确定环境中真菌多样性是职业健康研究中用于识别健康危害的一种方法。本方案描述了从职业空气样本中提取DNA，以扩增和测序真菌ITS区域的技术流程。该方法可检测到许多传统评估方法容易遗漏的真菌种类。
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摘要
摘要
在职业环境中，识别真菌暴露的传统方法（如培养法和基于显微镜的技术）存在多种局限性，导致许多真菌种类未能被检出。过去二十年来该领域的技术进步促使职业健康研究人员转向基于分子生物学的方法来识别真菌危害。这些方法已在室内及职业环境中检测出大量以往使用传统方法未能发现的真菌种类。本实验方案详细描述了一种通过基因组DNA提取、扩增、测序以及对真菌内转录间隔区（ITS）进行分类学鉴定，从而确定空气样本中真菌多样性的方法。ITS测序能够检出许多通过培养或显微镜方法难以发现或难以鉴定到种水平的真菌种类。尽管这些方法无法提供真菌负荷的定量数据，但为危害识别提供了新途径，可用于评估职业环境中真菌物种的整体丰富度和多样性。
引言
室内和职业环境中的真菌暴露可导致呼吸系统疾病，包括过敏致敏和哮喘1。识别真菌危害对于评估风险并预防工人暴露至关重要。这些真菌危害可能源于室内污染、室外空气侵入，或因环境扰动导致真菌物质被带入工人所在区域2。用于评估真菌暴露的方法包括可培养的培养采样以及通过显微镜鉴定真菌孢子。这些方法存在多种局限性，常常忽略许多可能对总体真菌负荷有贡献的真菌种类3。基于培养的方法仅能区分那些可在营养培养基上生长的可存活真菌生物。通过显微镜将真菌孢子鉴定到种水平时，可能因不同孢子具有相似形态而难以分辨。这两种方法均高度依赖真菌学家进行分析和鉴定，且许多孢子仍无法被准确识别。
为了改进现有职业危害识别和暴露评估所采用的方法，许多研究人员已转向基于分子的技术。基于测序的方法在评估室内及职业环境中微生物多样性时，相较于显微镜检查和可培养法等传统手段，能够揭示更广泛存在的真菌种类3,4,5。本文所述方法包括对职业环境中的空气进行采样，并提取基因组DNA，以识别潜在的真菌危害。通过测序真菌核糖体DNA内部转录间隔区（ITS）实现危害识别，该区域在不同真菌之间具有高度变异性，已被广泛用于区分真菌物种6,7,8,9。在职业环境中发现的许多物种，例如担子菌门（Basidiomycota）中的某些种类，无法通过可培养法鉴定，且在显微镜下也难以区分。这些真菌在通过ITS测序分析的室内及职业环境中已被观察到具有较高的相对丰度3,4,10。ITS测序技术显著加深了我们对室内及职业环境中真菌多样性的认识。
本文所述方案详细介绍了从生物气溶胶中采集、提取并扩增真菌ITS区域以进行测序分析的方法。该方法采用美国国家职业安全与健康研究所（National Institute for Occupational Safety and Health, NIOSH）开发的双级旋风式气溶胶采样器来收集空气中的颗粒物。该采样器专为采集生物气溶胶而设计，可将可吸入颗粒物（≤4 µm 空气动力学直径）与不可吸入颗粒物（>4 µm 空气动力学直径）分离，从而有助于识别室内环境中最可能被工作人员吸入的真菌生物11。市场上还存在其他类型的空气采样器，包括旋风式采样器，可通过滤膜收集处于可吸入粒径范围（<4 µm）的颗粒物12,13。相比之下，NIOSH双级旋风式气溶胶采样器可根据真菌的空气动力学直径将其分离至一次性聚丙烯管中，样品可直接用于后续实验操作14。
