本方案描述了一种基于荧光共振能量转移和荧光寿命成像显微技术，用于定量可视化SNARE蛋白复合物形成的新方法。
本文内容
摘要
摘要
可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感型融合蛋白（NSF）附着蛋白受体（SNARE）蛋白在膜运输中起关键作用，因其可催化真核细胞内的膜融合过程。SNARE蛋白家族包含约36种不同的成员。特定的细胞内运输途径由特定的3或4种SNARE蛋白组合所催化，从而确保膜运输的特异性和保真度。然而，研究SNARE蛋白的精确功能在技术上具有挑战性，因为SNARE蛋白丰度高且功能冗余，大多数SNARE蛋白具有多种并相互重叠的功能。本实验方案描述了一种在活细胞中可视化SNARE复合物形成的新方法。该方法基于将SNARE蛋白C末端与荧光蛋白融合表达，并通过荧光寿命成像显微技术（FLIM）结合福斯特共振能量转移（FRET）来检测其相互作用。通过对荧光寿命直方图拟合多组分衰减模型，FRET-FLIM可实现对不同囊泡上SNARE复合物形成比例的（半）定量估算。该方案已成功应用于哺乳动物细胞系及原代免疫细胞中质膜和内体区室SNARE复合物形成的可视化，且可轻松拓展至动物、植物和真菌细胞中其他细胞器的SNARE功能研究。
引言
膜运输是真核细胞的一个核心特征，其中膜性囊泡从供体细胞器出芽，随后移动至受体细胞器并与之融合1,2。除线粒体外，所有这些膜融合过程均由SNARE蛋白家族成员催化1,2。SNARE蛋白家族在哺乳动物细胞中约有36个成员，在酵母中约有20个成员2。SNARE蛋白包含一个或两个长约约52个残基、天然无规卷曲的区域，称为SNARE基序。SNARE蛋白通常通过其C末端的跨膜螺旋锚定在膜上1,2。根据其在SNARE复合物中贡献的核心残基，SNARE蛋白可分为精氨酸（R）型和谷氨酰胺（Q）型SNARE1,2。膜融合由3个或4个同源SNARE蛋白的相互作用驱动，这些SNARE共同提供4个SNARE基序，并分布于供体膜和受体膜之间1,2。一个SNARE复合物由一个R-SNARE基序和三个Q-SNARE基序（分别称为Qa、Qb和Qc）组成。复合物的形成始于SNARE基序的N末端，形成所谓的trans-SNARE复合物，并向C末端方向延伸，最终形成一个紧密的α螺旋卷曲螺旋结构，称为cis-SNARE复合物。即使单个SNARE复合物的形成，也能将供体膜和受体膜拉近，从而克服膜融合的能量势垒3。
将特定的SNARE复合物分配到细胞内的特定运输途径通常在技术上具有挑战性。尽管SNARE蛋白明显参与了膜运输的特异性，但它们具有广泛的相互作用能力、功能冗余，并且功能上存在重叠1,2。由于这一特性，针对SNARE蛋白的扰动实验（如基因敲除、RNA干扰、引入阻断性抗体或使用可溶性SNARE片段作为显性负性抑制剂）常常无法产生明确的表型，因为其他SNARE蛋白会代偿其功能2,4。此外，由于SNARE蛋白可能参与多个运输途径，因此很难将特定的膜融合步骤与上游的运输事件区分开来2。通过显微镜技术（如免疫标记或与荧光报告蛋白进行基因融合）对SNARE蛋白进行定位研究时，存在以下问题：(i) SNARE蛋白存在于多种细胞器中，因为它们通常介导多个运输步骤；(ii) 其定位并不自动意味着它们正在功能性地参与SNARE复合物的形成。最后，虽然可以通过免疫共沉淀实验（以其中一个SNARE蛋白作为诱饵，其他SNARE蛋白作为目标）来鉴定SNARE复合物，但该方法无法将这些复合物分配到特定的细胞器或运输途径。因此，目前尚无其他技术能够以细胞器分辨率直接可视化SNARE复合物。免疫荧光技术无法证实SNARE蛋白之间的相互作用，仅能显示是否存在共定位；而免疫共沉淀只能在整体细胞群体中检测SNARE蛋白的相互作用，却无法确定这些相互作用发生的细胞器位置。
