一种高效的方法 体外 通过转录调控的睡美人系统介导的转座方法——该系统被包装至整合缺陷型慢病毒载体中

摘要

本方案描述了一种通过转录调控实现目的基因在人类基因组中稳定整合的方法 睡美人 系统。缺陷型慢病毒载体整合的制备 体外 报告了人类细胞的转导以及对转导细胞的分子检测。

摘要

的 睡美人 （SB）转座子是一种非病毒整合系统，在基因转移和功能基因组学中已证明具有显著功效。为优化SB转座子系统，本研究采用转录调控的高活性转座酶（SB100X）和基于T2的转座子。通常，转座酶和转座子通过质粒转染瞬时提供，SB100X的表达由组成型启动子驱动。本文描述了一种高效递送SB组分至对多种物理和化学转染方法具有抗性的哺乳动物细胞的方法，可调控SB100X的表达，并实现目的基因（GOI）的稳定整合 "剪切并粘贴" SB 机制。高活性转座酶的表达由 Tet-ON 系统严格调控，该系统自1992年以来被广泛用于控制基因表达。目的基因两侧为 T2 转座子的反向重复序列（IR）。SB 的两个组分均被包装至整合缺陷型慢病毒载体中，这些载体在 HEK293T 细胞中瞬时产生。人类细胞，包括细胞系或来自人体组织的原代细胞， 体外 使用病毒载体进行瞬时转导。当在培养基中加入多西环素（dox，四环素类似物）后，可精确调控转座酶的表达水平，从而实现目的基因在受处理细胞基因组中的长期稳定整合。该方法高效，适用于细胞系（如 HeLa 细胞）和原代细胞（如人原代角质形成细胞），因此是基因工程和治疗性基因转移的重要工具。

引言

超活性SB100X转座酶与基于T2的转座子联用已应用于临床前基因治疗^1,2,3、基因组修饰^4,5以及诱导性多能干细胞（iPSC）重编程^6,7。通常，SB组分通过质粒转染瞬时提供，并由强组成型启动子驱动转座酶的表达。然而，尽管转染技术已有改进，该双组分系统的递送在许多应用中仍具挑战性，因此开发新的递送方案日益受到关注。除质粒⁸和mRNA⁹的转染方法外，过去还提出了基于腺病毒^10,11、腺相关病毒（AAV）¹²、杆状病毒¹³、γ-逆转录病毒¹⁴和慢病毒载体¹⁵的病毒递送方法。值得注意的是，所选系统必须确保SB组分的瞬时递....

方案

1. 使用的质粒

注意：质粒 pCCL-PGKrtTA2^S-M2 由意大利摩德纳和雷焦艾米利亚大学（摩德纳）的 Zappavigna 教授惠赠。携带高活性转座酶编码序列 的 pCMVSB100X 质粒和 pT2/BH 转座子质粒分别由德国朗根保罗·埃尔利希研究所的 Ivics Z. 教授和德国柏林马克斯·德尔布吕克分子医学中心的 Izvak Z. 教授惠赠。

1. 在大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）中进行所有克隆操作时，应遵循所选的克隆策略，并采用限制性内切酶方法或对需克隆的片段进行PCR扩增。
   注意：表1汇总了本实验方案中使用的所有质粒，每个质粒均提供了相应的描述和参考文献。

2. 病毒载体生产

注意：根据机构的规章制度，所有病毒载体均在生物安全二级（BSL2）防护级别的生物危害通风柜中制备。

1. 在添加了10% HyClone血清、100 U/mL青霉素-链霉素和2 mM谷氨酰胺的杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）中培养贴壁的HEK293T细胞。
2. 第0天：为每种病毒制备准备五个15 cm培养皿....

