我们介绍一种结合全细胞膜片钳记录与双光子成像的方法，用于在急性脑片中的神经元树突内记录 Ca2+ 瞬变。
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摘要
摘要
钙（Ca2+）成像是一种强大的工具，可用于研究神经元树突中细胞内Ca2+信号的时空动态。Ca2+波动可通过多种膜和细胞内机制产生，在突触可塑性的诱导和树突兴奋性的调控中发挥关键作用。因此，记录树突分支中不同类型Ca2+信号的能力，对于研究树突如何整合信息的研究团队具有重要价值。双光子显微镜的出现通过解决活体组织成像中固有的问题（如光散射和光损伤），使此类研究显著变得更容易。此外，通过将传统的电生理技术与双光子Ca2+成像相结合，可以同时研究神经元树突中的局部Ca2+波动以及胞体的突触活动记录。本文描述了如何利用该方法研究GABA能抑制性中间神经元树突中局部Ca2+瞬变（CaTs）的动力学特性。该方法也可应用于急性脑片中不同类型神经元的树突Ca2+信号研究。
引言
神经元对网络活动的贡献在很大程度上取决于其接收的突触输入的动态特性。传统上，表征神经元突触活动的主要方法依赖于通过电刺激穿行轴突诱发突触后电流，并采用胞体全细胞膜片钳记录来检测这些电流。然而，这种方法仅能真实反映靠近胞体的近端突触的活动情况1此外，为了评估突触特异性机制，研究人员采用成对神经元记录以及特定位置的树突记录，分别针对感兴趣的突触和树突整合机制进行研究。突触生理学领域的一项重大突破源于光学技术与电生理技术的结合。双光子激发激光扫描显微镜（2PLSM）与Ca2+ 成像与光遗传学工具可揭示脑切片中特定神经元连接处突触活动动态组织的丰富细节 体外 和 体内.
双光子激光扫描显微镜（2PLSM）相较于传统的单光子激发显微镜具有几项关键优势2：（1）由于双光子激发具有非线性特性，荧光仅在焦平面体积内产生，所有发射的光子均为有效信号（无需使用针孔）；（2）2PLSM所采用的较长波长能更有效地穿透散射组织；此外，散射后的光子能量过于分散，无法引发双光子激发，因而不会产生背景荧光；（3）光损伤和光毒性也仅局限于焦平面。因此，尽管双光子系统的成本高于传统共聚焦显微镜，2PLSM仍是研究厚活体组织中神经元结构与功能的首选高分辨率成像方法。
双光子激光扫描显微镜（2PLSM）在散射组织中的首个应用是成像树突棘的结构与功能3。结合钙离子（Ca2+）成像技术，2PLSM揭示了树突棘作为独立生化区室的功能。由于在许多类型的神经元中，树突棘与单个突触之间存在一一对应关系4，双光子Ca2+成像很快成为报告完整组织中单个突触活动的有效工具5,6,7,8。此外，基于2PLSM的Ca2+成像已成功用于监测单个钙通道的活动、固有电导与突触电导之间的非线性相互作用，以及评估神经元树突中Ca2+信号传导的状态依赖性和活动依赖性调控5,6,7,8,9,10,11。
钙是一种普遍存在的细胞内第二信使，其亚细胞水平上的时空分布决定了生理反应的方向，从突触强度的变化到离子通道的调控、树突和树突棘的生长，以及细胞死亡与存活均受其影响。树突内钙离子（Ca2+）浓度的升高可通过多种途径实现。动作电位（AP）逆向传播至树突，激活电压门控钙通道12，在树突和树突棘中产生相对广泛的Ca2+瞬变（CaTs）13。突触传递则与突触后Ca2+可通透性受体（如NMDA受体、Ca2+可通透性AMPA受体和红藻氨酸受体）的激活相关，从而触发突触部位的CaTs6,14,15。最后，在特定条件下，树突中还可产生超线性的Ca2+事件11,12,13,16。
双光子钙成像2+ 成像技术与膜片钳电生理记录相结合，采用合成Ca2+-敏感的荧光指示剂，通常在全细胞记录期间通过膜片电极递送。一种标准的Ca²⁺定量方法2+ 动力学基于双指示剂方法17,18使用两种发射光谱分离良好的荧光染料（例如，一种红色Ca的组合2+-对钙不敏感的绿色染料2+ 指示剂（如 Oregon Green BAPTA-1 或 Fluo-4）相比，该方法具有多项优势。首先，一种 Ca2+-不敏感染料用于定位感兴趣的微小结构（树突分支和树突棘），在这些位置进行 Ca2+ 将进行成像。其次，计算绿色与红色荧光变化的比值（ΔG/R），作为[Ca2+]，该指标对因[Ca2+]017,18此外，荧光变化可被校准为绝对Ca²⁺浓度的变化。2+ 浓度19.