为了克服这些局限性，Verboogen 等5 近期开发了一种新方法，可在活细胞中以细胞器分辨率对SNARE复合物进行定量可视化。该方法基于表达成对的SNARE蛋白，其各自C末端的跨膜螺旋上融合了光谱位移的荧光蛋白。在膜融合完成并形成 cis-SNARE复合物后，这些位于跨膜螺旋C末端的荧光基团会立即彼此靠近。此时，它们的距离通常处于福斯特共振能量转移（Förster distance）范围内（一般 <5 nm），从而导致能量从绿色位移的供体荧光基团转移到红色位移的受体荧光基团，产生FRET效应5,6。FRET会导致供体荧光基团的荧光淬灭，同时受体荧光基团的发射增强，这一变化可通过供体与受体发射光强的比值（即比率型FRET）进行测量。然而，由于不同细胞器之间以及不同细胞间供体与受体SNARE蛋白的表达水平存在差异，且存在荧光串扰，因此对两种不同分子之间的比率型FRET测量具有挑战性7,8。FRET也可通过荧光寿命进行测量，即光子被激发至发射之间的时间间隔。若供体荧光基团可通过FRET释放其能量，则该竞争性过程将导致荧光寿命表观上缩短。这一现象可通过荧光寿命成像显微技术（FLIM）进行检测7,8。相较于比率型FRET，基于寿命的FRET在测量两种不同分子间相互作用时更为稳健，因为荧光寿命是荧光基团的内在属性，不受其浓度影响。此外，FRET在近似意义上具有定量性，因为其效率与供体和受体荧光基团之间距离的六次方成反比（本质上呈阶跃函数关系）。因此，通过使用双组分衰减模型对FLIM记录的荧光寿命直方图进行拟合，FRET-FLIM技术可实现对参与SNARE复合物形成的SNARE分子比例进行（半）定量估算5。
最近，Verboogen et al. 利用该FRET-FLIM方法在免疫系统的原代树突状细胞中可视化SNARE复合物的形成5。研究发现，当树突状细胞遇到病原性刺激时，其膜运输路径发生重定向，伴随着R-SNARE囊泡相关膜蛋白（VAMP）3与Qa-SNARE突触融合蛋白4在质膜上的特异性结合增加。这种SNARE复合物形成的增强可能有助于满足分泌炎性细胞因子（如白细胞介素-6）所需的更高分泌能力5。本实验方案描述了获取FRET-FLIM数据以实现SNARE复合物可视化及（半）定量测量所需的实验步骤。文中详细说明了如何使用单指数和双指数衰减函数拟合全细胞荧光寿命直方图，从而获得表观荧光寿命作为SNARE相互作用的定量估算指标。本方案以广泛使用的HeLa细胞系为例，但该方法可轻松扩展应用于其他真核细胞中SNARE复合物的研究。
方案
1. 显微镜样品的制备
- 表达与mCitrine融合的Qa-SNARE突触融合蛋白4（syntaxin 4-mCitrine；供体荧光蛋白）以及与mCherry融合的R-SNARE VAMP3（VAMP3-mCherry）
注意：其他SNARE蛋白也可用于实验，只需将其C末端跨膜螺旋与荧光蛋白融合。除mCitrine-mCherry外，其他光谱可分离的供体-受体荧光蛋白组合也可使用（例如，CFP-YFP。- 培养HeLa细胞，并将900,000个HeLa细胞分种到三个适用于显微镜观察的35 mm玻璃底培养皿中。
注意：原则上，本方案可适用于其他真核细胞类型和显微镜培养皿。- 在T75培养瓶中培养HeLa细胞，加入10 mL高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），并添加10%胎牛血清（FCS）和1%抗生素-抗真菌剂（含两性霉素B、青霉素和链霉素），于 37 °C 和5% CO₂2 在细胞培养孵箱中。
- 每周补充培养基两次，并在细胞达到85-90%融合度时，每周以1:10的比例将细胞传代至新的T75培养瓶（平均每瓶500,000个细胞）。
- 移除DMEM，用8 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤HeLa单层细胞，每次3分钟，共洗涤两次。
- 移除 PBS，加入 2 mL 含 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）的 PBS。
- 将细胞在37°C、5% CO₂培养箱中孵育5分钟 37 °C 和5% CO2 在细胞培养箱中孵育，随后轻轻振荡锥形瓶，使HeLa细胞从瓶底脱落。
- 用10 mL培养基冲洗细胞，将悬液转移至15 mL离心管，并取走一部分 10 µL 用于计数的等分试样。
- 将等分试样用0.4%台盼蓝染液按1:1比例稀释，使用Bürker血细胞计数板进行细胞计数9.
