脑片中神经元树突的双光子钙成像

摘要

我们介绍一种结合全细胞膜片钳记录与双光子成像的方法，用于在急性脑片中的神经元树突内记录 Ca²⁺ 瞬变。

摘要

钙（Ca²⁺）成像是一种强大的工具，可用于研究神经元树突中细胞内Ca²⁺信号的时空动态。Ca²⁺波动可通过多种膜和细胞内机制产生，在突触可塑性的诱导和树突兴奋性的调控中发挥关键作用。因此，记录树突分支中不同类型Ca²⁺信号的能力，对于研究树突如何整合信息的研究团队具有重要价值。双光子显微镜的出现通过解决活体组织成像中固有的问题（如光散射和光损伤），使此类研究显著变得更容易。此外，通过将传统的电生理技术与双光子Ca²⁺成像相结合，可以同时研究神经元树突中的局部Ca²⁺波动以及胞体的突触活动记录。本文描述了如何利用该方法研究GABA能抑制性中间神经元树突中局部Ca²⁺瞬变（CaTs）的动力学特性。该方法也可应用于急性脑片中不同类型神经元的树突Ca²⁺信号研究。

引言

神经元对网络活动的贡献在很大程度上取决于其接收的突触输入的动态特性。传统上，表征神经元突触活动的主要方法依赖于通过电刺激穿行轴突诱发突触后电流，并采用胞体全细胞膜片钳记录来检测这些电流。然而，这种方法仅能真实反映靠近胞体的近端突触的活动情况¹此外，为了评估突触特异性机制，研究人员采用成对神经元记录以及特定位置的树突记录，分别针对感兴趣的突触和树突整合机制进行研究。突触生理学领域的一项重大突破源于光学技术与电生理技术的结合。双光子激发激光扫描显微镜（2PLSM）与Ca²⁺ 成像与光遗传学工具可揭示脑切片中特定神经元连接处突触活动动态组织的丰富细节 体外 和 体内.

双光子激光扫描显微镜（2PLSM）相较于传统的单光子激发显微镜具有几项关键优势²：（1）由于双光子激发具有非线性特性，荧光仅在焦平面体积内产生，所有发射的光子均为有效信号（无需使用针孔）；（2）2PLSM所采用的较长波长能更有效地穿透散射组织；此外，散射后的光子能量过于分散，无法引发双光子激发，因而不会产生背景荧光；（3）光损伤和光毒性也仅局限于焦平面。因此，尽管双光子系统的成本高于传统共聚焦显微镜，2PLSM仍是研究厚活体组织中神经元结构与功能的首选高分辨率成像方法。

双光子激光扫描显微镜（2PLSM）在散射....

方案

所有实验均遵循拉瓦尔大学动物保护委员会和加拿大动物护理委员会的动物福利指南进行。

1. 初步准备（可选：提前1天准备）

1. 配制三种人工脑脊液（ACSF）溶液（正常溶液、蔗糖溶液和恢复溶液，每种各1 L；见 表1）。将溶液的渗透压调节至 300 ± 10 mOsm²⁵ 并将 ACSF-蔗糖溶液冷却至接近冰点（0-4 °C).
   注意：使用低钠切割液（ACSF-Sucrose）有助于保持急性脑片浅层神经元的活性²⁶.
2. 配制含有红色荧光染料的0.75 mL膜片溶液（例如，Alexa-594）和一种绿色合成钙离子指示剂（例如，Oregon Green BAPTA-1；参见 表1）。加入生物胞素（biocytin，参见 表1) 若在膜片溶液中 事后检验 记录细胞的形态学鉴定是必需的。
3. 将溶液的渗透压调节至280 ± 5 mOsm，pH值调节至7.35 ± 0.5。溶液应始终保存在冰箱中或置于冰上。
   注意：钙指示剂的选择应基于其动态范围以及所研究的 Ca²⁺ 事件。
4. 使用微电极拉制仪，从硼硅酸盐玻璃毛细管制备膜片钳电极（....