在急性脑片中进行双光子Ca2+成像实验时，一个普遍关注的问题是由于通常需要使用高激光功率，可能导致细胞健康状况下降以及图像采集的稳定性降低。此外，在Ca2+成像实验中，还存在因Ca2+指示剂本身作为高移动性的外源性Ca2+缓冲剂，可能干扰细胞内环境并显著高估亚细胞Ca2+动力学的担忧。因此，Ca2+指示剂的选择及其浓度取决于神经元类型、预期的CaT幅度以及具体的实验目的。
我们改进了双光子Ca2+成像方法，用于研究GABA能中间神经元树突中的Ca2+波动9,10,11,20,21,22。尽管早期大多数Ca2+成像研究集中在主神经元上，但抑制性中间神经元表现出多种与锥体细胞不同的功能性Ca2+机制20,23,24。这些中间神经元特异性的机制（例如，Ca2+通透性AMPA受体）可能在调控细胞活动方面发挥特定作用。尽管中间神经元树突中的Ca2+信号传导是极具吸引力的研究方向，但在这些细胞的树突中进行双光子Ca2+成像仍面临额外挑战，包括树突直径更细、缺乏树突棘以及内源性Ca2+结合能力特别高等问题。由于我们的研究兴趣集中于海马中间神经元，以下实验方案虽可适用于不同类型的神经元群体，但已针对上述挑战进行了相应优化。
本实验方案使用一台商用共聚焦双光子显微镜执行，该显微镜配备两个外部非降扫描探测器（NDDs）、电光调制器（EOM）和Dodt扫描梯度对比（SGC）装置，并安装在光学平台上。显微镜与一台钛宝石多光子激光器耦合，该激光器在800 nm处锁模（> 3 W，140 fs脉冲，80 Hz重复频率）。成像系统配备标准电生理设备，包括带温度控制的灌流腔室、带有两个微操纵器的可移动平台、计算机控制的微电极放大器、数字化仪、刺激单元和数据采集软件。
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方案
所有实验均遵循拉瓦尔大学动物保护委员会和加拿大动物护理委员会的动物福利指南进行。
1. 初步准备（可选：提前1天准备）
- 配制三种人工脑脊液（ACSF）溶液（正常溶液、蔗糖溶液和恢复溶液，每种各1 L；见 表1）。将溶液的渗透压调节至 300 ± 10 mOsm25 并将 ACSF-蔗糖溶液冷却至接近冰点（0-4 °C).
注意：使用低钠切割液（ACSF-Sucrose）有助于保持急性脑片浅层神经元的活性26. - 配制含有红色荧光染料的0.75 mL膜片溶液（例如，Alexa-594）和一种绿色合成钙离子指示剂（例如，Oregon Green BAPTA-1；参见 表1）。加入生物胞素（biocytin，参见 表1) 若在膜片溶液中 事后检验 记录细胞的形态学鉴定是必需的。
- 将溶液的渗透压调节至280 ± 5 mOsm，pH值调节至7.35 ± 0.5。溶液应始终保存在冰箱中或置于冰上。
注意：钙指示剂的选择应基于其动态范围以及所研究的 Ca2+ 事件。 - 使用微电极拉制仪，从硼硅酸盐玻璃毛细管制备膜片钳电极（参见 材料表）与一个 ≈ 2 µm 尖端（移液管电阻为3-5 MΩ）以及由硼硅酸盐θ玻璃毛细管制成的刺激移液管（参见 材料表）与2-5 µm 尖端
注意：拉制特定直径和形状的移液管时，拉制仪的设置参数将取决于拉制仪灯丝类型以及特定玻璃类型的斜率测试结果。
2. 海马脑片制备
- 将异氟烷（1 mL）滴加到吸入麻醉室内的纸巾上，对小鼠（P13-20；小鼠品系和性别由具体实验问题决定）进行麻醉。当动物进入深度麻醉状态（表现为无自主运动且呼吸缓慢）后，将其从麻醉室中取出，并使用断头器进行断头。
- 用小型剪刀从颅骨后部沿中线剪开皮肤至鼻部以暴露颅骨。使用小型骨钳在冠状缝前囟水平处打孔，然后沿矢状缝由尾侧向头侧剪开颅骨。用骨钳夹住两侧颅骨瓣的后缘，向上及向外抬起，移除覆盖半球的颅骨。
- 完全暴露脑组织后，用小型刮匙切断视神经根部。将脑组织从颅腔中取出，并置于盛有持续充氧的冷蔗糖人工脑脊液（ACSF-Sucrose）的培养皿中（蔗糖浓度见表1）。
