胚胎期暴露于低剂量毒物的长期行为与生殖影响

摘要

接触环境毒物可能对发育产生急性影响，并带来长期后果。本文提供了详细的实验方案，以说明利用有效的实验室模型研究双酚A早期胚胎暴露影响的策略。我们提供了繁殖力和行为学检测方法，以监测毒物暴露生物检测的有效性。

摘要

双酚类化合物（如双酚A（BPA）和双酚S（BPS））是广泛用于塑料及多种日常用品生产中的聚合剂。基于其化学结构和类似雌二醇的生物学特性，这些化合物被归类为内分泌干扰物（EDC）。长期暴露于EDC，即使剂量较低，也已与多种健康缺陷相关，包括癌症、行为障碍和不育，且在早期发育阶段表现出更高的易感性。利用遗传操作便捷的线虫模型秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）开展的细胞和分子研究表明，暴露于BPA可导致细胞凋亡、胚胎致死以及DNA修复机制的紊乱。我们先前报道过，秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎暴露于低剂量的不同双酚类化合物可降低其繁殖力。此外，我们还发现，在发育极早期暴露的影响会持续至成年期，这一点通过量化习惯化行为（一种非联想学习形式）得以验证。本文提供了胚胎期低剂量EDC暴露的详细实验方案，以及相关的繁殖力检测和前部触觉习惯化行为检测方法，并附有代表性结果。

引言

近年来，环境毒物暴露（特别是那些可能干扰发育的化合物）一直受到科学界的密切关注。目前有超过一千种日常使用的化学物质被归类为内分泌干扰物（EDC）¹。快速生长和发育阶段（包括胚胎期、婴儿期和儿童期）尤其容易受到即使低剂量EDC的有害影响。研究表明，这些物质可导致生殖系统障碍和神经发育异常²。根据美国环境保护署和美国国家毒理学计划专家组的指南，低剂量可定义为任何低于已报道引起可观察生物学变化或损伤剂量水平的剂量³。除了单一EDC的低剂量效应外，环境中多种EDC以低浓度共存时，也可能产生显著的累积效应⁴。

双酚A（BPA或4,4'-(丙烷-2,2-二基)）是一种常见于水瓶、购物小票、牙科密封剂以及饮料和食品罐内涂层等日常用品中的聚合剂⁵。由于其结构与17-β雌二醇（E₂）相似，并能与ERα和ERβ雌激素受体结合，双酚A已被归类为内分泌干扰化学物（EDC）^5,6。尽管其与雌激素受体的亲和力较弱，但已有研究表明，双酚A可在被认为安全的剂量下影响两性的生殖系统，并干扰神经功能^7,8。通过表观遗传调控机制引起的DNA甲基化改变，在暴露于双酚A的小鼠中已被观察到导致长期的神经缺陷⁹。具体而言，长期暴露后小鼠边缘前脑中D1多巴胺受体增加，双酚A也被认为可能是导致多动症、注意力缺陷以及对药物敏感性增强的潜在因素之一^9,10。关于内分泌干扰物对人类健康有害影响的大量证据主要基于相关性研究，重点关注人群对环境毒物即使在低剂量下的慢性暴露⁵；然而，在应对有关缺乏依据的夸大宣传的批评时，学界也普遍承认人类研究中的推论局限性以及实验控制操作上的困难^11,12。

由于秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的基因，包括其类固醇激素受体基因，与哺乳动物具有保守性，研究人员已利用这一遗传上易于操作的实验模型，揭示环境内分泌干扰物（EDCs）的功能性及作用机制效应¹³。对C. elegans开展的实验表明，双酚A（BPA）和双酚S（BPS）等化合物可导致细胞凋亡、胚胎致死、双链DNA断裂修复机制受损以及神经功能障碍^14,15,16。

本实验室先前已证实，即使仅在胚胎发育早期进行低剂量暴露，也会导致存活成虫的繁殖力下降并出现行为缺陷¹⁵。在包括C. elegans在内的模式系统中，对重复刺激的习惯化是一种非关联性学习形式，本研究的方法学利用这种非关联性学习作为行为输出指标，以检测胚胎期暴露于有毒物质后的长期影响¹⁷。具体而言，我们提供了研究双酚A（BPA）对C. elegans暴露效应的详细实验方案，包括其对胚胎致死率的即时影响以及对成虫行为的长期影响，整体实验设计示意图见图1。文中还展示了繁殖力和非关联性学习检测的代表性结果，以突出本方法的有效性。

方案

以下方案已标准化，用于检测双酚A（BPA）暴露对早期胚胎发生的影响，也可根据需要修改后用于双酚S（BPS）、双酚F（BPF）或其他环境内分泌干扰物和有毒物质对C. elegans胚胎的影响。

