本文介绍了从小鼠长骨中分离和分化骨髓基质细胞及造血干细胞的方法。提供了两种不同的实验方案，可获得适用于扩增并分化为成骨细胞、脂肪细胞和破骨细胞的不同细胞群体。
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摘要
摘要
骨髓基质细胞（BMSCs）是一类常被用作间充质干细胞代表的细胞群体 体外 它们与造血干细胞（HSCs）共同存在于骨髓腔内，后者可分化为红细胞、免疫前体细胞和破骨细胞。因此，从骨髓中提取的细胞群体通常为多种细胞的异质性混合物，这可能给实验设计带来挑战，并干扰数据的解读。为了获得纯度较高或相对均一的骨髓间充质干细胞（BMSCs）和造血干细胞（HSCs）群体，实验室已开发出多种分离与培养技术。 体外在此，我们介绍两种从小鼠长骨中分离骨髓间充质干细胞（BMSCs）和造血干细胞（HSCs）的方法：一种方法获得的是BMSCs与HSCs的混合细胞群体，另一种方法则基于细胞贴壁特性尝试分离这两种细胞群体。两种方法所获得的细胞均适用于成骨和成脂分化实验以及功能分析实验。
引言
自20世纪80年代初被发现以来，原代小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）常被用作体外（in vitro）间充质干细胞的研究模型1。事实上，在许多研究中，从长骨骨髓腔中冲洗获得的贴壁细胞培养物具有向成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞分化的潜能2,3,4,5。然而，骨髓是一种独特的组织，包含多种不同的细胞群体，包括但不限于BMSCs、造血干细胞（HSCs）、内皮细胞和免疫细胞。因此，不同的分离与培养技术可能获得纯度不同的细胞群体。使用这些技术来检测细胞的分化潜能可能具有挑战性。例如，在比较不同基因型小鼠来源的细胞时，起始细胞群体的混杂会限制实验数据的解释。相反，获得高纯度的BMSCs和HSCs在技术上较为困难，且可能无法充分代表体外（ex vivo）模型的真实情况。
在我们的实验室中，我们主要关注骨髓间充质干细胞（BMSCs）的应用，因其具有分化为成骨细胞、破骨细胞和脂肪细胞的潜能。本文介绍了用于评估成骨分化或脂肪分化的骨髓间充质干细胞和造血干细胞（HSCs）的分离与培养技术 体外，以及HSCs向破骨细胞分化的培养。一种方法使用包含BMSCs和HSCs的骨髓细胞（BMCs）混合群体，可直接用于成脂分化、成骨细胞分化和破骨细胞分化（称为总BMCs）。该方法更接近 离体 骨髓微环境中细胞异质性的表征。另一种方法则通过分离贴壁细胞与非贴壁细胞，以尝试进行培养 "更纯的" BMSCs和HSCs的群体（称为贴壁BMSCs）。后一种方法可使细胞培养实验以更精确数量的BMSCs或HSCs起始，并减少其他残留细胞群体可能带来的复杂间接效应。这两种方法此前已有发表，并被用于解答不同的研究问题6,7,8,9.