- 若需获取较年长小鼠的组织，在取出脑组织前应通过心脏灌注的方式，使用装有20 mL冰冻ACSF-Sucrose溶液的注射器（25G针头）进行灌注，以获得高质量的脑片。
- 从小鼠脑组织中制备海马脑片。
- 将脑组织在冰上冷却约2分钟。在装有冰袋的培养皿中放置一张滤纸，将脑组织转移至滤纸上，分离两个半球。
- 将分离后的脑半球（根据实验目的确定方向，以获取冠状面、横断面或水平面脑片）粘附于振动切片机载物台上，并浸入充满冰冻且充氧ACSF-Sucrose溶液的切片槽中。使用振动切片机冷却装置或在切片槽周围放置冰块，维持温度约1 °C，切出厚度为300 µm的脑片。
- 用扁平画笔将含有海马结构的脑片（每侧半球最多6片）收集至盛有37 °C充氧ACSF恢复液（ACSF-Recovery）的孵育槽中。
- 将脑片在ACSF-Recovery孵育液中至少静置45分钟。
3. 全细胞膜片钳记录
- 将海马脑片置于激光扫描双光子显微镜物镜（放大倍数：40x，数值孔径：0.8）下方的浴槽中。持续用30–34 °C加热的含氧正常人工脑脊液（ACSF-Normal）灌流浴槽。32 °C 以2.5–3 mL/min的流速。
- 使用红外微分干涉差（IR-DIC）或Dodt-SGC显微镜，根据细胞的大小、形状和位置来定位目标细胞。
注意：根据目标神经元群体的不同，可使用转基因小鼠模型以方便定位目标细胞。在此情况下，该步骤可用荧光光源替代。 - 用含有红色荧光染料的正常人工脑脊液（ACSF-Normal）溶液填充刺激电极例如，Alexa-594)
- 将刺激电极（连接至电刺激仪）置于脑片上方，使电极尖端位于目标细胞所在区域。
- 用灌注了膜片钳溶液的膜片钳电极连接至电极夹持器后，将其置于脑片上方，使电极尖端正对目标细胞。
- 将注射器安装到三通旋塞上，并通过塑料管与膜片钳电极相连。使用注射器向膜片钳电极内持续注入正压（约 0.1 mL）。保持旋塞处于“关闭”位置。
- 启动放大器控制软件模块，通过点击“VC”按钮切换至电压钳模式。打开电生理数据采集软件（例如，使用clampex采集电生理信号，点击“Membrane Test”图标，使其持续输出方波电压脉冲（5 mV，10 ms），以监测移液管电阻的变化。
- 将膜片钳电极移至目标细胞正上方。当电极与细胞膜接触后，通过将旋塞转至“开放”位置来解除压力。
注意：当观察到移液管电阻出现微小增加（≈ 0.2 MΩ）并因正压在细胞上产生轻微压痕时，即表示已接触到细胞膜。 - 使用连接在旋塞上的空注射器对膜片钳电极施加轻微负压，直至软件显示的电极电阻达到1 GΩ。在数据采集软件的“膜片测试”窗口中，将细胞钳制在-60 mV。
- 持续施加负压，直至细胞破裂并形成全细胞记录模式。该细胞状态的检测依据是移液管电阻的突然变化（从1 GΩ降至70–500 MΩ，具体数值取决于中间神经元类型）以及“膜测试”窗口中出现较大的电容瞬变信号。
4. 双光子 Ca2+ 成像
- 如果关注兴奋性突触后反应，加入 GABAA 受体阻断剂加巴青（10 µM) 和 GABAB 受体阻断剂 CGP55845（2 µM在ACSF浴液中。
- 在放大器控制软件模块中，通过点击“CC”按钮将膜片钳配置设为电流钳模式，记录细胞在胞体注入去极化电流（0.8–1.0 nA，1 s）时的放电模式。等待至少30分钟，使细胞充分填充膜片溶液中的指示剂。
注意：细胞的放电模式和活性特征可用于鉴定细胞亚型； 例如，快速放电细胞。在开始记录钙瞬变（CaTs）之前，需等待指示剂浓度通过扩散达到稳定（参见 表2 用于故障排除。 - 动作电位诱发的钙瞬变
- 使用图像采集软件开始采集图像。利用红色荧光信号定位感兴趣的树突。为确保产生可见的反应，首先选择一段近端树突（≤ 50 µm因为GABA能中间神经元中动作电位逆向传播的效率可能随距离增加而显著下降22.