1. 材料准备

1. 制备500 mL线虫生长培养基（Nematode Growth Media, NGM）¹⁸：将1.5 g NaCl、1.25 g蛋白胨和8.5 g琼脂溶于水中，定容至500 mL。经高压灭菌（121 °C，15 PSI，20 min）后，加入0.5 mL胆固醇溶液（5 mg/mL，溶于乙醇）、0.5 mL 1 M MgSO₄、0.5 mL 1 M CaCl₂以及12.5 mL 1 M磷酸钾缓冲液（pH 7.4）（由108.3 g KH₂PO₄、35.6 g K₂HPO₄加水至1 L配制而成）。
2. 通过混合25 mL 1 N KOH、4 mL次氯酸钠溶液（漂白剂）和71 mL水配制次氯酸盐溶液。该溶液需现配现用。
3. 通过混合3 g KH₂PO₄、6 g Na₂HPO₄、5 g NaCl、5 mL 1 M MgSO₄并加水至1 L配制M9缓冲液。
4. 通过混合129 mL 0.02 M K₂HPO₄、871 mL KH₂PO₄和5.85 g NaCl配制S缓冲液¹⁸。
5. 将M9缓冲液和S缓冲液经高压灭菌进行灭菌处理。
6. 在20 mL LB液体培养基中过夜培养大肠杆菌（Escherichia coli，OP50菌株）。
7. 将BPA溶于10%乙醇中，配制成1 mM储备液。随后用S缓冲液稀释为0.1 µM、0.5 µM、1 µM、5 µM和10 µM的工作浓度。
   注意：在水相S缓冲液中稀释后，乙醇浓度显著降低；例如，在本实验方案所述最高BPA浓度（10 µM）下，乙醇终浓度为0.1%（v/v）。

2. C. elegans 培养与同步化

1. 将NGM培养基倒入100 mm培养皿中（每皿约25 mL），静置使其凝固。凝固后，用移液器将150 µL过夜培养的液体培养物中的大肠杆菌（E. coli）OP50均匀涂布于培养皿表面。将培养皿在37 °C下培养过夜。
2. 次日，通过切割约1 cm²的琼脂块，将N2线虫转移至新制备的培养皿中。在20 °C下培养3天，直至培养皿中出现大量健康、饱食且体内含有可见胚胎的成虫。
3. 为实现发育同步化，使用移液器将最多5 mL M9缓冲液冲洗整个培养皿表面。将洗出的液体转移至无菌的15 mL锥形离心管中。
   注意：同步化的目的是杀死成虫，从而收集发育阶段相对一致的胚胎。
4. 在室温下以3,000 x g离心4分钟，以获得松散的成虫沉淀。
5. 使用10 mL移液器小心吸除上清液，注意保留沉淀完整。加入5 mL次氯酸盐溶液，并轻轻混匀。
6. 在室温下以3,000 x g离心4分钟。
7. 用10 mL移液器吸除上清液，并加入7 mL M9缓冲液进行洗涤。重复此步骤两次。

3. 让线虫暴露于双酚A

1. 完成上述第2.7步的最后一次洗涤后，用M9缓冲液重悬约100 µL的卵。将约50 µL卵转移至已含有用S缓冲液稀释至适当浓度BPA的2 mL微量离心管中。调整S缓冲液的体积，确保每管中BPA的最终浓度正确（分别为0.0 µM、0.1 µM、0.5 µM、1.0 µM、5.0 µM和10 µM）。表1展示了一种配制这些稀释液的方法。

最终 BPA 浓度	BPA 储存液 (100 μM)	S 缓冲液	同步化线虫
0.1 μM	1 μL	949 μL	50 μL
0.5 μM	5 μL	945 μL	50 μL
1 μM	10 μL	940 μL	50 μL
5 μM	50 μL	900 μL	50 μL
10 μM	100 μL	850 μL	50 μL

表1：用于获得本研究所需浓度的BPA储备液、S缓冲液及同步化线虫。

2. 将试管置于摇床中，在 20°C 下轻轻振荡 4 小时，转速为 25 rpm（旋转式摇床）或 25 次倾斜/分钟（往复式摇床）。
3. 4 小时后，将试管放入试管架中，静置使线虫沉降。
4. 弃去上清液，将线虫转移至已接种细菌的培养板（含 OP50 E. coli 的 NGM 培养板）。按照步骤 1.5 中所述制备液体 OP50 E. coli 菌液，并按照步骤 2.1 中所述方法接种培养板。
5. 将线虫在 20 °C 下培养 60 小时。每天检查培养板是否有污染。受污染的 NGM 培养板通常会出现变色，并伴有单个菌落。在显微镜下检查线虫是否过度拥挤。若 OP50 E. coli 菌苔缺失，且线虫密集聚集在小区域，表明培养过密。

