漫反射光谱法：将毛细血管再充盈试验掌握于指下

摘要

本方案描述了如何利用漫散射偏振光谱技术提高毛细血管再充盈试验的临床实用性。我们建议在健康志愿者中，采用漫反射光谱视频结合新的信息学终点指标，对毛细血管再充盈过程进行更详细的分析。

摘要

毛细血管再充盈试验于1947年引入，用于协助评估危重患者的循环状态。指南通常规定，在施加5秒的坚定压力后，再充盈时间应在2秒内完成例如在正常健康的仰卧患者中，由医生手指按压所致）。 refill 时间减慢提示皮肤灌注不良，可能由脓毒症、失血、低灌注和低体温等情况引起。自该测试引入以来，其临床实用性一直存在争议。支持者指出该测试具有可行性和简便性，并认为其能够在心率等生命体征发生变化之前更早地反映血管状态的改变。而反对者则强调，由于测试操作缺乏标准化、肉眼评估具有高度主观性，且测试结果易受环境因素影响，显著降低了其临床价值。本研究旨在详细描述毛细血管再充盈过程的动态变化，并利用漫反射偏振光谱技术，提出可能更为客观和精确的毛细血管再充盈测试终点值。

引言

对危重患者的评估与分诊主要依据经典的生命体征，包括血压（BP）、心率（HR）、呼吸频率（RR）、血氧饱和度和体温¹。这些参数的变化在循环功能恶化过程中出现相对较晚。例如，在出血情况下，直到失血量达到中度至重度时，血压才会下降²，而心率升高也可能是一个不敏感且非特异性的指标³。

毛细血管再充盈试验（CR试验）可能更早地提示循环衰竭的早期迹象，因为再充盈时间的变化被认为早于生命体征以及皮肤发冷、湿冷和花斑等临床表现^1,4,5。毛细血管再充盈试验通常通过在皮肤上施加并随后释放一个有力的致苍白压力，然后计时（以秒为单位）被压白区域血液恢复的时间。根据指南，在正常健康仰卧患者中，施加5秒的有力压力（例如，由医生手指施加）后，再充盈应在2秒内完成⁶。该试验的原理是，再充盈时间延长提示皮肤灌注不良，可能由多种危急情况引起，如脓毒症、失血、急性心力衰竭或低体温。

目前，关于如何执行毛细血管再充盈（CR）试验，尚无公认的最佳方法^6,7,8,9,10。争议性问题包括实际按压操作缺乏标准化，以及对再充盈终点的判断依赖于主观（即，肉眼）评估^7,9,11。此外，有迹象表明性别会影响CR时间^12,13。环境温度和皮肤温度均已被知会影响毛细血管再充盈时间，但其影响程度尚不明确。最后，测量部位的不同（外周或中心部位）可能是导致结果变异的另一因素，而该领域的相关研究较少^14,15。

在本研究中，我们采用一种光学生物工程系统来记录毛细血管再充盈（CR）试验期间血液回流的过程以及随后出现的充血反应。该系统利用漫反射偏振光谱技术，能够比肉眼观察更详细地量化和描述毛细血管再充盈的时间进程和动态变化。该系统由一台标准数码相机、一个带有92个白色LED的外置环形光源以及专门开发的软件组成。镜头前安装有两个正交排列的偏振滤光片，可阻挡直接从皮肤表面反射的光线，仅允许在组织内发生去偏振的光进入相机，从而生成深度约为0.5 mm的“"皮下层"”组织图像。图像被分解为不同的颜色通道，并计算每个像素的红色和绿色成分，由此得出一个与组织中红细胞浓度相对应的数值¹⁶。在视频模式下，该系统的时间分辨率为0.02 s。

方案

本研究遵循当地伦理准则，并已获得林雪平地区伦理审查委员会的批准（许可编号 2015/99-31）。

1. 知情同意与筛选

1. 从受试者处获得知情同意。
2. 根据纳入/排除标准进行筛选。
   注意：纳入标准为：（i）健康成年人 >18 周岁，（ii）能够理解书面和口头信息，（iii）提供口头和书面知情同意。排除标准为：（i）无法或不愿提供知情同意，（ii）存在活动性皮肤疾病，（iii）心血管疾病 （iv）可能干扰血管功能的药物。允许使用口服避孕药。若受试者使用口服避孕药，应在受试者试验方案文件中注明。 （v）前额无瘢痕、无瘀伤的皮肤， （vi）测试开始前2小时内不得摄入咖啡因或烟草，且 （vii）测试开始前至少2小时内禁止剧烈体力活动。