- 使用图像采集软件中的“矩形工具”，放大目标区域，并切换到“xt （线扫描）模式。将扫描线定位在目标树突分支上。通过采集软件中的激光强度控制器，将双光子激光功率设置在基线绿色荧光刚好可见的最低水平，以避免光毒性。
- 在电生理数据采集软件的“Protocol”窗口和图像采集软件中，创建一个所需持续时间的记录试验，其中包含所需幅度的胞体电流注入。
- 使用图像采集软件，点击“开始记录”按钮，持续采集荧光信号1-2秒。重复图像采集3-10次。单次扫描之间至少间隔30秒，以避免光损伤。若在树突的不同位点进行多次线扫描采集，应以随机顺序进行，以消除顺序效应。
- 突触诱发的钙瞬变
- 使用红色荧光信号定位目标树突。
- 将刺激电极置于感兴趣树突上方的切片表面。缓慢将刺激电极下放至目标位置，尽量减少移动以避免干扰全细胞记录构型。将电极定位在距目标10-15 µm 从树突。
- 为了在无棘突的树突中可视化突触微区的位置，在图像采集软件中切换到“xt' （线扫描）模式，并将扫描线定位在目标树突分支上。
- 在电生理数据采集软件和图像采集软件的“协议”窗口中，创建一个记录实验，在实验开始后触发刺激单元。
- 使用采集软件，点击“开始记录”按钮，沿树突连续扫描1-2秒。重复采集3-5次，每次扫描之间间隔30秒，以防止光损伤。
注意：扫描时长可根据诱发事件的动力学进行调整，但应尽量缩短以避免光损伤（参见 表 2 用于故障排除。 - 在不同条件下重复步骤 4.5.5（例如，不同强度/持续时间的刺激，药理学阻断剂的引入 等等。）取决于所要解决的具体问题。
- 当细胞出现健康状况恶化的迹象时，停止数据采集：去极化电位低于 -45 mV，基线 Ca 水平升高2+ 水平，树突形态退化（例如，出泡、断裂；参见 表2 用于故障排除。
- 为获取细胞形态的初步信息并记录刺激电极的位置，需采集 Z-红色荧光通道中细胞的图像堆栈。使用采集软件中的“xyz 模式下，将上下堆栈限制设置为包含所有突起的整个细胞成像。将“步长”设为 1 µm 并使用“开始记录”按钮启动图像序列采集。
- 当 Z-stack 采集完成后，使用软件中的“最大投影”选项叠加 stack 的所有焦平面，并验证采集质量。然后，缓慢将膜片移液管从切片中撤出。
- 固定切片以 事后检验 形态学鉴定，使用扁头画笔迅速将切片从浴槽中取出，置于两张滤纸之间，放入盛有ACSF的培养皿中。将ACSF更换为4%多聚甲醛（PFA）溶液，并将培养皿置于 4 °C 室温或冰箱中过夜。
5. 用于记录细胞的事后形态学鉴定的免疫组织化学
注意：在 PFA 中固定过夜后，切片可保存在含叠氮化钠（0.5%）的磷酸盐缓冲液（PB）中，最长可保存 1 个月。
- 将切片置于含0.3% Triton X-100的Tris缓冲盐水溶液（TBS）中，洗涤4次，每次5–10分钟。
- 将切片置于含10%正常山羊血清（NGS）的TBS-Triton 0.3%溶液中孵育1小时。
- 将切片放入含1% NGS和链霉亲和素偶联荧光染料的TBS-Triton 0.3%溶液中例如，Alexa Fluor 546 标记的链霉亲和素，1:200）过夜孵育。
- 用 TBS 洗涤 4 次（每次 5–10 分钟）。
- 将切片置于显微镜载玻片上，使用共聚焦显微镜进行成像。为获得完整的细胞重建，需采集一系列 Z-堆栈（步长： 1 µm使用20倍物镜进行成像。对Alexa-546标记的样本进行成像时，采用543 nm激光激发，并使用515–560 nm检测滤光片组。
6. 钙瞬变分析
- 从红绿双通道的线扫描图像中提取感兴趣区域（ROIs）的荧光值，并对每种条件下的多次重复实验结果取平均值，以降低噪声。
注意：当沿树突进行线扫描采集时，可从多个感兴趣区域（ROIs）提取数据，这些区域可能对应树突微区（2–5 µm），从而能够研究 Ca2+ 信号的区室化特征。 - 对于每个 ROI，将 Ca2+ 振幅的变化表示为：
注意：其中 G 为绿色通道的荧光值；G0 为刺激前时期绿色通道的基线荧光值；R 为红色通道的荧光值18。由于双光子激发具有高度局部化特性，不会产生显著背景信号，因此无需扣除背景荧光。
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结果
采用本方案，我们记录了海马CA1区oriens/alveus中间神经元在胞体电流注入以及树突电刺激条件下诱发的钙瞬变（CaTs）。在对神经元形成封接后，根据其形态和位置进行识别，我们对近端树突在多个位点进行线扫描，这些位点位于距胞体不同已知距离处（图1A）。我们观察到，随着距胞体距离的增加，由逆向传播的动作电位（AP）诱发的CaT幅度逐渐减小（提示动作电位幅度降低或钙通道分布呈距离依赖性下降，图1B）。在完成免疫组织化学染色（使用链霉亲和素偶联的Alexa Fluor 546）后，我们成功回收了该细胞的生物胞素标记，并将所记录的神经元鉴定为双层细胞，其轴突分布于stratum oriens和stratum radiatum（图1C）。在第二项实验中，将刺激电极置于远端树突位置。沿树突进行扫描，我们能够评估特定树突分支在轴突通路电刺激下产生的突触后Ca2+信号幅度（