本方案详细介绍了基因组DNA提取及真菌ITS区域扩增的步骤。所采用的提取方法专为从真菌和细菌中提取基因组DNA而开发，因为许多商用试剂盒主要针对哺乳动物细胞、细菌或特定的酵母菌15。本研究选用的引物基于其对真菌ITS1和ITS2区域整体覆盖能力而确定4,5。对这些区域进行测序，可实现与大量已存储ITS序列的比对，包括仅测序ITS1区域、仅测序ITS2区域，或同时测序ITS1与ITS2区域的序列。采用这些方法分析室内空气样本所获得的结果显示，检测到大量属于子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）的序列，同时也发现了一些属于接合菌门（Zygomycota）等相对丰度较低的真菌门类的序列。传统危害识别方法（如培养法或显微镜检查）无法全面捕获通过本方法所识别出的真菌序列的广泛多样性。真菌ITS区域测序为识别真菌危害提供了更高效的方法，并有助于更深入理解室内及职业环境中的真菌暴露情况。
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方案
1. 准备NIOSH气溶胶采样器
注意：NIOSH 气溶胶采样器是一种双级旋风式气溶胶采样器，通过两根采样管和一个聚四氟乙烯（PTFE）滤膜来收集生物气溶胶。
- 组装前，请仔细检查采样器。检查采样器是否损坏，所有螺丝是否安装到位并拧紧，以及两个半壳接缝处的密封胶带是否完好。检查采样器的O型圈，确保其无缺口、裂纹或撕裂，并均匀涂抹极薄一层硅脂。
注意：采样器包含一个直径为37 mm、孔径为3 µm的聚四氟乙烯（PTFE）滤膜，安装在聚苯乙烯或聚丙烯材质的三件式滤膜盒中。- 通过将滤膜支撑垫（随滤膜提供）放置在底座网格面上来组装滤膜盒（见图1）。使用滤膜镊子将滤膜置于支撑垫上方，采集面朝上。
- 使用手动或气动压接机密封滤膜盒。手工闭合可能导致空气在滤膜周围泄漏，降低采集效率。插入环形部件（延伸护罩），并使用压接机将其均匀、紧密地压下，确保延伸护罩与滤膜紧密贴合，防止空气泄漏。
注意：采样过程中不使用滤膜盒的顶部盖片，但应在采样完成后将其保存并用于覆盖滤膜。 - 将组装好的滤膜盒安装到采样器顶部，并尽可能向下推紧。用一段19 mm（3/4英寸）胶带缠绕在滤膜盒和采样器外部，以固定滤膜盒并作为防止泄漏的备用密封。
- 将每根管子牢固且完全拧入采样器，直至完全旋紧，并在每根管子周围缠绕密封胶带，作为防止泄漏的第二道密封。
注意：第一根管子为15 mL聚丙烯管，用于收集空气动力学直径>4 µm的非可吸入颗粒物；第二根管子为1.5 mL聚丙烯微量离心管，用于收集1至4 µm的可吸入颗粒物；其余更小的颗粒物，即<1 µm的颗粒物，则被收集在PTFE滤膜上（见图2）。
- 每次使用前，应使用校准瓶对NIOSH采样器的气流进行校准，因为不同滤膜和采样器之间的差异会导致气流变化。
- 使用校准瓶时，将校准瓶的鲁尔接头插入滤膜盒顶部，将采样器放入校准瓶内，并密封瓶口。
- 将校准瓶连接至校准流量计和采样泵。打开流量计，预热几分钟。请注意，流量计的进气口必须始终连接滤膜，以避免污染流量计和采样器。
- 开启采样泵，运行几分钟以预热并稳定气流。
- 调节泵以设定正确的流量为3.5 L/min。
注意：NIOSH气溶胶采样器的流量通常设定为3.5 L/min。在此流量下，采样器符合ACGIH/ISO对可吸入颗粒物采样的标准16。若需要不同的切割粒径或降低噪音水平，也可使用其他流量，但需注意，若使用不同流量，采样器将不再符合可吸入颗粒物采样的标准。 - 校准完成后，关闭采样泵和流量计。
2. 静态与个体气溶胶采样
- 为个人采样或固定区域采样设置NIOSH气溶胶采样器。
注：固定采样指将气溶胶采样器安装在三脚架或其他固定装置上进行采样（见图3），而个人采样则是将采样器和泵安装在被测人员身上（见图4）。- 进行固定区域采样时，应将采样器尽可能靠近所研究的特定区域。避免将采样器置于空气入口、房间出入口或可能处于气流路径的位置。