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方案
所有实验程序均经缅因医学中心研究所机构动物护理和使用委员会批准。
1. 收集管的准备
- 通过在最低必需培养基α（MEM α）中添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素来制备骨髓间充质干细胞（BMSC）培养基。
- 将100 µL BMSC培养基加入1.5 mL微量离心管中。通常每根管中可放入3块骨组织，请据此合理准备。
- 将200 µL移液器吸头的末端剪去适当长度，使其能够插入离心管中。将吸头插入管内，并确保管盖能够关闭，然后将管子置于冰上。
注意：也可将剪去末端的0.75 mL微量离心管插入1.5 mL微量离心管中。
2. 小鼠骨骼的采集
- 使用 CO2 随后进行颈椎脱位，并用70%乙醇喷洒。
注意：应使用同性别且最好同龄的动物。我们通常使用7至8周龄的动物。建议将每实验组至少3只动物的细胞合并，以获得更具代表性且可重复的细胞群体。 - 将安乐死的小鼠仰卧置于解剖板上。用镊子在腹部提起皮肤形成帐篷状，使用无菌解剖剪做一个约1厘米的小切口。从切口处将皮肤向四肢和足部剥离，以暴露下腹部和腿部。
- 在踝关节下方切断以去除足部。沿髋部的髂嵴切开，使股骨头与髋骨分离。保持小鼠仰卧位，在髋骨中线处做一切口，以分离两侧髂骨。
- 使用无绒布小心地从股骨、胫骨和髂骨上剥离肌肉。
注意：尽可能多地切除骨骼上的肌腱和肌肉，可使后续使用无绒布擦拭时清洁更快速、更简便（例如，KimWipes）。操作骨骼时需格外小心，因为骨骼容易断裂，且某些基因型可能会进一步增加其脆弱性。 - 所有样本解剖完成后，将其置于冰上的磷酸盐缓冲液（PBS）中，并转移至无菌培养罩内进行后续的分离步骤。
注意：尽可能无菌操作可降低培养物污染的风险。 - 在将骨骼放入离心管内的切段枪头之前，于骨骼的近端和远端各做少量切割（约1至2 mm）。
注意：确保切割足够长度的骨段以便离心获取骨髓；但需注意避免切割过多，因为细胞群体会因在骨髓腔内的位置不同而有所差异。 - 在室温下以 10,000 x g 离心 15 秒。确保所有骨髓均被冲出并沉淀至 1.5 mL 离心管底部，此时骨骼仍位于插入物（200 µL 移液器吸头或 0.75 mL 微量离心管）内。收集全部骨髓后，将带有骨骼的插入物从收集管中取出。
注意：如果所有骨髓均已被冲出，骨骼将呈现白色。然而，若某些骨骼中仍残留骨髓，可尝试再次剪切骨段两端并进行离心。
3. 细胞悬液
- 使用25 G针头缓慢吹打细胞沉淀，以打散团块，并将所有样品合并至一个15 mL离心管中。每500 µL样品加入10 mL BMSC培养基。
- 将70 µm滤膜置于50 mL离心管上，将细胞悬液通过该滤膜过滤，以去除可能存在的骨碎片。
4. 骨髓细胞混合群体（总BMCs）的铺板与培养
注意：细胞在 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养。
- 计算细胞数量，并以 1.0 × 106 个细胞/cm2 的密度将细胞接种于培养基中。共培养 72 小时，使细胞充分贴壁。
注意：我们建议先将细胞悬液用培养基稀释 20 倍，再用台盼蓝稀释后，使用血细胞计数板进行细胞计数。对于 7 周龄的雄性 C57Bl6/J 小鼠，通常可获得约 50 × 106 个细胞，但细胞数量受年龄、性别和品系影响较大。
注意：应有一混合细胞群体贴附于培养孔底部。 - 72 小时后，移除旧培养基并更换为新鲜培养基。此后每隔一天更换一次培养基，并观察细胞融合度。当细胞融合度达到 80–100% 时，即可进行分化诱导。
注意：由于该培养体系同时含有骨髓间充质干细胞（BMSCs）和造血干细胞（HSCs），可直接用于成骨分化、脂肪分化以及破骨细胞分化。
5. 骨髓间充质干细胞（贴壁型BMSCs）分裂群体的接种与培养
注意：细胞在 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养。
- 将一只小鼠股骨、胫骨和髂骨中收集的所有细胞接种至一个10 cm培养皿（培养面积为55 cm2）中。