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讨论
此处展示的方法表明，双光子钙成像与光遗传学技术相结合，可实现对自由活动小鼠大脑中神经元活动的高时空分辨率记录与精确操控。该方法利用双光子显微镜穿透散射组织的能力，结合基因编码钙指示剂（如 GCaMP）标记特定神经元群体，从而在活体动物中实时监测神经元群体的钙动态变化。同时，通过表达光敏感通道蛋白（如 ChR2）实现对目标神经元的光遗传学激活或抑制。通过同步控制成像与光刺激参数，可在毫秒至秒级时间尺度上解析神经回路的功能连接与动态响应特性。该技术适用于研究感觉处理、学习记忆、决策行为等复杂脑功能的神经机制。关键步骤包括：病毒介导的基因递送、颅窗植入、显微镜校准、动物行为训练及数据采集与分析。实验中需严格控制激光功率、成像深度与光刺激强度，以避免组织光损伤并确保信号特异性。数据分析通常采用运动校正、信号去噪、事件检测与功能连接网络构建等流程。该方法的优势在于兼具细胞分辨率与深层组织成像能力，可在自然行为过程中揭示神经元集群的活动模式。 双光子钙成像，光遗传学，神经元活动，自由活动小鼠，活体成像，功能连接，GCaMP，ChR22+ 成像与膜片钳电生理技术可用于研究树突Ca2+ 急性脑切片中神经...
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披露
作者不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。
致谢
本工作由加拿大卫生研究院、自然科学与工程研究理事会（NSERC 发现基金）以及萨沃伊基金会资助。OC 获得了 NSERC 提供的博士研究生奖学金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 动物品系：小鼠 CD1 | Charles River | 022 | |
| 异氟烷 | AbbVie Corporation | 0B506-099 | |
| CGP 55845 盐酸盐 | Abcam | ab120337 | |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| 七水合硫酸镁 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 多聚甲醛粉末，95% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| 葡萄糖酸钾 | Sigma-Aldrich | P1847 | |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 曲拉通 X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trizma 碱 | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trizma 盐酸盐 | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| 磷酸氢二钠二水合物 | Sigma-Aldrich | 71643 | |
磷酸二氢钠 一水合物 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| 生物胞素 | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Alexa Fluor 594 肼 | ThermoFisher Scientific | A10438 | |
| SR95531 (加巴津) | Abcam | ab120042 | |
三磷酸腺苷 (ATP)-Tris | Sigma-Aldrich | A9062 | |
鸟苷 (GTP)-Na+ | Sigma-Aldrich | G8877 | |
俄勒冈绿 BAPTA-1 | ThermoFisher Scientific | O6812 | |
磷酸肌酸二(Tris)盐 | Sigma-Aldrich | P1937 | |
链霉亲和素偶联 Alexa-546 | ThermoFisher Scientific | S11225 | |
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