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方法文章

表面增强拉曼散射闪烁现象的观察与分析

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DOI：

10.3791/56729

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2018年1月11日

1Department of Chemistry, Kwansei Gakuin University

本文内容

摘要

本方案描述了利用幂律分析单个分子在银表面上随机移动所导致的闪烁表面增强拉曼散射现象。

摘要

在银纳米团簇的结点处，从单个分子观测到闪烁的表面增强拉曼散射（SERS）。本文介绍了一种制备具有SERS活性的银纳米团簇、记录显微图像中特定闪烁点的视频以及分析闪烁统计特性的实验方案。在该分析中，亮态事件持续时间的概率分布可用幂律函数拟合。暗态事件的概率分布则通过幂律与指数函数的组合进行拟合。幂律参数反映了分子在亮态和暗态下的行为特征。此外，可据此估算分子的随机行走模型及其在整块银表面的运动速度。然而，即使采用平均值、自相关函数以及超分辨SERS成像方法，准确估算仍具有挑战性。未来应将幂律分析与光谱成像相结合，因为仅靠该分析方法尚无法确认闪烁现象的起源。

引言

表面增强拉曼散射（SERS）是一种基于贵金属表面的高灵敏度拉曼光谱技术。由于拉曼光谱能够根据分子中官能团振动模式产生的尖锐峰位提供详细的分子结构信息，因此可通过SERS研究吸附在金属表面上的单个分子的信息1,2,3。在单分子水平下，当吸附质位于银纳米聚集体上时，可观察到闪烁信号1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16，同时光谱也会发生波动1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14。这种闪烁现象可能是由于单个分子在纳米尺度的银纳米聚集体结点处随机进出增强的电磁（EM）场而引起的。因此，与利用SERS强度的泊松分布或双分析物方法相比，闪烁被视为单分子检测的更直接证据2,3,17。然而，关于闪烁及光谱波动的详细机制——这些机制可能强烈依赖于分子在Ag表面的行为——目前仍存在争议。

在以往的研究中，人们利用自相关函数分析闪烁表面增强拉曼散射（SERS）现象，该函数可计算分子在增强电磁场中进出运动的扩散系数和浓度12,13,14。此外，还从信号的时间轮廓中推导出一种归一化的标准差评分，用于表征总强度的不稳定性15。然而，这些分析方法可能仅基于少数分子的行为。相比之下，在闪烁SERS的超分辨率成像中，可以识别单个分子在增强电磁场中的行为16。但这些技术仅能在增强电磁场内获取相关参数。单个分子在较大范围内的随机行为（例如在闪烁SERS中）可用幂律而非平均值来描述4,5,6,7,8,9,10,11，这类似于单个半导体量子点（QD）产生的闪烁荧光现象18,19。通过采用幂律分析方法4,5,6,7,8,9,10,11，可估算分子在亮态（即处于增强电磁场中）和暗态下的行为10；也就是说，可以估算分子在整个银表面的行为特征。

该技术使用银胶体纳米聚集体4,5,6,7,8,9,10,11。这些纳米聚集体表现出多种局域表面等离子体共振（LSPR）谱带，当在特定波长激发时，会显著影响增强的电磁场。因此，具有表面增强拉曼散射（SERS）活性的银纳米粒子以胶体悬浮液形式存在，可立即获得部分数据。对于具有特定尺寸、形状和排列的简单纳米结构，SERS闪烁现象对LSPR的依赖性可能掩盖其他依赖关系7；即，若所用纳米结构对LSPR响应良好或不良，则相关参数保持恒定，从而导致其他依赖性被掩盖。已有研究采用幂律分析方法，揭示了银胶体纳米聚集体SERS闪烁现象的多种依赖关系4,5,6,7,8,9,10,11。