注：即使在较短距离内，气溶胶浓度也可能存在显著差异，尤其是在房间内存在气溶胶源的情况下17。 - 进行个人采样时，应将采样器设置在人员的呼吸区范围内。将采样器固定在衣领、肩部或胸部，并将采样泵置于腰部或背囊中。
注：通常认为呼吸区是指围绕人员鼻部、半径为30 cm的半球形区域，吸入的大部分空气均来自该区域17。
- 进行固定区域采样时，应将采样器尽可能靠近所研究的特定区域。避免将采样器置于空气入口、房间出入口或可能处于气流路径的位置。
- 确保采样器管路远离采样器入口，且无任何物体遮挡入口或干扰进入采样器的气流。采样管路不得被挤压或弯折。任何堵塞均会导致泵停止运行。
- 开启采样泵。一至两分钟后，检查泵是否仍在正常运行。
注：根据环境不同，空气采样时间可从10分钟至完整的8小时工作班次不等10,18,19。图6所示结果代表在室内环境中进行60分钟采样的典型情况。 - 完成空气采样后，收集采样管和滤膜。撕下密封胶带，拧开采样管并盖上盖子。将滤膜盒的第三部分盖在滤膜上。将样品储存于4 °C，待后续处理时使用。
3. 从空气样本中提取基因组DNA
- 从NIOSH BC251采样器的每个阶段提取基因组DNA（gDNA）。分别处理空气采样收集管和滤膜，以便确定样品中可吸入和不可吸入的微生物气溶胶。
注意：如果样品接种量过小，也可将三个阶段合并后进行提取。- 在II级生物安全柜或层流洁净工作台中，无菌操作取出滤膜。用70%乙醇擦拭采样盒，使用采样盒开启工具撬开采样盒。使用滤膜提升器将滤膜及其支撑垫向上推出。用滤膜镊子夹取滤膜并放入无菌培养皿中。将滤膜切成6等份，放入含有300 mg玻璃珠（0.2 - 0.5 mm）的2 mL加强型离心管中。
- 将装有滤膜的离心管置于液氮中30秒，立即放入设定为4.5 m/s的珠磨均质仪中均质30秒。
- 重复步骤3.1.2一次或两次，直至滤膜被充分剪切破碎。可能会残留少量未完全破碎的滤膜碎片。加入0.5 mL裂解缓冲液（4 M尿素，200 mM Tris，20 mM NaCl，200 mM乙二胺四乙酸（EDTA），pH 7.4）。
- 向15 mL和1.5 mL空气采样管中各加入0.3 mL裂解缓冲液。将离心管直立涡旋10- 15秒，再倒置涡旋10-15秒。将每根管中的内容物转移至含有300 mg玻璃珠的2 mL加强型离心管中。
注意：大多数在采样管中收集的物质会聚集在管子顶部附近。 - 将所有离心管在珠磨均质仪中以4.5 m/s处理30秒，然后在22 °C下以20,000 × g离心1分钟。将上清液转移至无菌1.5 mL微量离心管中，并再次在22 °C下以20,000 × g离心1分钟。重复此步骤一次。
- 向每根离心管中加入30 µL裂解试剂（参见材料表），在37 °C孵育15分钟。
- 向每根离心管中加入0.2 mL结合缓冲液（10 M尿素，6 M盐酸胍，10 mM Tris-HCl，20% Triton X-100，pH 4.4）和蛋白酶K（100 µg/mL），在70 °C孵育10分钟。向每根离心管中加入100 µL异丙醇。
- 将提取液转移至置于2 mL收集管中的玻璃纤维滤膜管（容量700 µL），在22 °C下以20,000 × g离心30秒。弃去收集管，将滤膜管转移至新的2 mL收集管中。
- 向每根离心管中加入0.5 mL抑制物去除缓冲液（5 M盐酸胍，20 mM Tris-HCl，pH 6.6，38%乙醇），在22 °C下以20,000 × g离心30秒。弃去收集管，将滤膜管转移至新的2 mL收集管中。