2. 驯化与设备设置

1. 在测试开始前，让受试者以仰卧位静置至少 20 分钟以适应环境。
   注意：受试者和设备的正确摆放位置见补充图 1。
2. 使用指定软件和数码相机设置毛细血管再充盈测试的录像（参见材料表）。
   1. 将 USB 线连接至相机和计算机，并将相机设置调整为视频模式。
   2. 打开相机，确保其已与计算机成功连接。
   3. 启动远程控制相机软件（参见 材料表）。
   4. 关闭环境光，并将计算机屏幕转向远离测量区域的方向。

3. 数据采集

1. 点击 "life view" (原文如此) 按钮，然后按 "Start"。
2. 通过点击单选按钮在“video”模式和“TiVi”模式之间切换（此操作仅影响屏幕显示，不影响录制）。确保受试者前额的实时视频流在相机显示屏和计算机屏幕上均可见。
3. 将相机调整至受试者前额正上方约15 cm的高度。
4. 确保相机对焦模式设置为 "AF"（自动对焦）。
5. 要求受试者在整个测试过程中保持头部静止，不要说话。告知受试者如果觉得光线太亮，可以闭上眼睛，具体说明如下："请将头部放在这个枕头上，并在整个测试过程中保持头部不动。测试将持续20秒，请在此期间不要说话。如果觉得光线太亮，您可以全程闭上眼睛"。
6. 录制过程中请勿移动相机。
7. 在 "life view" 窗口中找到并点击 "HD record"，开始持续20秒的录制。注意，录制时长（秒）可在相机显示屏上查看；前5秒用于获取前额正常的毛细血管血流浓度。
8. 在完成5秒基线记录后，对测量区域施加牢固的压迫以使其变白，持续5秒。使用食指，并在手指与前额之间放置一个塑料小勺，以实现压力均衡和温度隔离。
9. 松开压力，并迅速将检查者的手指和塑料小勺从测量区域移开。
10. 继续录制10秒，以捕捉随后的充血反应。
11. 在 "life view" 窗口中点击 "Stop" 以停止录制。
12. 录制停止后，将弹出窗口用于保存和命名文件（格式为 .mov）；选择一个文件夹并为视频命名。在视频下载到计算机指定文件夹期间，请勿断开相机与计算机的连接。