结果

使用此处介绍的程序，可构建三种携带受调控SB组分（SB100X、rtTA2）的IDLV载体^S-M2 和 T2-GFP 转座子）被包装并用于在人细胞中高效递送并严格调控SB系统。 图1A 展示了一个方案 体外 转导HeLa细胞，该操作旨在评估两种IDLV载体以最佳剂量组合对SB转座酶的转录调控（已在报道中提及） 表 2）。通过qRT-PCR检测SB100X的转录调控图1B）并相对于关闭状态（IDLVTKSB单独处理，RQ=1）以相对定量（RQ）值表示。在转导的HeLa细胞中，加入多西环素（+dox）后SB100X的表达量达到背景水平（IDLVTKSB）的8倍激活效果。值得注意的是，在未添加多西环素的情况下共转导的HeLa细胞中，转座酶的表达水平与关闭状态相当，表明rtTA2对TetTK启动子具有严格的调控能力。^sM2 调节剂

讨论

本文介绍一种通过Sleeping Beauty介导的转座技术，将目的基因（GOI）稳定整合到靶细胞基因组中的广泛应用方法。尽管SB系统最初旨在提供一种非病毒的基因组编辑手段，但高效递送整合工具（转座酶和T2转座子）仍是必要前提。因此，近年来为在难以转染的原代细胞中应用SB系统，研究者采用了病毒载体递送SB组分^10,12,15。然而，迄今为止所使用的病毒载体均未解决转座酶持续表达的问题，而持续表达可能导致转座子不可控地再次跳跃，带来潜在风险。