注意：计数两个 4 x 4 方格内的细胞数，乘以 10,000，即为每毫升的细胞数量。 - 细胞计数后，从15 mL离心管中取900,000个细胞，分至3个玻璃底培养皿中（见步骤1.1.1），并准备进行转染。
- 通过电穿孔法转染细胞10 （参见 材料表syntaxin 4-mCitrine 质粒（仅供体，样品#1）、syntaxin 4-mCitrine 与 VAMP3-mCherry 共转染（样品#2），以及 syntaxin 3 同时融合 mCitrine 和 mCherry（样品#3）。
注意：也可使用其他细胞转染方法11. 样品3中的串联结构用于估计可预期的最短寿命，作为阳性对照（即最大可预期FRET
- 培养HeLa细胞，并将900,000个HeLa细胞分种到三个适用于显微镜观察的35 mm玻璃底培养皿中。
- 在含10%胎牛血清和1%抗生素-抗真菌剂的高糖DMEM培养基中，将细胞培养过夜 37 °C 含5% CO2 在细胞培养孵育箱中。
- 吸弃 DMEM，用活细胞成像培养基（140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 20 mM HEPES, 10 mM 葡萄糖，pH 7.4）洗涤细胞一次2，1 mM MgCl2，20 mM HEPES，pH = 7.4，mOsm = 300；参见 材料表）2 分钟，随后将细胞置于新鲜的成像培养基中。
2. FLIM 数据的采集
- 将样品2置于配备供体荧光团脉冲激发光源的时间域FLIM共聚焦显微镜下即，mCitrine）以及时间分辨数据采集。将细胞保持在 37 °C 带有加热载物台。
注意：本方案所用共聚焦显微镜配备63X 1.20 NA水浸物镜和脉冲白光激光器（80 MHz脉冲， < 100 ps 脉冲持续时间）、光电倍增管（PMT）和时间相关单光子计数（TCSPC）系统（参见 材料表 （针对所用的具体装置）。也可使用其他荧光寿命成像显微镜（FLIM）例如，单光子雪崩二极管（SPAD）替代PMT，单波长脉冲激光器替代白光脉冲激光器。 - 选择一个可见表达 mCitrine 和 mCherry 标记的 SNARE 蛋白的细胞，在每次 FLIM 测量前，同时激发两种荧光团，采集一幅 256 × 256 像素的共聚焦图像。像素步长应约为显微镜衍射极限空间分辨率的两倍（约 200 nm）。对于 mCitrine，激发波长为 516 nm，收集 521–565 nm 的发射光；对于 mCherry，激发波长为 610 nm，收集 613–668 nm 的发射光。
注意：切勿将成像平面置于培养皿底部过近的位置（距离底部约 ~ 2 µm 距离），因为这会在荧光寿命直方图中产生一个反射峰。建议同时激发供体和受体荧光团，因为这可以克服样品移动可能带来的问题。然而，也可以采用顺序激发。 - 单击以记录FLIM图像 进行荧光寿命成像（FLIM） FLIM图像的采集尺寸和空间分辨率应与步骤2.2中采集的共聚焦图像相同。为进行全细胞FLIM分析，至少采集50,000个光子，或确保每个像素至少采集400个光子。仅激发mCitrine供体荧光团，而不激发mCherry受体荧光团，因此激发波长为516 nm，收集521–565 nm的发射光。