4. 前部触碰习惯化实验

1. 使用经火焰灭菌的30 G铂金丝挑取器，将约10条同步化的年轻成虫线虫转移至新的未接种NGM平板上。将线虫静置5分钟，使其有时间适应新培养皿。
2. 进行习惯化反应实验时，使用一根固定在木签或牙签末端的眉毛毛，将其浸入70%乙醇中进行灭菌，再用干净的无绒纸巾擦拭，并静置1分钟使乙醇完全挥发。用眉毛毛轻轻触碰线虫头部（咽部球前端）。重复触碰操作，每次触碰之间间隔10秒，以使线虫有时间恢复。
3. 持续进行触碰（保持10秒的刺激间间隔），直至线虫不再向后移动。此时线虫已对该刺激产生习惯化。记录线虫达到习惯化所需的触碰次数。
4. 采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey事后检验，分析处理组与未处理对照组之间平均习惯化速率的差异。

5. 线虫繁殖力检测

1. 使用铂金接种针将单个L3期线虫转移至新鲜的已接种培养板上。确保每块平板仅放置一条线虫。
   注意：L3幼虫期之后，线虫将发育为L4幼虫期并进入成虫期。在此阶段早期进行挑选较为方便，因为此时线虫体型已足够大，便于单个个体的转移，同时可确保其尚未产下任何卵，避免卵子未被计入产卵数量统计。
2. 每12–24小时统计一次所产卵的数量。统计后，将亲代线虫转移至新的培养板。重复此步骤，直至线虫停止产卵，通常在20 °C培养条件下约5天后停止。
   注意：野生型线虫平均可产卵约300个；因此，每日将亲代线虫转移至新板可防止培养板过度拥挤。
3. 采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey事后检验，分析处理组与未处理对照组之间平均产卵数的差异。

结果

早期关于秀丽隐杆线虫（C. elegans）的研究报道，胚胎发育至成虫期持续暴露于高浓度双酚A（BPA）（≥1 mM）会降低其繁殖力¹⁴。我们实验室后续的研究表明，胚胎在发育早期仅短暂暴露于BPA 4小时，成虫后所产的可存活卵数量即显著减少¹⁵（图2）。该方法学有两个关键特征：（i）所用BPA浓度显著较低（0.1 µM 至 10 µM 范围）；（ii）暴露时间仅限于胚胎发育早期。除了在较低剂量下仍观察到繁殖力下降外，我们的习惯化实验还发现，与仅暴露于溶剂对照的线虫相比，胚胎期暴露于BPA的线虫需要更多刺激才能完成习惯化¹⁵（图3）。这些效应值得注意，因为它们基于低剂量BPA暴露，其依据在于：虽然神经功能的细微变化可能在形态学上不可见，但可通过行为改变被检测到。简言之，本文展示的代表性结果强调了一个事实：胚胎期暴露于BPA的有害影响会波及个体发育过程，包括可通过成虫行为学实验在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中评估的神经功能。本文提供的实验方案可用于检测其他潜在毒物（包括内分泌干扰物）的低剂量及长期暴露效应。

图1：实验设计的示意图。 收集成熟线虫，并将其暴露于次氯酸钠溶液中以获得同步化的胚胎。随后将胚胎暴露于不同浓度的双酚A（BPA）中，持续4小时。暴露后的胚胎被转移至接种有大肠杆菌的NGM平板上，在20 °C条件下培养60小时。为了检测发育早期暴露处理的效果，将L4期线虫转移至单独的平板中检测其繁殖力，并对年轻成虫进行前部触觉习惯化测试。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：双酚A降低了繁殖力。 暴露于1 µM及以上浓度的双酚A后，产卵数量相比对照组显著减少（以水平线表示；n = 10，*p <0.05）。误差线表示标准误（SEM）。采用单因素方差分析（ANOVA）及Tukey事后检验进行统计分析。本图改编自Mersha et al., 2015¹⁵。 请点击此处查看此图的放大版本。

图3：胚胎期双酚A暴露的长期效应体现在成年后的行为中。 胚胎期暴露于低至0.1 µM的双酚A浓度即可影响成年期的非关联性前部触碰习惯化（n = 60，*p <0.05）。误差线表示标准误（SEM）；采用单因素方差分析（ANOVA）及Tukey事后检验。本图经修改自Mersha et al., 2015¹⁵。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