结果

采用本方案，我们记录了海马CA1区oriens/alveus中间神经元在胞体电流注入以及树突电刺激条件下诱发的钙瞬变（CaTs）。在对神经元形成封接后，根据其形态和位置进行识别，我们对近端树突在多个位点进行线扫描，这些位点位于距胞体不同已知距离处（图1A）。我们观察到，随着距胞体距离的增加，由逆向传播的动作电位（AP）诱发的CaT幅度逐渐减小（提示动作电位幅度降低或钙通道分布呈距离依赖性下降，图1B）。在完成免疫组织化学染色（使用链霉亲和素偶联的Alexa Fluor 546）后，我们成功回收了该细胞的生物胞素标记，并将所记录的神经元鉴定为双层细胞，其轴突分布于stratum oriens和stratum radiatum（图1C）。在第二项实验中，将刺激电极置于远端树突位置。沿树突进行扫描，我们能够评估特定树突分支在轴突通路电刺激下产生的突触后Ca²⁺信号幅度（

讨论

此处展示的方法表明，双光子钙成像与光遗传学技术相结合，可实现对自由活动小鼠大脑中神经元活动的高时空分辨率记录与精确操控。该方法利用双光子显微镜穿透散射组织的能力，结合基因编码钙指示剂（如 GCaMP）标记特定神经元群体，从而在活体动物中实时监测神经元群体的钙动态变化。同时，通过表达光敏感通道蛋白（如 ChR2）实现对目标神经元的光遗传学激活或抑制。通过同步控制成像与光刺激参数，可在毫秒至秒级时间尺度上解析神经回路的功能连接与动态响应特性。该技术适用于研究感觉处理、学习记忆、决策行为等复杂脑功能的神经机制。关键步骤包括：病毒介导的基因递送、颅窗植入、显微镜校准、动物行为训练及数据采集与分析。实验中需严格控制激光功率、成像深度与光刺激强度，以避免组织光损伤并确保信号特异性。数据分析通常采用运动校正、信号去噪、事件检测与功能连接网络构建等流程。该方法的优势在于兼具细胞分辨率与深层组织成像能力，可在自然行为过程中揭示神经元集群的活动模式。 双光子钙成像，光遗传学，神经元活动，自由活动小鼠，活体成像，功能连接，GCaMP，ChR2²⁺ 成像与膜片钳电生理技术可用于研究树突Ca²⁺ 急性脑切片中神经.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
动物品系：小鼠 CD1	Charles River	022
异氟烷	AbbVie Corporation	0B506-099
CGP 55845 盐酸盐	Abcam	ab120337
氯化钙	Sigma-Aldrich	C4901
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
氯化镁	Sigma-Aldrich	M8266
七水合硫酸镁	Sigma-Aldrich	230391
多聚甲醛粉末，95%	Sigma-Aldrich	158127
氯化钾	Sigma-Aldrich	P3911
葡萄糖酸钾	Sigma-Aldrich	P1847
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	S2002
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S8875
氯化钠	Sigma-Aldrich	S5886
蔗糖	Sigma-Aldrich	S9378
曲拉通 X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Trizma 碱	Sigma-Aldrich	T1503
Trizma 盐酸盐	Sigma-Aldrich	T3253
磷酸氢二钠二水合物	Sigma-Aldrich	71643
磷酸二氢钠 一水合物	Sigma-Aldrich	S9638
生物胞素	Sigma-Aldrich	B4261
Alexa Fluor 594 肼	ThermoFisher Scientific	A10438
SR95531 (加巴津)	Abcam	ab120042
三磷酸腺苷 (ATP)-Tris	Sigma-Aldrich	A9062
鸟苷 (GTP)-Na+	Sigma-Aldrich	G8877
俄勒冈绿 BAPTA-1	ThermoFisher Scientific	O6812
磷酸肌酸二(Tris)盐	Sigma-Aldrich	P1937
链霉亲和素偶联 Alexa-546	ThermoFisher Scientific	S11225
膜片钳硼硅酸盐玻璃毛细管	World Precision Instruments	1B100F-4
双通道硼硅酸盐玻璃毛细管	Sutter Instrument	BT-150-10
P-97 Flaming/Brown 微电极拉制仪	Sutter Instrument
TCS SP5 共聚焦多光子显微镜	Leica Microsystems
Chameleon Ultra II 钛宝石多光子激光器	Coherent
LAS AF 成像采集软件	Leica Microsystems
温度控制器 TC-324B	Warner Instruments
MultiClamp 700B 放大器	Molecular Devices
Digidata 1440A 数字转换器	Molecular Devices
共聚焦位移器	Siskiyou
微操纵器	Siskiyou
pClamp 数据采集软件	Molecular Devices
A365 恒流刺激隔离器	World Precision Instruments
Vibraplane 光学平台	Kinetic Systems