脑切片神经元树突的双光子钙成像

神经元对网络活动的贡献在很大程度上取决于它所接受的突触输入的动态性质。传统上, 神经元突触活动特征的主要方法依赖于通过电刺激通道轴突引起的突触后电流的体细胞全细胞膜片钳记录。但是, 在这种情况下, 只有下部定位突触的活动才会如实地报告为¹。此外, 为了评估突触特定机制, 在特定位置对神经元和树突的记录被用来瞄准感兴趣的突触和树突整合的机制。通过光学和电生理技术的联姻, 在突触生理学领域取得了重大突破。双光子励磁激光扫描显微镜 (2PLSM) 结合 Ca^{2 +}成像和 optogenetic 工具可以揭示在脑切片中特定神经元连接的突触活动动态组织的巨大细节在体外和在体内。

2PLSM 从传统的单光子励磁显微镜中脱颖而出的几个关键优势: (1) 由于双光子激发的非线性性质, 荧光只在焦体积中产生, 所有发射的光子都代表了有用的信号 (不需要针孔);(2) 较长的波长, 用于 2PLSM, 更有效地穿透散射组织;此外, 分散的光子太稀, 无法产生双光子激发和背景荧光;(3) 光损伤和毒性也限于焦平面。因此, 尽管与传统共焦显微镜相比, 2 光子系统的成本很高, 但2PLSM 仍然是高分辨率研究厚活组织神经元结构和功能的一种选择方法。

2PLSM 在散射组织中的第一次应用是对树突状棘的结构和功能的图像³。2PLSM 结合 Ca^{2 +}影像显示, 棘状功能作为隔离的生物化学隔间。由于在许多神经元类型中, 棘和单个突触之间存在一对一的对应关系⁴, 双光子 Ca^{2 +}成像很快成为报告完整组织⁵中单个突触活动的有用工具, ^6,7,8。此外, 2 plsm Ca^{2 +}成像成功地用于监测单钙通道的活动和内在和突触电导之间的非线性相互作用, 以及评估状态和活动依赖性管理 Ca^{2 +}信号在神经元树突^{5,6,7,8,9,10,11}。

钙是一种无处不在的胞内第二信使, 其亚细胞时空组织决定了生理反应的方向, 从突触强度的变化到离子通道、枝晶和脊柱生长的调节, 作为以及细胞死亡和生存。树突状 Ca^{2 +}海拔通过激活多个通路而发生。动作电位 (APs), backpropagating 到树突, 开放电压门控钙通道¹²和产生相对全局 Ca^{2 +}瞬变 (猫) 在树突和刺¹³。突触传输与突触后 Ca 的激活相关联^{2 +}-渗透性受体 (NMDA, Ca^{2 +}渗透 AMPA 和 kainate), 触发突触猫^6,14,15。最后, supralinear Ca^{2 +}事件可在特定条件下的树突中生成^11,12,13,16。

双光子 Ca^{2 +}成像与膜片钳电生理记录结合使用合成 Ca^{2 +}敏感荧光指示器, 通常通过补丁电极在整个细胞记录中传递.用于量化 Ca^{2 +}动态的标准方法基于双指示器方法¹⁷¹⁸。它使用两个具有良好分离发射光谱的显影 (例如), 将红色 ca^{2 +}不敏感染料与绿色 ca^{2 +}指示器 (如俄勒冈州绿色 BAPTA-1 或 Fluo-4) 的组合, 与单指示器方法。首先, ca^{2 +}不敏感的染料用于定位小的兴趣结构 (树突状分支和刺), 其中将执行 ca^{2 +}成像。其次, 绿色和红色荧光 (ΔG) 的变化之间的比值被计算为 [ca^{2 +}] 的度量值, 对于基线荧光的变化, 由于 [ca^{2 +}]₀¹⁷中的波动, 它基本上不敏感。^,18. 此外, 荧光变化可以用绝对 Ca^{2 +}浓度¹⁹来校准。

当运行双光子 Ca^{2 +}成像实验的急性切片是一个普遍关注的是细胞健康和图像获取的稳定性, 由于高激光功率通常使用。此外, 在 ca^{2 +}成像实验中, 由于 ca^{2 +}指示器充当高度移动外源 ca^{2 +}的事实, 对亚细胞 Ca^{2 +}动态的摄动和大量高估感到担忧。缓冲区.因此, Ca^{2 +}指示器的选择及其浓度取决于神经元类型、猫的预期振幅和实验问题。

