小鼠骨髓基质细胞与破骨细胞前体的分离、培养及分化

摘要

本文介绍了从小鼠长骨中分离和分化骨髓基质细胞及造血干细胞的方法。提供了两种不同的实验方案，可获得适用于扩增并分化为成骨细胞、脂肪细胞和破骨细胞的不同细胞群体。

摘要

骨髓基质细胞（BMSCs）是一类常被用作间充质干细胞代表的细胞群体 体外 它们与造血干细胞（HSCs）共同存在于骨髓腔内，后者可分化为红细胞、免疫前体细胞和破骨细胞。因此，从骨髓中提取的细胞群体通常为多种细胞的异质性混合物，这可能给实验设计带来挑战，并干扰数据的解读。为了获得纯度较高或相对均一的骨髓间充质干细胞（BMSCs）和造血干细胞（HSCs）群体，实验室已开发出多种分离与培养技术。 体外在此，我们介绍两种从小鼠长骨中分离骨髓间充质干细胞（BMSCs）和造血干细胞（HSCs）的方法：一种方法获得的是BMSCs与HSCs的混合细胞群体，另一种方法则基于细胞贴壁特性尝试分离这两种细胞群体。两种方法所获得的细胞均适用于成骨和成脂分化实验以及功能分析实验。

引言

自20世纪80年代初被发现以来，原代小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）常被用作体外（in vitro）间充质干细胞的研究模型¹。事实上，在许多研究中，从长骨骨髓腔中冲洗获得的贴壁细胞培养物具有向成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞分化的潜能^2,3,4,5。然而，骨髓是一种独特的组织，包含多种不同的细胞群体，包括但不限于BMSCs、造血干细胞（HSCs）、内皮细胞和免疫细胞。因此，不同的分离与培养技术可能获得纯度不同的细胞群体。使用这些技术来检测细胞的分化潜能可能具有挑战性。例如，在比较不同基因型小鼠来源的细胞时，起始细胞群体的混杂会限制实验数据的解释。相反，获得高纯度的BMSCs和HSCs在技术上较为困难，且可能无法充分代表体外（ex vivo）模型的真实情况。

在我们的实验室中，我们主要关注骨髓间充质干细胞（BMSCs）的应用，因其具有分化为成骨细胞、破骨细胞和脂肪细胞的潜能。本文介绍了用于评估成骨分化或脂肪分化的骨髓间充质干细胞和造血干细胞（HSCs）的分离与培养技术 体外，以及HSCs向破骨细胞分化的培养。一种方法....

方案

所有实验程序均经缅因医学中心研究所机构动物护理和使用委员会批准。

1. 收集管的准备

1. 通过在最低必需培养基α（MEM α）中添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素来制备骨髓间充质干细胞（BMSC）培养基。
2. 将100 µL BMSC培养基加入1.5 mL微量离心管中。通常每根管中可放入3块骨组织，请据此合理准备。
3. 将200 µL移液器吸头的末端剪去适当长度，使其能够插入离心管中。将吸头插入管内，并确保管盖能够关闭，然后将管子置于冰上。
   注意：也可将剪去末端的0.75 mL微量离心管插入1.5 mL微量离心管中。

2. 小鼠骨骼的采集

1. 使用 CO₂ 随后进行颈椎脱位，并用70%乙醇喷洒。
   注意：应使用同性别且最好同龄的动物。我们通常使用7至8周龄的动物。建议将每实验组至少3只动物的细胞合并，以获得更具代表性且可重复的细胞群体。
2. 将安乐死的小鼠仰卧置于解剖板上。用镊子在腹部提起皮肤形成帐篷状，使用无菌解剖剪做一个约1厘米的小切口。从切口处将皮肤向四肢和足部剥离，以暴露下腹部和腿部。
   1. 在踝关节下方切断以去除足部。沿髋部的髂嵴切开，使股骨头与髋骨分离。保持小鼠仰卧位，在髋骨中线处做一切口，以分离两侧髂骨。....

结果

细胞培养概述
这两种培养技术可用于评估由骨髓间充质干细胞（BMSCs）和造血干细胞（HSCs）组成的混合骨髓细胞群体（总BMCs，图1A）或从HSCs中分离出的BMSCs群体（贴壁BMSCs，图1B）的分化能力。骨髓细胞分离并接种后48小时（图1C），细胞迅速贴附于塑料培养皿底部，并倾向于形成单层细胞。当细胞达到汇合状态（图1D）时，即可用于分化检测。

骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化
骨髓间充质干细胞（BMSCs）在汇合培养后，可使用含有抗坏血酸和β-甘油磷酸钠的成骨诱导培养基诱导分化为成骨细胞。 β-甘油磷酸酯（<.......

讨论

本文介绍了两种骨髓间充质干细胞（BMSCs）的培养方法，并阐述了各自的优势与局限性。从骨髓中分离细胞是一个相对简便的过程。然而，由于骨髓腔内细胞环境的多样性，获得具有代表性且富含间充质干细胞或成骨细胞前体细胞的细胞群体仍具有挑战性。

培养骨髓全部内容物可提供对骨髓成分的近似真实反映 体内 微环境。然而，从不同组别的小鼠（基因型、处理方式、年龄）中分离细胞 等等。) 可能在骨髓间充质干细胞（BMSCs）或造血干细胞（HSCs）分离初期导致数量上的显著差异 体外 实验。因此，分离骨髓间充质干细胞（BMSCs）和造血干细胞（HSCs）并重新接种，可更好地控制分化实验起始时的细胞数量。然而，降低细胞培养的异质性可能会影响BMSCs或HSCs的实验结果，因为两者均分泌影响间充质和破骨细胞分化的因子。在设计BMSCs和HSCs的分离与培养方案时，需充分考虑这些局限性。

骨髓中存在的多种细胞群体可能为数据解读带来挑战。除了造血干细胞（HSCs）和骨髓间充质干细胞（BMSCs）外，骨髓微环.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
200μL 移液器吸头	Rainin	17014401
1.5 mL 离心管	USA Scientific	1615-5500
15 mL 锥形管	VWR	89039-668
50 mL 锥形管	VWR	89039-660
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich	21-040-CM
乙醇	Fisher Science	04-355-451
解剖工具
70 μm 滤膜	BD Falcon	352350
0.25% 胰蛋白酶	Gibco	25200
吸水纸（Kimwipe）	VWR	82003-820
多聚甲醛（PFA）	Electron Microscopy Science	15710
碱性磷酸酶试剂盒	Sigma-Aldrich	86R
硝酸银	Sigma-Aldrich	S6506
硫代硫酸钠	Sigma-Aldrich	S7026
油红 O	Sigma-Aldrich	O0625
异丙醇	Sigma-Aldrich	190764
10% 中性缓冲福尔马林	Sigma-Aldrich	F5554-4L
Whatman 1 号滤纸	Sigma-Aldrich	Z274852
抗酒石酸酸性磷酸酶试剂盒	Sigma-Aldrich	387A
戊二醛	Electron	16220
MEMα	Gibco	12571
胎牛血清	VWR	97068-085
青霉素/链霉素	Invitrogen	15140-122
β-甘油磷酸钠	Sigma-Aldrich	G9891
抗坏血酸	Sigma-Aldrich	A4544
DMEM 高糖培养基	Sigma-Aldrich	D5796
罗格列酮	Cayman Chemical	717410
胰岛素	Sigma-Aldrich	I6634
IBMX	Sigma-Aldrich	I5879
地塞米松	Sigma-Aldrich	D4902
RANKL	Peprotech	310-01
mCSF	Peprotech	315-02
Axio Observer 倒置显微镜	Zeiss