胚胎发生等快速生长和发育阶段特别容易受到包括双酚A（BPA）在内的多种内分泌干扰物的有害影响。本文提供了在C. elegans无脊椎动物模型中研究BPA或其他有毒物质暴露效应的详细实验方案，该模型可方便地进行一系列浓度梯度滴定，以评估其对胚胎存活能力的影响（图2）。对暴露于低剂量BPA后发育存活的成虫进行后续行为学实验，可用于检测其对神经功能的长期影响（图3）。本文的核心目标是提供在C. elegans模型中于早期胚胎发生阶段（即其11.5小时胚胎发育期（20 °C条件下）的最初4小时窗口）暴露于多种有毒物质的详细操作流程；该早期阶段对应于细胞增殖期，随后进入器官发生期。为此，我们通过繁殖力和非关联学习实验对所采用的检测终点进行了验证。尽管揭示BPA及其他双酚类化合物作用的分子机制是该领域研究追求的终极目标，但本文作为以方法学为重点的文章，并未尝试对BPA的作用机制提供解释。然而，我们希望指出，C. elegans模型为深入解析其作用机制提供了理想的研究体系。例如，在未来关于解析BPA作用机制的研究中，可构建并筛选对BPA效应具有抗性的C. elegans突变体，从而为阐明相关信号通路奠定基础。此外，我们的配套论文探讨了BPA在脊椎动物神经网络同步性水平上的影响，为理解有毒物质效应潜在机制的研究提供了另一条途径¹⁹。

在本文详述的方法中，以下是一些需要格外谨慎执行的关键步骤：选择含有充分喂养且在解剖显微镜下可见成熟卵的 C. elegans 成虫的培养皿至关重要，若未遵循此步骤，将导致用于EDC暴露实验的胚胎样本量不足。此外，必须确保次氯酸盐溶液为新鲜配制，以避免获得不同步的种群，从而干扰在早期胚胎发育阶段进行BPA暴露的能力。在次氯酸盐处理后用M9缓冲液洗涤沉淀物也是非常关键的一步。若操作不当，高浓度的漂白剂可能导致胚胎死亡。同时，应在4小时后将胚胎转移至接种有食物的NGM平板。若胚胎在BPA溶液中停留时间过长，很可能发育为长寿的dauer幼虫，这将显著干扰后续的繁殖力检测和行为学检测。若遗漏上述任何一步，建议从头重新开始实验流程。若因任何原因导致含有线虫的NGM平板被污染或食物不足，则会增加线虫的压力，进而扭曲所收集的数据。此类平板应予以丢弃，不得用于实验。

此前，一项显著的研究成功利用 C. elegans 模型证明，双酚A（BPA）引起的染色体异常是由于生殖系中DNA修复机制的破坏所致¹⁴。然而值得注意的是，上述研究设计对秀丽隐杆线虫（C. elegans）在其整个生命周期中持续暴露于高剂量BPA。我们的方法旨在研究早期胚胎发生阶段低剂量BPA暴露的影响，以评估其对胚胎存活率以及对存活个体更细微的长期影响。据我们所知，目前尚未建立一种仅在特定时间段内对早期胚胎暴露于极低剂量BPA的方法；因此，本文所提出的方法具有新颖性。

此外，本文提供的方案可轻松调整，用于研究其他环境内分泌干扰物（EDCs）在胚胎发生增殖阶段的作用。然而，若要研究晚期胚胎发育阶段，则需对目标发育关键时间窗口进行重要修改。此外，本方案不适用于需要较长时间暴露于毒物的实验，因为这可能导致替代发育途径被激活，从而在第二次蜕皮周期时进入长期存活的dauer滞育状态，该状态对恶劣环境具有较强抗性。²⁰需要进一步修改和完善，以延长暴露时间，可通过添加不会代谢毒物或环境内分泌干扰物的食物来源来实现 例如 高压灭菌 E. coli总之，我们的方法可用于评估多种内分泌干扰物对无脊椎动物模型系统繁殖力和神经功能的影响。 秀丽隐杆线虫

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NaCl	Fisher	7647-14-5
蛋白胨	Fisher	S25761B
琼脂	Fisher	BP1423-500
胆固醇	Alfa Aesar	A11470
MgSO4	Fisher	7487-88-9
CaCl2	Fisher	C79-500
KH2PO4	Fisher	P286-1
K2HPO4	Fisher	7758-11-4
KOH	Fisher	1310-58-3
漂白剂	Clorox	n/a
Na2HPO4	Fisher	BP332-500
LB	Fisher	BP1426-500
BPA	Sigma-Aldrich	239658-250g
BPS	Sigma-Aldrich	103039-100g
EtOH	Sigma-Aldrich	64-17-5
E.coli OP50	CGC		明尼苏达大学菌种保藏中心
N2（野生型秀丽隐杆线虫）线虫	CGC		明尼苏达大学菌种保藏中心
铂金丝接种环	Genesee Scientific	59-AWP
培养皿	Fisher	07-202-011
体视显微镜	AmScope	SM-2TYY