- 向每根离心管中加入0.5 mL洗涤缓冲液（20 mM NaCl，2 mM Tris-HCl，pH 7.5，80%乙醇），在22 °C下以20,000 × g离心30秒。弃去收集管，将滤膜管转移至新的2 mL收集管中。重复该步骤一次。
- 在22 °C下以20,000 × g额外离心1分钟，以去除残留的洗涤缓冲液。弃去收集管，将滤膜管转移至新的收集管中。
- 向每根离心管中加入100 µL预热（≥70 °C）的洗脱缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.5），室温孵育1-2分钟。在22 °C下以20,000 × g离心30秒。将空的滤膜管转移至无菌1.5 mL微量离心管中，并将步骤3.8中的洗脱液重新加入。室温孵育1-2分钟，在22 °C下以20,000 × g离心30秒。
注意：洗脱液可立即用于步骤4，或在-20 °C保存至使用。基因组DNA可在-20 °C下保存长达一年。如需长期保存，建议将DNA储存在-80 °C。
4. 真菌核糖体DNA的扩增
- 使用通用真菌引物扩增提取的基因组DNA中的ITS1和ITS2区域。
注意：本实验方案采用引物对 Fun18Sf（5'-TTGCTCTTCAACGAGGAAT-3'）/ITS4R（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），以实现对 ITS 区域最广泛的覆盖4,5其他引物组合，例如仅扩增ITS1或ITS2区域的引物，也可使用。- 为每个样本设置三份平行的 50 µL 聚合酶链式反应（PCR），在无菌 0.5 mL PCR 管或 96 孔 PCR 板中进行，反应体系如下：5 µL 提取的模板 DNA（来自步骤 3），33.3 µL PCR 级水，5 µL 10x PCR 缓冲液，1.5 µL 50 mM MgCl2，1 µL 10 mM 2'-脱氧核苷-5'-三磷酸，0.5 µL 20 µM Fun18Sf 正向引物，0.5 µL 20 µM ITS4R 反向引物，以及 0.2 µL Taq DNA聚合酶
- 在热循环仪中进行反应：95 °C 变性 3 分钟；6 个循环的变性（96 °C，30 秒）、退火（50 °C，45 秒）和引物延伸（72 °C，3 分钟）；20 个循环的变性（96 °C，30 秒）、退火（50 °C，45 秒）和引物延伸（72 °C，1 分钟）；最后在 72 °C 延伸 10 分钟。反应完成后将反应体系置于 4 °C 保存，直至下一步操作。
- 将三份PCR反应产物合并，使用基于硅胶膜的纯化试剂盒进行纯化。
注意：该步骤可去除PCR组分（引物、dNTPs、酶、盐类） 等等.) 以及其他污染物从扩增的DNA样品中去除。- 将每个样本的三个反应液合并至无菌的1.5 mL微量离心管中（总体积150 µL）。加入5倍体积（750 µL）的结合缓冲液（5 M 盐酸胍，30% 异丙醇），并通过移液器上下吹打10次混匀溶液。
- 将450 µL混合物加入置于收集管中的离心柱中，在17,900 x g下离心30 s，弃去滤液。将剩余的450 µL加入离心柱中，在22 °C下于17,900 x g离心30 s。
注意：离心柱中含有硅胶膜，可使DNA吸附于柱上。 - 弃去滤液，向离心柱中加入750 µL洗涤缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5，80%乙醇）。在22 °C下，以17,900 x g离心30 s。
注意：此步骤可去除上述 PCR 反应中的污染物。 - 弃去滤液，将空柱在22 °C下以17,900 × g离心1分钟。
注意：此步骤旨在去除可能干扰后续应用的残留洗涤缓冲液。 - 将离心柱转移至无菌的1.5 mL微量离心管中。加入45 µL洗脱缓冲液（10 mM Tris-Cl，pH 8.5），在室温下孵育5分钟。于22 °C下以17,900 × g离心1分钟。