我们 修改了双光子 Ca^{2 +}成像方法, 以调查 GABAergic 中间神经元9、10、11、20、21的树突中 ca² + 的波动情况.^,22. 虽然早期 Ca^{2 +}成像研究的大部分都是在主神经元中进行的, 但抑制性中间神经元展示了不同于锥体细胞20的功能 Ca² + 机制.^,23,24. 这些 interneuron 特定的机制 (例如、Ca^{2 +}可渗透 AMPA 受体) 可能在调节细胞活动方面发挥特定作用。虽然树突状 Ca^{2 +}信号在中间神经元是一个诱人的目标进一步调查, 双光子 Ca² + 成像在这些细胞的树突提出了额外的挑战, 从更薄的树枝直径和缺乏刺一个特别高的内生 Ca^{2 +}绑定容量。由于我们的研究兴趣集中在研究海马中间神经元, 下面的协议, 虽然适用于不同的神经元群体, 适应于应对这些挑战。

该协议是用商业共焦双光子显微镜执行的, 配备两个外部的非 descanned 探测器 (NDDs)、电光调制器 (EOM) 和 Dodt 扫描梯度对比 (SGC), 并安装在光学表上。显微镜与钛: 蓝宝石多光子激光模式锁定在 800 nm (> 3 W, 140 fs 脉冲, 80 赫兹重复率)。该成像系统配备了一个标准的电生理平台, 包括一个温度控制的灌注室, 一个两个并联的翻译平台, 一个电脑控制的微电极放大器, 数字化仪, 刺激单元和数据采集软件。

所有的实验都是按照大学的动物保护委员会和加拿大动物保育理事会的动物福利准则进行的。

1. 初步准备 (可选: 提前1天准备)

1. 准备三种类型的人工脑脊液 (ACSF) 溶液 (正常, 蔗糖和恢复解决方案, 1 升每一个; 请参见表 1)。调整溶液的渗透到 300 10 mOsm²⁵和冷却 ACSF 蔗糖下降到一个接近冰点 (0-4 °c)。
   注: 使用低钠切削液 (ACSF 蔗糖) 有助于保持急性切片的表面层神经元的生存能力²⁶。
2. 准备0.75 毫升的补丁解决方案, 其中包含红色荧光 (例如, Alexa-594) 和绿色合成钙指示器 (例如, 俄勒冈绿色 BAPTA-1; 请参见表 1)。在修补程序解决方案中包括 biocytin (请参见表 1), 如果需要后端对记录的单元格进行形态学标识。
3. 将溶液的渗透压调整到 280, 5 mOsm 和 pH 值7.35 到0.5。随时把溶液放在冰箱或冰上。
   注: 钙指示器的选择应基于其动态范围和调查的 Ca^{2 +}事件的性质。
4. 使用微拉拔器, 从硼硅酸盐玻璃毛细血管 (参见材料表) 中制备贴片吸管, ≈2µm 尖 (3-5 MΩ的吸管阻力) 和硼硅酸盐θ玻璃毛细血管的刺激吸管 (见材料) 与2-5 µm 提示。
   注: 为使给定直径和形状吸管的拉拔器设置将由拉拔灯丝类型和给定类型的玻璃的坡道测试结果决定。