4. 数据分析

1. 使用专用分析软件进行图像分析和曲线构建（参见 材料表).
2. 双击桌面图标以启动分析软件。
3. 软件启动后，在主屏幕上选择 "视频页面。"
4. 在 "视频页面" 窗口，单击 "加载视频。等待软件上传并分析视频，根据视频文件的大小，此过程可能需要几分钟时间。
5. 一旦视频的上传和分析完成，点击 "保存为图像" 等待软件分析视频。
   注意：这将在计算机上自动创建一个新文件夹，其中包含已分割为单个 jpeg 图像的视频序列。
6. 视频分割为单个 jpeg 图像完成后，查找并选择 "作物图像页面" 在主屏幕窗口中。
7. 在 "作物图像页面"，点击 "首张照片" 导航至包含视频中提取的 JPEG 照片的文件夹，选择首张待分析的照片；软件将自动选中该批次中的后续照片。
8. 点击 "编辑" 菜单中选择圆形或矩形标记作为感兴趣区域。
9. 在 "选择照片" 窗口，查找 "实际照片" 框中输入该批次中研究者手指完全从测量区域移开时的第一张照片名称。为找到此照片，请浏览包含视频中各单独照片的文件夹。
10. 通过单击并按住鼠标左键，在照片窗口中选择一个位于褪色区域边界内的区域，并绘制一个圆形或矩形作为感兴趣区域。所选的感兴趣区域将自动应用于该批次的所有照片。
11. 点击 "文件" 菜单并选择 "保存感兴趣区域" 以保存所选感兴趣区域的位置，供日后参考。
12. 点击 "曲线追踪器" 按钮，并等待软件分析感兴趣区域。
13. 曲线追踪窗口打开后，测试期间所选感兴趣区域的红细胞浓度变化将以曲线形式显示。通过点击不同的单选按钮可更改屏幕上的显示方式，但这不会影响原始数据。
14. 点击 "导出数据" 并保存原始数据转录文件以供进一步分析。
15. 在原始数据转录文件中，导航至名为 "平均强度 TiVi 值。”在此列旁生成三个新列 "图像编号，“总时间，”和 "毛细血管再充盈时间" 起始时间分别为 1 s、0 s 和 0 s，时间增量分别为 1 s、0.02 s 和 0.02 s。
    注意： "毛细血管再充盈时间" 与随后反应的时间相关，该时间始于代表研究者手指完全从测量区域移开时的第一张照片的平均值，此时已解除压迫性苍白的压力。
16. 删除基线与毛细血管再充盈时间之间的数值，因为这些数值仅包含在按压操作过程中由研究者食指和塑料茶匙产生的噪声。
17. 计算基线测量值的平均值（记录的前5秒）。
18. 找到第一个等于或超过计算所得的平均基线值的数据点，并记录该时间点 "毛细血管再充盈时间" 柱。此时间点代表 "恢复至基线所需时间 1."
19. 找到压力释放后生成的值中的最高平均强度值，并记录该时间点 "毛细血管再充盈时间" 柱。此时间点代表 "达峰时间"
20. 找到第二个小于或等于基线测量计算均值的数值，并记录对应的时间点 "毛细血管再充盈时间" 柱。此时间点代表 "恢复至基线所需时间 2."

结果

记录毛细血管再充盈过程可产生大量无法通过肉眼评估获得的数据。本文提出若干新终点指标，以进一步提升毛细血管再充盈（CR）试验作为循环状态恶化早期指标的实用性。我们将这些终点指标命名为：“基线值”（Baseline）、“血流零点”（Blood Zero，简称“BZ”）、“恢复至基线值时间1”（Time to Return to Baseline 1，简称“tRtB1”）以及“达峰时间”（Time to Peak，简称“Tpk”）。“基线值”是通过计算基线期5秒内所有测量值的平均值得出。“血流零点”是指压力解除后，苍白区域首张图像所获得的平均值。“tRtB1”的定义为：解除压迫后，直至苍白区域的测量值等于或超过“基线值”所需的时间（单位为秒）。“Tpk”对应于记录到最高值的时间点。图1展示了在室温条件下对一名健康男性志愿者前额进行测试时所获取的部分常规照片及颜色编码图像。图2显示了上述同一测试中典型的毛细血管再充盈试验曲线。图中所示测试的测量时长为3分钟，该时...

讨论

为了获得系统的最佳结果，必须控制由环境因素引起的变异。所有环境光必须关闭。相机必须与测量区域保持垂直对齐。为确保测量区域恒定，受试者在测量过程中不应移动或说话。出于同样原因，建议将相机安装在支架上，以避免移动并保持与测量区域的距离恒定。受试者在测试前至少两小时内应避免摄入咖啡因¹⁷、烟草¹⁸以及剧烈运动¹⁹，并在测量开始前静息20分钟，因为这些因素已知会影响微循环。受试者应取仰卧位，使测量部位与心脏处于同一水平，以避免血容量的位置性再分布。应监测室温和皮肤温度，因为温度已知会影响再充盈时间^20,21。

除肉眼评估和本文介绍的技术外，还有其他生物工程学方法可用于测量毛细血管再充盈（CR）试验。大多数此类技术利用皮肤反射后的偏振光或非偏振光的变化^22,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
TiVi701 相机	WheelsBridge AB	TiVi701 Camera, version 1.5.1	软件
TiVi700	WheelsBridge AB	TiVi700 Analysis, version 1.2.9	软件
佳能 EOS 700D	Canon U.S.A., inc.	Canon EOS 700D	数码单反相机
相机支架	Manfrotto	681B	经改装的相机支架，用于固定数码相机位置
相机支架	Disa Denmark	9020B	经改装的相机支架，用于固定数码相机位置