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方案

1. 样品制备

  1. 银胶体纳米颗粒的制备20
    1. 为制备银胶体纳米颗粒，将0.030 g硝酸银和0.030 g二水合柠檬酸三钠溶解于200 mL圆底烧瓶中的150 mL水中。
    2. 将烧瓶与回流（Dimroth）冷凝器连接。
    3. 使用磁力搅拌器和搅拌子搅拌烧瓶中的溶液，然后将烧瓶置于油浴中，在150 °C下加热搅拌60分钟。
      注意：溶液颜色将先变为黄色，随后变为乳灰色。
    4. 将悬浮液在室温下冷却，并用铝箔覆盖烧瓶后置于冰箱中保存。
      注意：本实验步骤可在此处暂停。胶体纳米颗粒在冰箱中储存后，需在一个月内使用。
  2. 多色闪烁发射样品的制备11
    1. 为准备显微镜载玻片，用手以肥皂清洗玻璃片，并用水冲洗干净。
    2. 向玻璃片上加入0.1%聚-L-赖氨酸水溶液，然后用吹风机吹去溶液。
    3. 向玻璃片上加入银胶体悬浮液，然后用吹风机吹去悬浮液。
    4. 使用液体阻断笔在玻璃片上圈出液滴区域。
    5. 在玻璃片上滴加蒸馏水，并用另一片玻璃片覆盖，形成显微镜载玻片，以防止水分蒸发。
  3. 单色闪烁SERS样品的制备7,8,9,10
    1. 为准备显微镜载玻片，用手以肥皂清洗玻璃片，并用水冲洗干净。
    2. 按体积比2:1:1混合银胶体悬浮液、噻菁或硫羰菁染料（浓度分别为25或4 µM）以及NaCl（10 mM）水溶液。
    3. 将样品悬浮液滴加到玻璃片上，然后用吹风机吹去悬浮液。
    4. 使用液体阻断笔在玻璃片上圈出液滴区域。
    5. 在玻璃片上滴加NaCl（1 M）水溶液，以固定银纳米颗粒，并用另一片玻璃片覆盖，形成显微镜载玻片，防止溶液蒸发。

2. 观察闪烁的银纳米颗粒

  1. 样品照明
    1. 将使用方案1.2或1.3制备的样品玻片放置在倒置显微镜的载物台上。
    2. 通过暗场聚光镜使用白光照射样品玻片，并使用物镜（60倍）聚焦玻片上不同颜色的斑点（蓝色、绿色、黄色和红色）。
    3. 通过干涉滤光片，将二极管泵浦固态（DPSS）连续波（cw）激光器发出的衰减光束以相对于样品表面30°的角度照射到样品玻片上。
    4. 为利用激光照明观察银纳米聚集体在同色背景中呈现为单一颜色斑点的现象，将激光照射区域移至视野中心，并通过调节载物台的z方向对准玻片上的斑点进行聚焦。
  2. 闪烁现象的观察
    1. 在物镜后插入一个长通滤光片，并通过干涉滤光片将二极管泵浦固态（DPSS）连续波（cw）激光束以相对于样品表面30°的角度照射样品玻片。
    2. 通过在x和y方向移动载物台，找到如图1所示的闪烁斑点（另见补充材料中的图S1）。
    3. 使用与冷却式数字电荷耦合器件（CCD）相机连接的倒置显微镜记录闪烁斑点的视频，该相机的时间分辨率为61–120 ms，记录时长为20分钟。

3. 闪烁SERS分析

  1. 从视频中提取时间曲线
    1. 在控制CCD相机的软件中，打开视频文件。
    2. 选择闪烁的斑点和暗区时，拖动视频图像中的区域，分别覆盖有斑点和无斑点的区域。
    3. 为了从视频中的闪烁斑点和暗区提取信号强度随时间变化的曲线，选择 时间分析 在 分析，然后单击 计算 在 时间分析 窗口
    4. 将数据保存为文本文件。
  2. 时间过程分析
    1. 通过减去暗区的时间曲线和/或使用多项式函数拟合来平展时间曲线的基线，如图所示 图2A 和 2B.
    2. 评估由约 2000 个点组成的平均基线强度， I基部以及基线强度的标准差， σ, 如图所示 图2C 和 二维.
    3. 通过设定高于阈值的强度来区分亮事件与暗事件 I基底 + 3σ, 并记录每个事件的持续时间。在 图3，例如，将 0 到 3.5476 秒的时间段记录为暗事件（持续时间为 t = 3.5476 秒），并记录从 3.5476 到 4.0981 秒的事件为亮事件（持续时间为 t = 0.5505 s）。重复上述操作步骤，如图所示。 表1.
    4. 统计每种持续时间的明亮事件和暗事件的数量，如第一行和第二行所示 表 2.
    5. 将每个持续时间的事件数相加，但持续时间短于该时长的事件除外 t如第二行和第三行所示 表2，例如，对每个持续时间（除特定事件外）的事件数量进行求和 t = 0.0612 秒）作为 41 + 18 + 9 + …；结果等于以下各项的总和 t = 0.1223 s, 即 103.
    6. 将各总和除以相应的持续时间，并进行归一化处理。如式中所示 表2，例如，按持续时间划分求和 t 将 0.0612 s 除以持续时间 0.0612 s，结果为 3,351.5791。然后，将该结果除以第四行中所有结果的总和 表2概率分布被推导为0.64494。
    7. 绘制亮事件的概率分布图 P在(t）与其持续时间的关系 t 在对数-对数图中，拟合 Log10P在(t) 由 Log10(figure-protocol-1) 以推导幂律指数 α在 针对特定的闪烁点。如果 P在(t）通过拟合得到 figure-protocol-2，拟合直线在较小数值处偏离了散点图 P开启(t，如虚线所示 图4A.
    8. 绘制暗事件的概率分布 P关闭(t）与其持续时间的关系 t 在对数-对数图中，拟合 Log10P关闭(t) 由 Log10(figure-protocol-3 推导幂律指数 α关闭 和截断时间 τ 来自同一闪烁点。 如果 P关闭(t）通过拟合得到 figure-protocol-4，拟合曲线在较小值处偏离了数据点 P关闭(t).
    9. 对视频中的其他闪烁点重复步骤 3.2.1 至 3.2.8。