注意：当合并2-3只C57BL/6J小鼠的细胞时，我们通常将这种“总”骨髓细胞群体接种于150 cm2的培养瓶中。 - 混合培养48小时后，移除培养基（其中含有非贴壁的造血干细胞）。若需进行破骨细胞生成实验，请将这些非贴壁细胞保留备用（见第7节）；否则，吸除并丢弃这些细胞。
- 用PBS小心清洗培养板或培养瓶，避免扰动已贴壁的细胞。
- 吸除PBS，加入0.25%胰蛋白酶，于37 °C孵育1-3分钟以消化细胞。加入细胞培养基终止胰蛋白酶反应。此时，已悬浮的骨髓间充质干细胞（BMSCs）可进行计数（方法同步骤4.1），并接种用于后续实验。
- 计算接种所需的细胞数量。取所需体积的细胞悬液，在室温下以1,000 × g离心5分钟。
注意：细胞接种数量通常根据终点实验需求确定。例如，若需提取蛋白质或RNA，我们通常以较高密度接种（如在6孔板中每孔接种约1.0–2.0 × 106个细胞）。 - 吸除培养基，将细胞沉淀重悬于适量培养基中，根据实验要求接种细胞，并置于培养箱中培养数天使其贴壁。当BMSCs达到汇合状态时，即可进行诱导分化。
6. BMSCs的分化
- 成骨细胞
- 通过将800 µL的1 M β-甘油磷酸钠PBS溶液和200 µL的0.5 M抗坏血酸PBS溶液加入99 mL的BMSC培养基中（BMSC培养基的配制见步骤1.1），制备成骨细胞分化培养基。
- 当BMSC培养物（来自步骤4.3的总BMC或来自步骤5.6的贴壁BMSC）达到汇合状态时，更换为成骨细胞分化培养基以诱导其向成骨细胞分化。
- 每隔一天更换一次分化培养基。细胞开始产生矿化白色结节，可在培养孔底部用肉眼观察到；该过程可在数天至3周内发生。
- 为评估成骨细胞生成情况，按照第8节所述方法对培养孔进行碱性磷酸酶染色和/或Von Kossa染色。
注意：更换培养基时应小心操作，将培养板轻轻倾斜一定角度，以避免破坏细胞单层。
- 为评估成骨细胞生成情况，按照第8节所述方法对培养孔进行碱性磷酸酶染色和/或Von Kossa染色。
- 通过将800 µL的1 M β-甘油磷酸钠PBS溶液和200 µL的0.5 M抗坏血酸PBS溶液加入99 mL的BMSC培养基中（BMSC培养基的配制见步骤1.1），制备成骨细胞分化培养基。
- 脂肪细胞
- 将90 mL高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、10 mL胎牛血清、1 mL青霉素/链霉素、100 µL 20 mM罗格列酮和100 µL 2 mM胰岛素混合，配制成脂肪细胞基础培养基。如需，可在分化实验期间将该培养基于4 °C保存一周。
- 取25 mL脂肪细胞基础培养基，加入200 µL 62.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）和25 µL 1 mM地塞米松，配制成脂肪细胞诱导培养基。
- 当BMSC培养物（来自步骤4.3的总BMC或来自步骤5.6的贴壁BMSC）达到汇合状态时，更换为脂肪细胞诱导培养基。将此日记为分化的第0天。
- 48小时后，移除原培养基，并用新鲜脂肪细胞诱导培养基替换。
- 第4天，更换为脂肪细胞基础培养基。
注意：脂滴最早可能在第2天或第4天开始出现。 - 第7天时，可观察到细胞内脂滴积累达到最大量，并呈现出类似于成熟脂肪细胞的表型。不应继续培养超过此时间点，以免导致细胞死亡或脱落。
7. 肝星状细胞向破骨细胞的分化
- 通过向 25 mL BMSC 培养基中加入 50 µL 浓度为 25 µg/mL 的核因子κB受体活化因子配体（RANKL）和 15 µL 浓度为 25 µg/mL 的巨噬细胞集落刺激因子（mCSF），制备破骨细胞分化培养基。
- 当总骨髓细胞（来自步骤 4.3）或非贴壁细胞（来自步骤 5.2）贴附于孔板后，可更换为破骨细胞分化培养基。每隔一天更换一次分化培养基。
- 每天在显微镜下以 10X 放大倍数观察破骨细胞培养情况，观察到破骨细胞发生融合并形成多核细胞，通常出现在分化第 5 至 7 天左右。
8. 染色
- 成骨细胞
注意：对于碱性磷酸酶（AP）染色，我们通常使用碱性磷酸酶染色试剂盒（参见 材料表）根据指南。- 按照试剂盒制造商的说明书进行碱性磷酸酶（AP）染色。
- 吸弃培养基，用 PBS 洗涤细胞。在室温下用 PBS 中的 4% 多聚甲醛（PFA）固定细胞 12 分钟。