2. 海马切片制备

1. 麻醉鼠标 (P13-20; 鼠标的应变和性别取决于正在处理的实验问题), 将1毫升异氟醚置于吸入麻醉腔内的纸巾上。当动物被深深的麻醉, 如缺乏运动和缓慢的呼吸的证明, 从麻醉室和斩首使用断头台删除。
2. 用一把小剪刀从头骨的后部切开到鼻子, 露出头骨。使用一小对迷你骨 rongeurs, 使一个洞在 bregma 水平。然后用剪刀做一个沿矢状缝合的延髓切口。与 rongeurs 抓住每个头骨皮瓣的背面和向上和向外抬起, 以消除头骨覆盖每个半球。
3. 当大脑完全暴露后, 用小铲子把视神经咬倒。从头骨中取出大脑, 将其放入含有连续氧、冷 ACSF 蔗糖的培养皿中 (请参阅表 1以了解蔗糖浓度)。
   1. 如果需要大鼠的组织, 在脑提取前用注射器 (25G) 填充20毫升的冰冷 ACSF, 进行心内灌注, 以获得优质切片。
4. 从提取的动物大脑中制备海马切片。
   1. 让大脑冷却大约2分钟. 将一张滤纸放在一个冰包装的培养皿上, 将大脑转移到滤纸上。解剖两个半球。
   2. 胶水的解剖半球 (方向是由实验目标确定, 以获得冠状, 横向, 或水平切片) 到 vibratome 表, 并浸入到 vibratome 托盘充满冰冷氧 ACSF-蔗糖。使用 vibratome 冷却器或将冰放在 vibratome 托盘周围, 使300µm 厚片在大约1摄氏度的温度下。
   3. 使用平漆刷, 在含有含氧 ACSF 的浴缸中积累含有海马体 (每半球多达6片) 的切片, 加热到37摄氏度。
   4. 将切片放在 ACSF 回收浴中至少45分钟。

3. 全细胞膜片钳录音

1. 在目标 (放大: 40x, 数值孔径: 0.8) 的激光扫描双光子显微镜下放置一个海马片。持续灌注的氧 ACSF-正常加热30-32 摄氏度的浴缸, 速度为 2.5-3 毫升/分钟。
2. 使用红外差分干涉对比 (IR-DIC) 或 Dodt-SGC 显微镜, 以找到一个感兴趣的细胞使用其大小, 形状和位置。
   注意: 根据目标神经元的数量, 转基因小鼠模型可以用来方便地定位感兴趣的细胞。在这种情况下, 这个步骤可以取代使用荧光光源。
3. 用含有红色荧光 (例如、Alexa-594) 的 ACSF 正常溶液填充刺激吸管。
4. 将刺激吸管 (连接到电刺激单元) 放在切片的顶端, 以便尖端与感兴趣的单元位于同一区域。
5. 在用补丁解决方案填充贴片吸管并将其附加到头部阶段后, 将其放在切片上, 使其尖端直接位于感兴趣的单元上方。
6. 将注射器放入三路旋塞阀, 通过塑料管将其连接到贴片吸管。使用注射器向贴片吸管 (≈0.1 毫升) 注入恒定的正压。保持旋塞阀在 "关闭" 位置。
7. 激活放大器控制软件模块, 并通过点击 "VC" 按钮切换到电压钳模式。打开电生理学数据采集软件 (例如, clampex) 获取电生理信号, 并点击 "膜测试" 图标, 使其不断发送一个平方电压脉冲 (5 mV, 10 毫秒), 这是必要的监测吸管阻力的变化。
8. 降低贴片吸管, 直到它正确地放在目标单元格的顶端。当与细胞膜接触时, 通过将旋塞阀转变为 "打开" 位置来消除压力。
   注: 当发现吸管阻力 (≈ 0.2 MΩ) 小增加时, 检测到细胞膜的接触, 而细胞内的小凹痕是由正压引起的。
9. 使用一个空注射器安装在旋塞阀, 直到该软件提供的吸管阻力达到 1 GΩ, 对贴片吸管施加轻微的负压。在数据采集软件的 "膜测试" 窗口中, 将单元格夹紧-60 mV。
10. 继续应用负压, 直到打开单元格并实现全细胞配置。这种细胞状态的检测是基于在 "膜测试" 窗口中的吸管电阻 (从 1 GΩ到 70-500 MΩ的变化) 和大电容瞬态的出现而发生的突变。