- 立即使用洗脱的DNA进行步骤4和5，或在-20 °C保存至使用时。
注意：扩增产物可在 -20 °C 保存长达一年。如需长期保存，建议将 DNA 储存在 -80 °C。
5. 使用琼脂糖凝胶电泳验证真菌ITS扩增
- 制备含有 1 µg/mL 溴化乙锭的 1% 琼脂糖凝胶。将琼脂糖溶于煮沸的 1x Tris-乙酸盐-EDTA (TAE) 缓冲液中。待溶液冷却至约 50 °C 时，加入溴化乙锭，并倒入凝胶模具中。
- 琼脂糖凝胶完全凝固后，将其浸入 1x TAE 缓冲液中，并准备待上样扩增产物。向 8 µL 扩增后的 DNA 中加入 2 µL 5x 上样缓冲液。
注意：这些体积可根据所需上样缓冲液的浓度进行调整。 - 将所有 10 µL 样品连同用于大小参照的 DNA Marker 一起上样至凝胶中。以 75 V（6 V/cm）电泳约 90 分钟，并在紫外光下观察条带，条带通常位于 750 至 1,000 个碱基对之间（见图 5）。
6. 真菌ITS区域的测序与分析
- 对提取的基因组DNA或扩增的真菌ITS区域进行测序，并使用当前适当的方法分析序列。
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结果
可通过测定空气中样本中每个操作分类单元（OTU）的克隆数量，利用相对丰度评估环境中物种的分布情况。图6 是一个Krona图，展示了室内环境在60分钟空气采样后经分类学定位的物种组成。可以看出，该环境中的真菌主要归属于两个主要真菌门——子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota），同时也包含接合菌门（Zygomycota）的物种（Rhizopus microsporus）。传统的评估方法倾向于检测子囊菌门物种，因为许多担子菌门物种无法培养，或无法通过显微镜方法进行区分。对真菌ITS区域进行测序可检测到多种真菌物种，特别是部分通常难以检出的担子菌门物种。对该环境的分析显示，所鉴定的真菌序列中有68%属于担子菌门，其中大部分归入多孔菌目（Polyporales）。
通过基于测序的方法获得的分类学数据可用于确定特定环境中的分类群多样性。多样性指数（如表1所...
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讨论
利用基于测序的方法确定职业环境中真菌多样性，已显著改善了真菌危害识别与暴露评估。该方法能够检测到许多使用培养法或显微镜检测法通常无法发现的额外真菌物种。本文介绍了一种从职业和室内环境中采集生物气溶胶样本，并从空气样本中提取基因组DNA以进行ITS扩增和测序的方法。采用这些方法测定真菌多样性高度依赖于以下三个因素：（1）成功且完整地从空气样本中提取基因组DNA；（2）使用能够将扩增的ITS序列与数据库中已知序列进行比对并减少扩增偏差的引物对基因组DNA进行扩增；（3）对数据库中的序列进行准确的分类学鉴定。
基因组DNA提取的成功与否取决于研究中所采用的提取方法和试剂。如本方案所述，NIOSH双级旋风采样器的管相中收集的大量生物气溶胶及其他生物性和非生物性颗粒物会聚集在采样管顶部。在加入裂解缓冲液时，必须小心打开采样管，以免损失任何颗粒物，并应以适当方式涡旋震荡，使所有颗粒物均落入裂解缓冲液中（先正置后倒置）。此外，在提取前处理滤膜时，必须采用无菌操作技术小心操作，以避免破坏其表面已收集的生物气溶胶或引入外源DNA污染。已有研究表明，市面上多种商用基因组DNA提取试剂盒之间存在显著差异...