- 与此同时，使用AP染色试剂盒中的试剂配制AP溶液：将500 µL亚硝酸钠加入500 µL FRV-碱性溶液中，轻轻混匀；静置2分钟。加入22.5 mL dH₂O2O 和 500 µL 萘酚 AS-BI 碱性液。轻轻混匀。
注意：PFA 具有毒性，必须小心操作。 - 细胞固定后，用 PBS 洗涤，每孔加入碱性磷酸酶显色液（每孔 1 至 2 mL）。用铝箔包裹，避光室温孵育 30 分钟。吸去溶液，用蒸馏水洗涤，然后让培养板自然干燥。
- 使用相机拍摄染色菌落的图像，以观察碱性磷酸酶阳性细胞。
- 可选择进行Von Kossa染色以替代碱性磷酸酶染色。操作时，需用蒸馏水彻底清洗孔板，因为残留的PBS会与硝酸银发生沉淀反应。.
- 用4% PFA在PBS中室温固定细胞12分钟。然后加入足量5%硝酸银溶液覆盖孔板，室温下强光照射1小时。
- 移除硝酸银溶液，用蒸馏水冲洗每个孔。向细胞中加入5%硫代硫酸钠溶液，静置3分钟。
- 吸除硫代硫酸钠，并用蒸馏水洗涤。让平板干燥，用肉眼观察呈深棕色/黑色的矿物沉积。
- 按照试剂盒制造商的说明书进行碱性磷酸酶（AP）染色。
- 脂肪细胞
- 对于油红O（ORO）染色，使用10%中性缓冲福尔马林在室温下固定细胞1小时。
- 同时，通过将 0.035 g 溶解于 10 mL 异丙醇中配制 ORO 储备液。此溶液足以用于 6 孔板。混合后使用一张滤纸（孔径 11 µm）过滤溶液。
- 通过将 9 mL ORO 储存液与 6 mL 蒸馏水混合，配制 ORO 工作液。将溶液置于摇床中避光保存，直至使用。
- 用蒸馏水配制60%异丙醇溶液（配制量需足以覆盖每个孔）。
- 细胞固定后，移除固定剂，用蒸馏水洗涤一次。随后加入60%异丙醇溶液，作用1分钟。
注意：倾斜培养板时缓慢加入液体；脂肪细胞极易脱落。 - 除去异丙醇，加入足量的ORO工作液以完全覆盖所有细胞。室温下低速摇床上孵育15分钟。移除ORO溶液，用蒸馏水洗涤两次。
注意：此时可在显微镜下观察经油红O染色的脂滴。 - 为定量油红O，向每孔加入1 mL 100%异丙醇，缓慢振荡10分钟以脱色。
- 同时，使用 ORO 工作液（2,100 µg/mL）和异丙醇作为稀释剂，配制以下 8 个标准品浓度的系列稀释液以建立标准曲线：500、350、300、250、150、100、75 和 0 µg/mL。
- 在酶标板中每孔加入200 µL标准品和脱色后的样品，每个样本设三个复孔，于490 nm波长处测定吸光度。
- 根据标准曲线确定每个样品的ORO浓度。
注意：我们建议将油红O（ORO）浓度归一化至细胞数量。细胞数量可通过结晶紫染色或DNA定量来测定。
- 根据标准曲线确定每个样品的ORO浓度。
- 破骨细胞
注意：准备就绪后，建议使用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色试剂盒对破骨细胞进行TRAP染色（参见 材料表).- TRAP染色时，用含2.5%戊二醛的PBS在室温下固定细胞30分钟。同时，配制TRAP染色液：将50 µL Fast Garnet碱性溶液、50 µL亚硝酸钠、4.55 mL蒸馏水、50 µL萘酚AS-磷酸盐、200 µL醋酸盐溶液和100 µL酒石酸盐溶液混合。
- 吸除固定液，用 PBS 洗涤细胞两次，然后加入 TRAP 溶液，37 °C 孵育 1 小时。
- 用蒸馏水洗涤后，在显微镜下计数破骨细胞（放大倍数10倍）。TRAP+ 细胞呈紫色，具有三个或更多细胞核。
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结果
细胞培养概述
这两种培养技术可用于评估由骨髓间充质干细胞（BMSCs）和造血干细胞（HSCs）组成的混合骨髓细胞群体（总BMCs，图1A）或经分离获得的BMSC群体（贴壁BMSCs，图1B）的分化能力。骨髓细胞分离并接种后48小时（图1C），细胞迅速贴附于塑料培养皿底部，并倾向于形成单层细胞。当细胞达到汇合状态（图1D）时，即可用于分化检测实验。
骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化
骨髓间充质干细胞（BMSCs）融合培养后，可使用含有抗坏血酸和β-甘油磷酸钠的成骨诱导培养基诱导分化为成骨细胞图2A...
