酮SigmaM1381用水配制成100 μM溶液，分装1 mL至离心管中，于-20° C冷冻保存。
微孔板荧光读数仪Bio-TekFLX-800

参考文献

  1. Chen, K., An, Y. Q. C. Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone. J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).
  2. Lanahan, M. B., Ho, T. H. D., Rogers, S. W., Rogers, J. C. A gibberellin response complex in cereal alpha-amylase gene pr....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

GUS 96 D HVA1 TaABF1

相关文章