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结果

由1.2方案制备的聚-L-赖氨酸修饰的银纳米聚集体中，可观察到表面增强拉曼散射（SERS）和表面增强荧光产生的多色闪烁斑点，如图111所示。相比之下，由1.3方案制备的含染料分子的银纳米聚集体仅观察到单一颜色的SERS闪烁斑点7,8,9,10。存在两类“阴性”结果：连续发光的结果，或未观察到SERS的结果。前者和后者可能分别由胶体银表面分子浓度过高或过低所致。

单个银纳米聚集体在不同时刻显示出不同的信号强度，如图2B<...

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讨论

表面增强拉曼散射（SERS）来自银纳米聚集体的连接处。因此，我们需要制备纳米聚集体，而非被柠檬酸根阴离子覆盖的胶体纳米颗粒。银聚集体是通过添加聚-L-赖氨酸所引起的盐析效应形成的，聚-L-赖氨酸带有-NH3+，是SERS信号的来源；或者也可通过NaCl提供的Na+阳离子诱导形成，如补充材料中的图S2所示。此外，为了照亮大范围内的多个位点，激光束以相对于样品表面30°的角度，通过一个未连接至显微镜的透镜进行非聚焦照射。这种方法可能导致观察区域未被充分照亮。我们通过调节并移动激光照射区域，以高倍率照亮目标观察区域。经过此优化后，可在同色背景中观察到颜色单一的亮点。这些步骤对于实现SERS闪烁现象的观察至关重要。

此处将讨论幂律分析中需注意的事项。首先，用于定义亮态与暗态事件的阈值会影响闪烁分析。当阈值提高时，幂律指数与截断时间往往也随之增加。4,5,...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢关西学院大学的 Y. Ozaki 教授和日本产业技术综合研究所的 T. Itoh 博士对本工作的有益讨论。本工作得到了日本文部科学省科学研究费补助金（科学研究C类，编号16K05671）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
硝酸银，99.8%Wako194-00832
柠檬酸三钠二水合物，99.%Wako191-01785
聚-L-赖氨酸水溶液，0.1%Sigma-AldrichP8920
3,3'-二磺丙基硫菁三乙胺盐林原生物化学研究所NK-2703一种硫菁染料
3,3'-二乙基-5,5'-二氯-9-甲基硫碳菁碘化物林原生物化学研究所SMP-9一种硫碳菁染料
氯化钠，99.5%Wako191-01665
Dimroth 冷凝管Iwaki61-9722-22购自 AS ONE
磁力搅拌器CorningDC-420D
油浴锅AdvantechOS-220
玻璃载片MatsunamiS-1112显微镜载玻片
吹气器HozanZ-288空气除尘器
液体阻断笔大同产业LIQUID BLOCKER（Super Pap Pen）。即用型疏水屏障笔，专为免疫组织化学应用设计
倒置显微镜OlympusIX-70
物镜OlympusLCPlanFl 60×NA 0.7
暗场聚光镜OlympusU-DCDNA 0.8–0.92
制冷数字CCD相机HamamatsuORCA-AG由Aqua Cosmos软件控制
制冷数字CCD相机配套软件HamamatsuAquaCosmos也用于从视频中闪烁斑点提取时间轨迹 
彩色CCD相机ELMOTNC-C920不用于分析
DPSS激光器RGB激光系统NovaPro532-75λ = 532 nm;
60 mW（对应功率密度为600 W/cm²）
干涉滤光片SemrockLL01-532-12.5
长通滤光片SemrockBLP01-532R-25
用于区分和计数亮/暗事件的软件自制使用C++编程开发
用于幂律拟合的软件LightStoneOrigin6.1

参考文献

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