- 对多个细胞以及其他样本（样本 #1，仅供体；样本 #3，mCitrine-mCherry 串联结构）重复步骤 2.1–2.3。
- 记录仪器响应函数（IRF）。将发射检测器的单色仪调节至激发波长例如，记录510-550 nm的发射光，然后通过点击按钮，使用洁净玻璃盖玻片的背向散射信号采集一幅FLIM图像 运行荧光寿命成像显微技术（FLIM）使用与步骤 2.1-2.4 中记录细胞数据时相同的激发波长（516 nm）和激光功率。
注意：如果在仪器响应函数（IRF）中观察到多个峰，或发射单色器无法调谐，也可使用具有超快荧光寿命的染料溶液来测量IRF，例如通过在饱和碘化钾水溶液中对有机染料进行荧光猝灭。此外，记录IRF并非绝对必要，因为荧光衰减直方图的衰减斜率也可在不进行IRF解卷积的情况下进行拟合。然而，获取IRF可用于校正所用光子探测器的时间特性，从而提高荧光寿命直方图拟合的准确性。
3. 将光子记录转换为荧光寿命成像图像
- 下载并安装 PT32ICS 转换软件5.
注意：寿命数据也可通过其他软件进行分析，包括多家显微镜供应商提供的软件。 - 配置 PT32ICS 软件。
- 设置 大小 通过将图像大小调整为 256 × 256 像素 设置 | 尺寸.
- 设置 通道 到 2 通过 设置 | 尺寸.
注意：mCitrine 发射通道完全取决于显微镜的配置。选择错误的通道将导致荧光寿命成像（FLIM）图像中无光子信号即，黑色图像）并生成一个空的“LifetimeTable.txt”文件。正确的通道可通过试错法确定。 - 设置 输出 到 ImageJ (xyz) 或 TRI2 (xyt)用于生成荧光寿命成像（FLIM）图像（步骤 3.4）。
- 按压 转化 并加载一个或多个光子轨迹文件（.pt3 文件）。要选择多个光子轨迹，请按住 Ctrl 按键按下。
注意：较新的 64 位 .ptu 格式也可进行转换。 - 确保 PT32ICS 软件在与 .pt3 文件相同的保存目录中生成以下文件：每个 .pt3 光子轨迹对应一个以图像细胞计量标准格式存储的单光子堆栈文件（.ics），每个 .pt3 光子轨迹对应一个位图文件（.bmp），以及每次转换生成一个包含光子统计信息的文本文件（_Report.txt）即每个.pt3光子轨迹中的光子总数、探测器的时间分辨率）以及每个转换对应的第二个文本文件（_LifetimeTable.txt），其中包含以制表符分隔格式表示的每个.pt3光子轨迹的总荧光寿命直方图。
注意：该 .ics 文件可用于单像素拟合，以生成荧光寿命成像（FLIM）图像，例如使用 TRI2 软件时12,13 或 FIJI ImageJ 中的 SLIM 曲线拟合库14,15该文件也可用于相量分析。16，例如使用 Spechron 公司为 FIJI 开发的 Time Gated Phasor 插件。位图文件不包含寿命信息。第二个文本文件用于第 4 步的全细胞 FLIM 分析。
4. 全细胞荧光寿命成像分析中荧光寿命直方图的拟合
注意：此步骤（对仪器响应函数进行解卷积拟合）需要具备解卷积拟合功能的软件。若不进行仪器响应函数的解卷积，仅对荧光直方图的斜率进行拟合，也可使用其他软件完成。
- 打开具备去卷积拟合功能的数据分析软件程序（材料清单）并通过导入包含每个光子轨迹直方图的文本文件（_LifetimeTable.txt） 文件 | 导入 | 单个ASCII.
