表面增强拉曼散射闪烁现象的观察与分析

摘要

本方案描述了利用幂律分析单个分子在银表面上随机移动所导致的闪烁表面增强拉曼散射现象。

摘要

在银纳米团簇的结点处，从单个分子观测到闪烁的表面增强拉曼散射（SERS）。本文介绍了一种制备具有SERS活性的银纳米团簇、记录显微图像中特定闪烁点的视频以及分析闪烁统计特性的实验方案。在该分析中，亮态事件持续时间的概率分布可用幂律函数拟合。暗态事件的概率分布则通过幂律与指数函数的组合进行拟合。幂律参数反映了分子在亮态和暗态下的行为特征。此外，可据此估算分子的随机行走模型及其在整块银表面的运动速度。然而，即使采用平均值、自相关函数以及超分辨SERS成像方法，准确估算仍具有挑战性。未来应将幂律分析与光谱成像相结合，因为仅靠该分析方法尚无法确认闪烁现象的起源。

引言

表面增强拉曼散射（SERS）是一种基于贵金属表面的高灵敏度拉曼光谱技术。由于拉曼光谱能够根据分子中官能团振动模式产生的尖锐峰位提供详细的分子结构信息，因此可通过SERS研究吸附在金属表面上的单个分子的信息^1,2,3。在单分子水平下，当吸附质位于银纳米聚集体上时，可观察到闪烁信号^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,}

方案

1. 样品制备

1. 银胶体纳米颗粒的制备²⁰
   1. 为制备银胶体纳米颗粒，将0.030 g硝酸银和0.030 g二水合柠檬酸三钠溶解于200 mL圆底烧瓶中的150 mL水中。
   2. 将烧瓶与回流（Dimroth）冷凝器连接。
   3. 使用磁力搅拌器和搅拌子搅拌烧瓶中的溶液，然后将烧瓶置于油浴中，在150 °C下加热搅拌60分钟。
      注意：溶液颜色将先变为黄色，随后变为乳灰色。
   4. 将悬浮液在室温下冷却，并用铝箔覆盖烧瓶后置于冰箱中保存。
      注意：本实验步骤可在此处暂停。胶体纳米颗粒在冰箱中储存后，需在一个月内使用。
2. 多色闪烁发射样品的制备¹¹
   1. 为准备显微镜载玻片，用手以肥皂清洗玻璃片，并用水冲洗干净。
   2. 向玻璃片上加入0.1%聚-L-赖氨酸水溶液，然后用吹风机吹去溶液。
   3. 向玻璃片上加入银胶体悬浮液，然后用吹风机吹去悬浮液。
   4. 使用液体阻断笔在玻璃片上圈出液滴区域。
   5. 在玻璃片上滴加蒸馏水，并用另一片玻璃片覆盖，形成显微镜载玻片，以防止水分蒸发。

结果

由1.2方案制备的聚-L-赖氨酸修饰的银纳米聚集体中，可观察到表面增强拉曼散射（SERS）和表面增强荧光产生的多色闪烁斑点，如图1¹¹所示。相比之下，由1.3方案制备的含染料分子的银纳米聚集体仅观察到单一颜色的SERS闪烁斑点^7,8,9,10。存在两类“阴性”结果：连续发光的结果，或未观察到SERS的结果。前者和后者可能分别由胶体银表面分子浓度过高或过低所致。

单个银纳米聚集体在不同时刻显示出不同的信号强度，如图2B<.......

讨论

表面增强拉曼散射（SERS）来自银纳米聚集体的连接处。因此，我们需要制备纳米聚集体，而非被柠檬酸根阴离子覆盖的胶体纳米颗粒。银聚集体是通过添加聚-L-赖氨酸所引起的盐析效应形成的，聚-L-赖氨酸带有-NH₃⁺，是SERS信号的来源；或者也可通过NaCl提供的Na⁺阳离子诱导形成，如补充材料中的图S2所示。此外，为了照亮大范围内的多个位点，激光束以相对于样品表面30°的角度，通过一个未连接至显微镜的透镜进行非聚焦照射。这种方法可能导致观察区域未被充分照亮。我们通过调节并移动激光照射区域，以高倍率照亮目标观察区域。经过此优化后，可在同色背景中观察到颜色单一的亮点。这些步骤对于实现SERS闪烁现象的观察至关重要。

此处将讨论幂律分析中需注意的事项。首先，用于定义亮态与暗态事件的阈值会影响闪烁分析。当阈值提高时，幂律指数与截断时间往往也随之增加。^4,5,.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硝酸银，99.8%	Wako	194-00832
柠檬酸三钠二水合物，99.%	Wako	191-01785
聚-L-赖氨酸水溶液，0.1%	Sigma-Aldrich	P8920
3,3'-二磺丙基硫菁三乙胺盐	林原生物化学研究所	NK-2703	一种硫菁染料
3,3'-二乙基-5,5'-二氯-9-甲基硫碳菁碘化物	林原生物化学研究所	SMP-9	一种硫碳菁染料
氯化钠，99.5%	Wako	191-01665
Dimroth 冷凝管	Iwaki	61-9722-22	购自 AS ONE
磁力搅拌器	Corning	DC-420D
油浴锅	Advantech	OS-220
玻璃载片	Matsunami	S-1112	显微镜载玻片
吹气器	Hozan	Z-288	空气除尘器
液体阻断笔	大同产业		LIQUID BLOCKER（Super Pap Pen）。即用型疏水屏障笔，专为免疫组织化学应用设计
倒置显微镜	Olympus	IX-70
物镜	Olympus	LCPlanFl 60×	NA 0.7
暗场聚光镜	Olympus	U-DCD	NA 0.8–0.92
制冷数字CCD相机	Hamamatsu	ORCA-AG	由Aqua Cosmos软件控制
制冷数字CCD相机配套软件	Hamamatsu	AquaCosmos	也用于从视频中闪烁斑点提取时间轨迹
彩色CCD相机	ELMO	TNC-C920	不用于分析
DPSS激光器	RGB激光系统	NovaPro532-75	λ = 532 nm; 60 mW（对应功率密度为600 W/cm²）
干涉滤光片	Semrock	LL01-532-12.5
长通滤光片	Semrock	BLP01-532R-25
用于区分和计数亮/暗事件的软件	自制		使用C++编程开发
用于幂律拟合的软件	LightStone	Origin6.1