为了转录调控转座酶的表达，我们采用了改良的Tet-ON系统¹⁶。在多西环素（dox）存在的情况下，rtTA2^s-M2调节因子与融合了TetO元件的最小TK启动子结合，可在背景水平之上实现对转座酶激活的精细调控（无dox时为关闭状态）。该调控效果依赖于适当的IDLVs（IDL.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科’s 改良的 Eagle’含4.5 g/L葡萄糖、不含L-谷氨酰胺的s培养基	Lonza	BE12-614F	细胞培养基
HyClone 胎牛血清（美国），已鉴定	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.03	用于生产慢病毒颗粒的血清采用 HEK293T 细胞培养。
青霉素 10,000 UI/ml，链霉素 10,000 UI/ml	Lonza	DE17-602E	细胞培养基试剂
L-谷氨酰胺 200 mM	Lonza	BE17-605E	细胞培养基试剂
氯化钠（NaCl）	Sigma-Aldrich	S7653	用于制备2倍浓度HBS缓冲液的试剂。
HEPES缓冲液，生理盐水中1M储备液	Lonza	BE17-737E	HBS 2X 配制用试剂。
Na₂HPO₄·2H₂O2HPO4·2H2O），99.5%	默克	106580	用于制备2倍浓度HBS缓冲液的试剂。
盐酸 - ACS 级试剂 37% (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	用于制备2倍浓度HBS缓冲液的试剂。
注射用无菌水	Fresenius Kabi	-	用于制备2倍浓度HBS缓冲液的试剂。
0.45 µm PESS 滤膜	Whatman	10462100	用于去除病毒上清液中细胞碎片的滤器。
Polyallomer Beckman 离心管	贝克曼库尔特	326823	用于通过超速离心浓缩IDLV载体的离心管
不含 Ca、Mg 的 1× PBS	Lonza	BE17-516F	用于细胞洗涤和慢病毒颗粒重悬的缓冲液
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A2153	（可选）用于慢病毒颗粒重悬的缓冲液
HIV-1 Gag p24 免疫捕获试剂盒	Perkin Elmer	NEK50001KT	用于IDLV颗粒滴定的试剂盒
Polybrene	Sigma-Aldrich	107689	提高转导效率的试剂
胰蛋白酶（10倍浓度）2.5%（溶于不含钙、镁的HBSS中）	GIBCO	BE17-160E	用于解离HeLa细胞的试剂（储存液，需稀释）。
乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）	100938B	AnalaR BDH	用于配制胰蛋白酶工作液的试剂。
0.5% 胰蛋白酶-EDTA，无酚红（10倍浓缩液）	GIBCO	15400-054	用于解离角质形成细胞的试剂（储存液，需稀释）。
新西兰来源的供体牛血清	GIBCO	16030-074	中国台湾小鼠3T3-J2细胞培养（饲养层）用血清
火腿’s F12 培养基	GIBCO	21765	角质形成细胞培养基
胎牛血清	Lonza	DE14-801F	海拉细胞培养基用血清
胎牛血清，经鉴定，澳洲来源	GIBCO	10099-141	人原代角质形成细胞培养基用血清
牛胰腺来源的胰岛素	Sigma-Aldrich	I5500	角质形成细胞生长试剂
腺嘌呤	VWR	1152-25	角质形成细胞生长试剂
氢化可的松	VWR	3867-1	角质形成细胞生长试剂
霍乱弧菌霍乱毒素	Sigma-Aldrich	C8052	角质形成细胞生长试剂
三碘甲状腺原氨酸	Sigma-Aldrich	T5516	角质形成细胞生长试剂
人表皮生长因子	Austral Biological	GF-010-9	角质形成细胞生长试剂
小鼠单克隆APC标记抗饲养层抗体	Miltenyi Biotech	130-096-099	标记饲养层。
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	RNA纯化试剂盒
SuperScript III 逆转录酶	Life Technologies	18080051	逆转录试剂盒
脱氧核苷酸混合物，10 mM（dNTP）	Sigma-Aldrich	D7295	半定量PCR试剂
UltraPure 无 DNase/RNase 灭菌蒸馏水	（任意）	-	用于半定量 PCR 和 qRT-PCR 的试剂。
GoTaq G2 Hot Start 聚合酶	Promega	M740B	Taq 聚合酶
琼脂糖，用于分子生物学	Sigma-Aldrich	A9539	琼脂糖凝胶电泳试剂
UltraPure TBE 缓冲液，10X	Invitrogen	15581028	琼脂糖凝胶电泳试剂，使用去离子水稀释至1X浓度。
溴化乙锭	Sigma-Aldrich	E1510	琼脂糖凝胶电泳试剂
多西环素	Sigma-Aldrich	D-9891	用于在HeLa细胞和角质形成细胞中诱导转座酶表达的药物
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystem	4304437	包含引物和探针的TaqMan通用PCR主混合液
15 mL 高透明度聚丙烯离心管，锥形底，带圆顶密封螺旋盖，无菌	Falcon Corning	352096	用于细胞收集和载体稀释制备的试管。
150 mm 细胞培养皿（经TC处理，带20 mm网格），无菌	Falcon Corning	353025	用于病毒生产的细胞培养皿
6孔透明平底TC处理细胞培养板，带盖，独立包装，无菌	Falcon Corning	353046	用于HeLa细胞和人原代角质形成细胞转导的细胞培养板
安全锁微量离心管，体积 1.5 mL	Eppendorf	0030 120.086	用于稀释液配制的试管。
Safe-Lock 微量离心管，体积 2 mL	Eppendorf	0030 120.094	用于稀释液配制的试管。
0.2 ml PCR管，带平盖，无RNase、DNase、DNA和PCR抑制剂	（任意）	-	用于半定量 PCR 的试管
MicroAmp 快速光学 96 孔反应板（带条形码），0.1 mL	应用生物系统公司	4346906	用于qRT-PCR的96孔板
5 mL 圆底聚苯乙烯管，无盖	BD Falcon	352052	用于流式细胞术检测的试管。
一次性血清移液管，聚苯乙烯材质，独立包装，无菌（不同规格）	（任意）	-	用于无菌组织培养的移液器
滤器小贴士，无菌且无RNase、DNase、DNA和内毒素（不同规格）	（任意）	-	用于无菌组织培养和分子生物学应用的滤芯吸头。
pH计	（任意）	-	用于测量 HBS 2X pH 的设备
PCR热循环仪	（任意）	-	半定量 PCR 仪器设备
琼脂糖凝胶电泳设备	（任意）	-	用于半定量 PCR 的琼脂糖凝胶电泳设备
BD FACS Canto II 2LSR 4/2	BD	-	流式细胞仪
7900HT Fast 实时荧光定量 PCR 系统	应用生物系统	7900HT	qRT-PCR 仪器设备
用于细胞培养应用的台式离心机，带微孔板桶，带制冷功能，适用于高效样品处理。	（任意）	-	用于细胞培养处理和离心感染的离心机。
Optima L-90K 超速离心机配备 SW32TI 转子	贝克曼库尔特	-	用于慢病毒颗粒生产的超速离心机
细胞培养和分子生物学实验室设备（例如，适用于 BSL2 级材料操作的 II 级生物安全柜、细胞培养孵育箱、冰箱和冷冻柜（+4 °C、-20 °C 和 -80 °C）） °C，-20 °C，-80 °C）、微量移液器和移液辅助器）。
根据研究所规定，特别是在慢病毒颗粒制备和转导过程中，需穿戴防护实验服、手套和面部防护装备。