- 重新整理表格，使IRF位于表格的第二列（使用 复制 和 粘贴将IRF放置在第二列B中，紧邻第一列A的时间值。
- 通过按下按键选择所有列，以确定记录的光子轨迹的质量 Ctrl + A 并选择 图表 | 多面板 | 9 面板. 不要分析具有高反射峰的光子轨迹（图4F).
- 选择所有包含经质量控制的寿命直方图的列，以及使用B列中的IRF进行拟合的列 Ctrl 关键并加载非线性拟合 via 分析 | 拟合 | 非线性曲线拟合 | 打开对话框.
- 加载去卷积拟合函数（可在以下位置获取） 补充文件 1) 通过将此功能添加到分析软件中（通过 类别 | 用户定义 | 功能 | 添加）。选择拟合函数文件“FLIM_convoluted_IRF.fdf”。该函数使用与仪器响应函数（IRF）反卷积的单指数衰减函数来拟合荧光寿命直方图即，表格中的第二列B）公式 1):
(公式 1)
与 t 时间 τ 表观荧光寿命， A 振幅，以及 y0 偏移量
注意：另一种选择是使用双指数拟合函数对寿命直方图进行拟合（公式 2):
(公式 2)
通过固定慢组分的寿命（τ1）与仅供体条件（步骤 1.1.2：样品 #1）以及快速组分的τ2) 加入串联结构（样品#3），从而可估算SNARE蛋白形成复合物的比例F) 来自慢速（A1）和快速组分（A2；参见 讨论; 公式 3):
(公式 3)
去卷积双指数拟合的拟合函数文件“FLIM_convoluted_IRF_biexp.fdf”可在以下位置获取 补充文件 2. - 选择 拟合曲线 | X 数据类型 作为 与输入数据相同.
注意：这将导致适当的 x拟合曲线的轴向缩放。 - 通过按压拟合曲线 适配.
注意：此操作将执行拟合并生成一个“报告表”，该表位于数组中，包含荧光寿命、偏移量和振幅的数据。同时还会生成一个数据表，其中包含拟合曲线及拟合残差。
结果
通过FRET-FLIM检测SNARE相互作用的实验原理如图1所示。配对SNARE蛋白跨膜螺旋的C末端分别与一对光谱分离的荧光蛋白（例如，mCitrine和mCherry）融合。膜融合后形成cis-SNARE复合物，导致这些荧光蛋白彼此紧密靠近并发生FRET。图2展示了表达荧光标记SNARE蛋白的HeLa细胞的代表性共聚焦图像。图中显示了表达syntaxin 4-mCitrine（供体荧光团）和VAMP3-mCherry（受体荧光团）的细胞，以及仅表达syntaxin 4-mCitrine构建体（仅供体；无FRET）和syntaxin 3串联融合mCitrine与mCherry（预期最大FRET）的对照条件。图3展示了通过单指数衰减函数拟合每个像素的荧光寿命直方图所生成的荧光寿命及FLIM图像（图3A-B），以及使用双指数衰减函数拟合的结果（图3C-D）。图4A显示了通过显微镜盖玻片背向散射测得的系统仪器响应函数（IRF）。图4B-E展示了全细胞FLIM分析中典型的荧光寿命直方图及其对应的单指数衰减拟合曲线。图4F显示了一个因成像位置过于接近显微镜盖玻片表面而导致出现明显反射峰的荧光寿命直方图。图4G展示了一个采用双指数衰减函数进行典型拟合的寿命直方图。
图1：通过FRET可视化SNARE复合物的原理示意图。（A）神经元SNARE蛋白（蛋白质数据库 3HD717）的结构模型，包括囊泡相关膜蛋白（VAMP）2（蓝色；R）、syntaxin 1（红色；Qa-SNARE）和SNAP25（绿色；包含Qb和Qc-SNARE基序）。Syntaxin-1跨膜螺旋的C末端连接mCitrine（供体荧光蛋白；蛋白质数据库 3DQ118）。VAMP2跨膜螺旋的C末端连接mCherry（受体荧光蛋白；蛋白质数据库 2H5Q19）。（B）SNARE介导膜融合导致FRET的示意图。