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讨论
本文介绍了两种骨髓间充质干细胞（BMSCs）的培养方法，并阐述了各自的优势与局限性。从骨髓中分离细胞是一个相对简便的过程。然而，由于骨髓腔内细胞环境的多样性，获得具有代表性且富含间充质干细胞或成骨细胞前体细胞的细胞群体仍具有挑战性。
培养骨髓全部内容物可提供对骨髓成分的近似真实反映 体内 微环境。然而，从不同组别的小鼠（基因型、处理方式、年龄）中分离细胞 等等。) 可能在骨髓间充质干细胞（BMSCs）或造血干细胞（HSCs）分离初期导致数量上的显著差异 体外 实验。因此，分离骨髓间充质干细胞（BMSCs）和造血干细胞（HSCs）并重新接种，可更好地控制分化实验起始时的细胞数量。然而，降低细胞培养的异质性可能会影响BMSCs或HSCs的实验结果，因为两者均分泌影响间充质和破骨细胞分化的因子。在设计BMSCs和HSCs的分离与培养方案时，需充分考虑这些局限性。
骨髓中存在的多种细胞群体可能为数据解读带来挑战。除了造血干细胞（HSCs）和骨髓间充质干细胞（BMSCs）外，骨髓微环...
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披露
作者声明不存在任何经济利益冲突。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（R01 AR061164-01A1）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 200μL 移液器吸头 | Rainin | 17014401 | |
| 1.5 mL 离心管 | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15 mL 锥形管 | VWR | 89039-668 | |
| 50 mL 锥形管 | VWR | 89039-660 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich | 21-040-CM | |
| 乙醇 | Fisher Science | 04-355-451 | |
| 解剖工具 | |||
| 70 μm 滤膜 | BD Falcon | 352350 | |
| 0.25% 胰蛋白酶 | Gibco | 25200 | |
| 吸水纸（Kimwipe） | VWR | 82003-820 | |
| 多聚甲醛（PFA） | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| 碱性磷酸酶试剂盒 | Sigma-Aldrich | 86R | |
| 硝酸银 | Sigma-Aldrich | S6506 | |
| 硫代硫酸钠 | Sigma-Aldrich | S7026 | |
| 油红 O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| 异丙醇 | Sigma-Aldrich | 190764 | |
| 10% 中性缓冲福尔马林 | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| Whatman 1 号滤纸 | Sigma-Aldrich | Z274852 | |
| 抗酒石酸酸性磷酸酶试剂盒 | Sigma-Aldrich | 387A | |
| 戊二醛 | Electron | 16220 | |
| MEMα | Gibco | 12571 | |
| 胎牛血清 | VWR | 97068-085 | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15140-122 | |
| β-甘油磷酸钠 | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| DMEM 高糖培养基 | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| 罗格列酮 | Cayman Chemical | 717410 | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| RANKL | Peprotech | 310-01 | |
| mCSF | Peprotech | 315-02 | |
| Axio Observer 倒置显微镜 | Zeiss |
参考文献
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