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披露
本报告中的研究结果和结论仅代表作者观点，不一定代表美国国家职业安全与健康研究所、疾病控制与预防中心的官方立场。
致谢
本工作部分由美国国家职业安全卫生研究所（NIOSH）与美国国家环境卫生科学研究所（NIEHS）之间的机构间协议（AES12007001-1-0-6）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NIOSH BC251 生物气溶胶旋风采样器 | NIOSH | BC251 | NIOSH 采样器目前尚未商业化供应。如需获取该采样器的信息，请联系 William Lindsley 博士（wlindsley@cdc.gov） |
| Fisherbrand 带螺旋盖的无菌微量离心管 | Fisher Scientific | 02-681-373 | 用于空气采样的 1.5 mL 聚丙烯微量离心管；螺旋盖螺纹必须与 NIOSH 采样器的螺纹匹配 |
| Falcon 15 mL 圆锥形离心管 | Corning | 352096 | 用于空气采样的 15 mL 聚丙烯管 |
| 洁净室用乙烯基胶带，易剥离，1/4" 宽度 | McMaster-Carr | 76505A1 | 密封胶带 |
| 滤膜夹具，透明苯乙烯材质，37 mm | SKC Inc. | 225-3LF | 三件式采样夹具（不含滤膜）。包含：夹具底座、延长罩、夹具盖以及进出口塞 |
| PTFE 疏水性氟孔膜滤膜，3.0 µm，37 mm | EMD Millipore | FSLW03700 | 包含：37 mm、3.0 µm PTFE 滤膜和支持垫片 |
| Fisherbrand 滤膜镊 | Fisher Scientific | 09-753-50 | 滤膜镊 |
| Model 502 精密 PanaPress 压片机 | PanaVise | 502 | 气动夹具压片机由该精密台式压机改装而成 |
| Scotch Super 33+ 乙烯基电工胶带 | McMaster-Carr | 76455A21 | 19 mm 胶带 |
| 多功能校准罐，大号 | SKC Inc. | 225-112 | 校准罐 |
| Universal PCXR4 通用采样泵 | SKC Inc. | 224-PCXR4 | 采样泵 |
| Mass Flowmeter 4140 质量流量计 | TSI Inc. | 4140 | 流量计 |
| Roche 高纯度 PCR 模板试剂盒 | Roche Diagnostics | 11796828001 | 用于基因组 DNA 提取的试剂盒。包含：裂解缓冲液、结合缓冲液、蛋白酶 K、抑制剂去除缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、玻璃纤维滤管和 2 mL 收集管 |
| Fisherbrand 2 mL 加强型聚丙烯螺旋盖管（带盖） | Fisher Scientific | 15340162 | 用于珠磨均质的 2 mL 加强型管 |
| 玻璃珠，酸洗处理，212–300 µm | Sigma-Aldrich | G1277 | 玻璃珠 |
| Fisher Scientific Bead Mill 24 珠磨均质器 | Fisher Scientific | 15-340-163 | 珠磨均质器 |
| CelLytic B 细胞裂解试剂，10X | Sigma-Aldrich | C8740 | 裂解试剂 |
| Platinum Taq DNA 聚合酶 | Invitrogen | 10966-018 | 包含：Platinum Taq DNA 聚合酶、10X PCR 缓冲液（不含 MgCl₂）、50 mM MgCl₂、KB 延伸剂 |
| dNTP 混合液 | Invitrogen | 18427-088 | 10 mM dNTP 混合液 |
| QIAquick PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 28106 | 用于纯化真菌扩增子的试剂盒。包含：Buffer PB（结合缓冲液）、Buffer PE（洗涤缓冲液）、Buffer EB（洗脱缓冲液）、pH 指示染料（可选）以及 GelPilot 上样染料 |
| Owl EasyCast 小型凝胶电泳系统 | Thermo Fisher | B1 或 B2 | |
| TrackIt 1 KB Plus DNA Marker | Thermo Fisher | 10488-085 | DNA Marker |
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