当通过形成cis-SNARE复合物完成膜融合后，SNARE蛋白彼此紧密靠近，从而产生FRET效应。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：与荧光蛋白融合的SNARE蛋白的表达。 第一列：供体荧光团，激发波长为516 nm。第二列：受体荧光团，激发波长为610 nm。(A) 仅含供体的条件。表达syntaxin 4-mCitrine（供体荧光团；在合并图像中呈绿色）的HeLa细胞的代表性共聚焦图像。受体通道（第二列）显示了荧光串扰。(B) 阴性对照（无FRET）。共表达syntaxin 4-mCitrine和VAMP3-mCherry（受体荧光团；在合并图像中呈洋红色）的HeLa细胞的代表性共聚焦图像。(C) 阳性对照（可预期的最大FRET）。表达syntaxin 3-mCitrine-mCherry串联结构的HeLa细胞的代表性共聚焦图像。请注意，mCitrine与mCherry的荧光信号并未完全重叠，这可能是由于mCitrine对溶酶体降解的抗性低于mCherry所致（见讨论部分）。BF：明场。比例尺，20 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：SNARE复合物形成的荧光寿命成像（FLIM）图像。 (A) 所示细胞的代表性荧光寿命图像 图2图像生成过程首先使用PT32ICS软件将TCSPC系统记录的光子轨迹文件（.pt3）转换为图像细胞计量标准格式（.ics），随后利用TRI2软件生成单像素拟合的荧光寿命图像。12,13 使用15-100%强度的阈值、7像素圆形箱合并及单指数拟合算法（Marquardt）。颜色表示平均表观荧光寿命。B) FLIM图像，其中荧光寿命图像（见图A）与mCitrine供体荧光团的荧光强度（如图所示）进行了卷积处理 图2）。卷积操作使用 FIJI ImageJ 软件并结合自定义宏完成（见 材料表). (C) 表达 syntaxin 4-mCitrine 和 VAMP3-mCherry 的 HeLa 细胞的荧光寿命及荧光寿命成像（FLIM）图像，来自图 A-B，但现采用双指数衰减曲线拟合（寿命固定为对照条件；见实验方案步骤 4.4）。像素颜色表示估计的组分比例 F 与VAMP3形成复合物的syntaxin 4方程 3). (D) 与图B相同，但为双指数拟合结果。卷积分析使用FIJI ImageJ并结合自定义宏完成（见 材料表). 请点击此处以查看此图的放大版本。
图4：全细胞荧光寿命成像分析。 (A) 实验装置的仪器响应函数（IRF）。通过玻璃-水界面的背向散射测量IRF（使用盛有水的洁净玻璃显微镜培养皿）。B-E) 所示细胞的全细胞寿命直方图 图2 和 图3所有图像中的光子均被合并。曲线经仪器响应函数（IRF）去卷积后，采用单指数衰减函数进行拟合（公式 1）。对于这些细胞，获得的荧光寿命分别为：2.82 ns（仅表达syntaxin 4-mCitrine的细胞；仅供体；图B）、2.09 ns（共表达syntaxin 4-mCitrine与VAMP3-mCherry的细胞；图C）和2.08 ns（表达syntaxin 3-mCitrine-mCherry串联结构的细胞；最大预期FRET对照；图D）。插图显示的是相同图形，但y轴采用对数刻度。图E展示了图B至图D衰减曲线的叠加。F) 荧光寿命直方图在显微镜盖玻片表面过近处记录的示例。这会导致出现较大的反射峰（以黄色阴影区域表示）。G) 与 C 图相同，但此时拟合采用双指数衰减曲线，其寿命固定为对照条件下的数值（见实验方案中步骤 4.4）。快速组分的振幅（A1）和慢速（A2组分分别为14.42和0.01，由此估算SNARE复合物中SNARE蛋白的比例 F 0.99公式 3). 请点击此处以查看此图的放大版本。