4. 双光子 Ca^{2 +}成像

1. 如果对兴奋后突触反应感兴趣, 添加 gaba_A受体阻滞剂 gabazine (10 µM) 和 gaba_B受体阻滞剂 CGP55845 (2 µM) 在 ACSF 浴。
2. 在放大器控制软件模块中, 通过点击 "CC" 按钮将补丁配置设置为电流钳, 并记录细胞的射击模式, 以响应去极化型电流 (0.8-1.0 nA, 1 s) 的体细胞注射。等待至少30分钟的单元格, 以填充修补程序解决方案中存在的指示器。
   注: 细胞的射击模式和活动性质可用于识别细胞的亚型;例如, 快速峰值单元格。在开始记录猫 (请参见表 2进行故障排除) 之前, 必须通过扩散来稳定指示器浓度。
3. AP 诱发的猫
   1. 使用图像采集软件, 开始获取图像。使用红色荧光信号定位感兴趣的枝晶。为确保可见的响应, 首先选择近端枝晶 (≤50µm), 因为 AP 反向的效率可能会随着 GABAergic 中间神经元22中的距离显著下降.
   2. 在图像采集软件中使用 "矩形工具", 放大目标区域并切换到 "xt" (linescan) 模式。将扫描定位在感兴趣的树枝状分支上。利用采集软件中的激光强度控制器, 将双光子激光器设置为最小的功率电平, 基线绿色荧光只是略微可见, 以避免毒性。
   3. 在电生理学数据采集软件 "协议" 窗口和图像采集软件中, 创建所需持续时间的记录试验, 其中包含所需振幅的体细胞电流注入。
      1. 使用图像采集软件, 单击 "开始记录" 按钮, 连续获取 1-2 s 的荧光. 重复图像采集3-10 次。在单扫描之间至少等待三十年代, 以避免光损伤。如果获得 linescans 沿枝晶的多个点, 采取随机顺序, 以避免秩序效应。
4. Synaptically 诱发猫
   1. 使用红色荧光信号定位感兴趣的枝晶。
   2. 将刺激吸管放在感兴趣的树枝上面的薄片表面上。慢慢降低刺激吸管到位, 尽量减少运动, 以避免扰乱整个细胞的配置。将吸管放置在10-15 µm 的枝晶上。
   3. 为了可视化突触 microdomains 在 aspiny 树突中的位置, 在图像采集软件中切换到 "xt" (linescan) 模式, 并将该线沿树突分支的兴趣点定位。
   4. 在 "协议" 窗口 (电生理学数据采集软件) 和图像采集软件中, 创建一个记录试验, 在试用开始后触发激励单元。
   5. 使用采集软件, 单击 "开始记录" 按钮, 连续沿枝晶扫描1-2 秒. 重复采集3-5 次, 在扫描之间等待三十年代以防止光损伤。
      注意: 扫描的长度可以根据诱发事件的动力学进行调整, 但应尽量减少以防止光损伤 (请参见表2 进行故障排除)。
   6. 重复步骤4.5.5 在不同的条件下 (例如, 不同的强度/长度的刺激, 引入药理阻滞剂,等) 取决于正在处理的具体问题。
   7. 停止获取时, 细胞显示健康状况恶化的迹象: 退极化低于-45 mV, 增加基线 Ca^{2 +}水平, 树突形态退化 (例如, 起泡, 碎片; 请参见表 2进行故障排除)。
   8. 要获取细胞形态学的初步信息并保存刺激吸管位置的记录, 请获取红色通道中单元格的Z堆栈。使用 "xyz"模式中的捕获软件, 设置上下堆栈限制, 以将包含的所有进程镜像到整个单元格。将 "步长" 设置为1µm, 并使用 "开始记录" 按钮启动堆栈获取。
   9. 当Z堆栈捕获完成时, 使用软件中的 "最大投影" 选项来叠加堆栈的所有焦点计划, 并验证获取的质量。然后, 慢慢地收回片中的补丁吸管。
   10. 要修复自组后形态学标识的切片, 请使用平面画笔从浴缸中快速移除切片, 然后将其放在两个滤纸之间, ACSF 填充的培养皿中。更换 ACSF 与4% 多聚甲醛 (粉煤灰) 解决方案, 并把盘子放在4°c 房间或冰箱过夜。

5. 免疫组化用于自组后形态学鉴定记录细胞

注: 在粉煤灰中固定1晚后, 切片可以储存在磷酸盐缓冲 (PB) 与叠氮化钠 (0.5%), 长达1月。

1. 将该切片放入三缓冲盐水溶液 (TBS) 与海卫 X-100 (0.3%), 并执行4洗涤 (每5-10 分钟)。
2. 将切片中的0.3% 与10% 正常山羊血清 (1 h)。
3. 把切片在 TBS-海卫0.3% 与1% 和链亲和素共轭荧光(例如, Alexa 氟546共轭链亲和素, 1:200) 过夜孵化。
4. 在 tb 上洗4次 (5-10 分钟)。
5. 使用共焦显微镜在显微镜下的幻灯片和图像上安装切片。要进行完整的单元重建, 请使用20x 目标获取Z堆栈 (步骤大小: 1 µm)。对于成像 Alexa-546-conjugated 标签, 使用 543 nm 激光和 515-560 nm 检测过滤器集。