补充文件 1. 函数文件 FLIM_convoluted_IRF 请点击此处下载该文件。
补充文件 2. 函数文件 FLIM_convoluted_IRF_biexp 请点击此处下载该文件。
讨论
本方案展示了在活体HeLa细胞中利用FRET-FLIM技术可视化syntaxin 4与VAMP3之间SNARE相互作用的方法。Syntaxin 4是一种Qa-SNARE蛋白，主要定位于质膜，在此介导胞吐作用1,2,20,21。VAMP3是一种R-SNARE蛋白，主要定位于循环内体区室，介导向其他内体以及质膜的物质运输1,2,20。然而，FRET-FLIM检测方法可轻松适用于研究其他SNARE蛋白，唯一条件是这些SNARE蛋白含有C末端跨膜螺旋，而绝大多数SNARE蛋白均具备这一特征1,2。此外，本方案所述方法亦可调整用于在任何真核细胞类型（包括植物和酵母）中可视化SNARE复合物。在本方案中，我们以供体荧光团荧光寿命的缩短作为FRET发生的指标。作为一种互补方法，也可检测受体荧光团的寿命，因为敏化发射会产生明显的上升相，从而为共振能量转移的发生提供明确证据。
目前，FRET-FLIM 技术可能无法可视化溶酶体区室中的 SNARE 复合物。对于 syntaxin 3-mCitrine-mCherry 串联构建体，mCherry 荧光通常在核周区域更为富集，该区域很可能对应于溶酶体区室，而 mCitrine 信号则在细胞周边更为丰富5。当相同的 SNARE 蛋白分别与这些荧光蛋白共表达时，也观察到 mCherry 相较于 mCitrine 在核周区域类似的富集现象5。溶酶体的特征是具有极低的 pH 值（< 4）以及高活性的蛋白水解酶。mCherry 在核周区域的富集很可能是由于 mCherry 荧光蛋白相较于 mCitrine 荧光蛋白对溶酶体降解具有更强的抗性所致。这种现象并非由 mCitrine 的 pH 猝灭引起，因为在细胞固定后仍可观察到 mCherry 在核周区域的富集5。因此，FRET-FLIM 技术会低估核周（溶酶体）区域内的 FRET 水平，这需要使用能够在溶酶体腔内严苛条件下稳定存在的其他荧光报告蛋白来解决。
FRET-FLIM 原则上可获得SNARE复合物中SNARE蛋白比例的（半）定量估算5如本实验方案所述，这需要使用双指数衰减函数对荧光寿命直方图进行拟合（公式 2），其中快速组分的幅度与处于复合物状态的SNARE所占比例成正比（公式 3）。然而，采用双组分模型进行拟合在技术上具有较大挑战性。该拟合涉及多个自由参数（两个荧光寿命和两个振幅），需要采集极大量的光子数，尤其是这些参数之间存在相互影响，寿命的微小误差将会影响振幅的准确性 反之亦然为克服这些拟合问题，可将慢组分的荧光寿命固定为仅含供体条件下的寿命值（即，无FRET；仅有mCitrine存在）以及快速组分的寿命与串联构建体的寿命（可预期的最大FRET）进行比较。然而，对此也应谨慎解释，因为荧光寿命可能与这些对照状态下的寿命不同，并可能由于多种原因（如自猝灭、偶极取向、微环境变化）而产生偏差。多个SNARE复合体在空间上彼此靠近时（< 10 nm）时，可产生距离依赖性的FRET，这也是利用FRET作为分子间距离探测手段的基本原理 "分子标尺"，但在此情况下会掩盖SNARE复合物的定量结果。此外，定量估算并不总是具有意义，因为标记的SNARE蛋白会与内源性（未标记）SNARE蛋白竞争。因此，mCherry标记SNARE的表达水平是决定FRET百分比的主要因素5由于存在上述种种限制，建议使用单指数衰减函数对荧光寿命直方图进行拟合公式 1）。这具有无需任何 先验的 了解荧光寿命及其产生的表观平均荧光寿命可为SNARE复合物的形成提供可靠的衡量依据5.
尽管如此，通过双组分拟合模型进行的定量FRET-FLIM成像预计将在未来具有重要的应用前景。可通过CRISPR/CAS9等技术将染色体内的SNARE编码基因与荧光报告蛋白融合。这种方法可实现内源性SNARE蛋白的荧光标记，其表达水平为天然蛋白水平，且不存在未标记SNARE蛋白的背景信号，从而能够利用FRET-FLIM对SNARE复合物所占比例进行有意义的定量估算。虽然内源性SNARE蛋白的表达水平可能较低，产生的荧光信号相对较弱，但预计仍可获得足够数量的光子，特别是对于全细胞FLIM而言（仅需数千个光子即可）。此外，这些FRET-FLIM测量还可采用灵敏度更高的雪崩光电二极管探测器进行，这将进一步提高荧光信号强度和光子统计质量。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了拉德堡德大学医学中心的希帕蒂亚奖学金、人类前沿科学计划的职业发展奖、荷兰科学研究组织（NWO；ICI-024.002.009）的2013年引力计划、NWO的VIDI资助（ALW VIDI 864.14.001）以及欧洲研究委员会（ERC）在欧盟第七框架计划下的启动资助（资助协议编号336479）的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 质粒DNA“syntaxin 4-mCitrine” | Addgene | ID 92422 | 也可使用其他在其C端跨膜螺旋上融合了荧光蛋白的SNARE蛋白。除mCitrine-mCherry外，还可使用其他光谱分离的供体-受体荧光团组合（例如CFP-YFP）。 |
| 质粒DNA“VAMP3-mCherry” | Addgene | ID 92423 | 也可使用其他在其C端跨膜螺旋上融合了荧光蛋白的SNARE蛋白。除mCitrine-mCherry外，还可使用其他光谱分离的供体-受体荧光团组合（例如CFP-YFP）。 |
| 质粒DNA“syntaxin 3-mCitrine-mCherry” | Addgene | ID 92426 | FRET可达到最大值的阳性对照。 |
| HeLa细胞 | |||
| 35 mm玻璃底培养皿 | Willco Wells | HBST-3522 | 其他活细胞成像腔室也可作为替代品使用 |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium） | Gibco, Life Technologies | 31966-021 | |
| 胎牛血清 | Greiner Bio-one | 758093 | |
| 抗生素-抗真菌素溶液 | Gibco, Life Technologies | 15240-062 | 青霉素-链霉素（Pen/Strep）可作为替代品使用 |
| 活细胞成像培养基 | Thermo Fisher Scientific | A14291DJ | 只要能避免培养基自身产生荧光，任何其他活细胞成像溶液均可使用 |
| 配备63倍1.20数值孔径水浸物镜的Leica SP8共聚焦显微镜 | Leica | SP8 | 其他具备时域荧光寿命成像（FLIM）能力的共聚焦显微镜也可使用 |
| 脉冲白光激光器 | Leica | SP8 | 其他脉冲激光光源也可使用 |
| 时间相关单光子计数（TCSPC）系统 | PicoQuant | PicoHarp 300 | |
| PT32ICS转换软件 | 可在www.membranetrafficking.com网站的“软件”部分获取 | ||
| 具备反卷积功能的数据分析软件程序 | Originlabs | OriginPro 2016 | |
| Fiji ImageJ | |||
| 用于FLIM图像与强度卷积的自定义Fiji ImageJ宏 | Fiji ImageJ | 可在www.membranetrafficking.com网站的“软件”部分获取 | |
| Bürker 血细胞计数板 | VWR | 630-1541 | |
| HeLa细胞 | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| PBS | B Braun Melsungen AG | 362 3140 | |
| EDTA 2 mM | Merck | 108417 | CAS: 60-00-4 |
| 15 mL离心管 | Greiner Bio-one | 188271 | |
| 台盼蓝 | Sigma Aldrich | 93595 | CAS: 72-57-1 |
| NEON细胞电穿孔装置 | Thermo Fisher Scientific | MPK5000S |
参考文献
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