6. 猫的分析

1. 从红色和绿色通道提取 linescan 图像中的感兴趣区域 (ROIs) 中的荧光值, 并平均每个条件的多次重复值以减少噪音。
   注意: 当沿枝晶进行 linescan 采集时, 可以从多个 ROIs 中提取数据, 这可能对应于树突 microdomains (2-5 µm), 从而允许对 Ca^{2 +}信号划分进行研究。
2. 对于每个 ROI, 将 Ca^{2 +}振幅中的更改表示为:
   
   注: 此处 G 为绿色通道的荧光值;G₀是在预刺激期内绿色通道的基线荧光值;R 是红色通道¹⁸的荧光值。由于双光子激发是高度局部化的, 不产生显著的背景, 因此不需要对背景荧光进行减法运算。

利用本文提出的协议, 我们获得了由体细胞电流注入诱发的猫, 并通过电刺激在海马 CA1 区 oriens/alveus 中间神经元树突。在对神经元进行修补后, 根据其形状和位置进行识别, 我们在给定距离的 linescans 上的多点处获得了一个近端枝晶 (图 1A)。我们观察到 backpropagating APs 引起的猫的振幅减少, 因为躯体的距离增加 (指示 AP 振幅减少或钙通道分布的距离依赖性下降,图 1B)。免疫组化后 (使用链亲和素共轭 Alexa 546), 我们能够检索 biocytin 标记的细胞和识别记录神经元作为一个 bistratified 细胞与轴突占据层 oriens 和地层 radiatum(图1C). 在第二个实验中, 一个刺激的吸管被带到远端树突状部位。扫描沿枝晶,然后我们能够评估突触后 Ca2 +信号在给定的树突状分支 (图 2AC) 的振幅, 以响应电刺激的通道轴突。突触的猫在相邻的树突状 microdomains (片段1到6之间不同);图 2D), 它可能与所涉及的启动和/或不同的突触后机制区域的 Ca2 +信号的传播相关联。

图 1: AP 诱发 Ca2 +瞬态的典型示例.(A) 填充了 Alexa-594 (20 µm) 的修补 interneuron 的双光子Z堆栈 (13 µm) 的最大投影。白色线条表示 linescans 的位置和长度。(B) 显示在 a. 顶端示踪部位引起的猫的痕迹显示在录音试验期间通过体细胞电流注射产生的短 AP 列车。在显示的所有痕迹上, 时间刻度是相同的。(C) 共焦Z堆栈的最大投影, 显示单元格的 biocytin 标记。O/A: Oriens/Alveus;PYR: 地层 Pyramidale;地层 Radiatum。请单击此处查看此图的较大版本.

图 2: 电刺激爆发引起的突触后 Ca2 +瞬态 (3 刺激在100赫兹).(A) 双光子Z堆栈 (148 µm) 的最大投影, 显示填充了 Alexa-594 的修补 interneuron。白色箭头指向金字塔层内轴突端子的位置, 表明 interneuron 是一个篮子细胞。(B) 单焦点平面, 用于说明激发电极所在的树枝状分支。虚线显示了显示在 (C1 和 C2) 中的 linescan 的位置。(C) 图像, 说明红色 linescan 的结果 (1;Alexa-594;20µM) 和绿色 (2;俄勒冈绿色 Bapta-5N;300µM) 渠道。这些图像被作废成较小的片段, 以分析响应的传播超过30µm. (D) 显示在 C2 中显示的段中引出的 Ca2 +瞬态 (猫) 的跟踪。顶部跟踪显示在成像试验期间, 在体细胞级记录的电刺激的电压响应。请单击此处查看此图的较大版本.

表 1: 解决方案食谱.协议中使用的解决方案的化合物和浓度。

表 2: 疑难解答表.在 Ca2 +成像实验过程中可能出现的常见问题的解决方案。

作者没有竞争的金融利益或其他利益冲突。