果蝇（Drosophila）卵巢是研究干细胞微环境发育的优良模型系统。尽管已有发表的幼虫和成体卵巢解剖方法，但蛹期卵巢的解剖需要不同的技术，且尚未有详细文献报道。本文中，我们概述了一种用于解剖、染色和封片蛹期卵巢的实验方案。
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摘要
摘要
与成年个体不同 果蝇 卵巢，蛹期卵巢由于体积小、半透明且被包裹在蛹壳内，较难获取和观察。解剖蛹期卵巢的难点还在于其在蛹体内的物理位置：卵巢被蛹腹部内的脂肪体细胞包围，必须去除这些脂肪细胞才能进行有效的抗体染色。为克服这些困难，本方案采用定制的巴斯德吸管从蛹腹部去除脂肪体细胞。此外，在染色过程中使用带腔室的盖玻片替代微量离心管，以提高蛹体的可视性。然而，尽管本方案所用工具具有上述及其他优势，由于蛹期卵巢体积微小，成功掌握这些技术仍可能需要数天的练习。本方案所述技术可应用于时间进程实验，用于分析蛹期不同发育阶段的卵巢。
引言
自首次记录到干细胞微环境以来，利用Drosophila卵巢开展的干细胞研究已得到广泛拓展1,2,3,4。随着谱系示踪遗传工具的发展，Drosophila卵巢解剖已被广泛用于研究干细胞谱系以及调控干细胞维持、增殖和命运决定的信号通路。对这些信号通路的认识可能有助于揭示起源于异常干细胞活动的癌症的潜在病因5,6,7。最近的研究还表明，Drosophila卵巢中的体干细胞性干细胞（即滤泡干细胞，FSCs）在组织结构的多个方面与哺乳动物肠道干细胞高度相似8。因此，Drosophila卵巢是研究干细胞行为的一个极为有用的模型系统。
虽然幼虫期和成虫期的卵巢分别提供了关于早期干细胞发育以及干细胞在微环境中最终组织结构的线索，但蛹期卵巢是一种中间结构，在此期间生殖系细胞和体细胞发生重排并确立其细胞身份9,10。尽管已有若干研究探讨了蛹期卵巢组织发育的某些方面10,11,12,13，但对于蛹期发育过程中卵巢各类细胞的分化及其空间组织方式仍存在未解问题。特别是，卵泡干细胞（FSCs）的特化过程即发生于该阶段。本实验方案概述了一种在特定时间点解剖并染色蛹期卵巢的方法——该技术可用于时间序列实验，以详细分析从幼虫期到成虫期的蛹期卵巢发育过程。
由于蛹期卵巢体积微小、半透明且位于蛹腹部深处难以触及，本实验方案采用了定制的细尖巴斯德移液管，以清除遮挡抗体进入卵巢的腹部脂肪体组织。在抗体染色过程中使用带孔的透明盖玻片腔室，可更清晰地观察蛹体，并为将卵巢置于"Nutator"上轻柔振荡提供稳定平台。参考Maimon与Gilboa14建立的幼虫卵巢解剖方案，本染色程序的初始步骤中采用了相对高浓度的Triton X-100，以最大程度增强细胞膜通透性，促进抗体进入卵巢细胞。
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方案
1. 产卵
- 将约十只雄性和十五只雌性具有目标基因型的成年黑腹果蝇（Drosophila）放入装有添加酵母的普通富营养果蝇培养基的小瓶中。为避免小瓶内过于拥挤，应控制交配后的雌蝇产卵时间不超过2–4小时14。
- 通过轻敲小瓶口与另一个含果蝇培养基的小瓶对接，将成虫转移至新小瓶中。将卵在室温下培养3–4天，使其发育为幼虫。
2. 选择雌性幼虫
- 使用带有柔软毛刷的湿润细刷，沿小瓶壁做滚动动作，将游走期三龄幼虫从小瓶转移至装满1×磷酸盐缓冲液（PBS）的玻璃孔板中。通过将幼虫转移至另一装有1× PBS的孔板中，清洗幼虫表面的食物残渣。
- 使用镊子分离雌雄幼虫。雄性幼虫可通过其身体侧面约从前端起三分之二处脂肪体中嵌入的一对大而圆且半透明的睾丸进行识别15。雌性幼虫平均体型较大，透明度低于雄性，其生殖腺较小，较难观察。
- 剔除雄性幼虫以收集雌性幼虫。从孔板中至少收集十只雌性幼虫，并将其放入另一个装有1× PBS的独立孔板中。
- 使用镊子将雌性幼虫轻柔地转移至含有新鲜果蝇饲料并添加酵母的新小瓶中。
- 将装有雌性幼虫的小瓶置于黑暗处，以促进化蛹16。在白天持续观察幼虫的化蛹情况。每当幼虫停止活动并发育为前蛹时，在小瓶上标记该前蛹，并记录其首次形成前蛹的大致时间。通过前气门的突出以及化蛹壳形成的时间来识别前蛹17。让前蛹发育至所需时间点（以化蛹壳形成后小时数，APF计）。
注意：在大约10小时内完成化蛹壳形成的个体均可视为前蛹。蛹期始于化蛹壳形成后约12小时，此时已完成一次内部蜕皮。
3. 准备受精蛹用于抗体染色
- 制作一根细玻璃移液管，用于后续步骤中清除蛹的脂肪体。
- 在本生灯上熔化巴斯德移液管的玻璃尖端。当玻璃熔化时，用镊子将尖端水平拉离移液管其余部分，以形成更细的尖端。
- 冷却后，折断移液管尖端的一小部分，形成一个整齐的圆形开口。在移液管的另一端连接一个吸球。
- 用移液器吸取1x PBS。
- 为了收集粘附在小瓶壁上的蛹，可在蛹与瓶壁的接触区域滴加少量水。等待1–2分钟，使蛋白质胶溶解，然后用湿润的细毛刷轻轻将蛹从瓶壁上剥离。将蛹转移至盛有1×PBS的玻璃小孔中，每个小孔仅放置一只蛹，以避免过于拥挤。
- 用一对镊子夹住蛹的后端，同时用另一对镊子小心撕开蛹壳的前部，直至蛹的头部露出。
- 用镊子夹住蛹头部最前端，轻轻将蛹从蛹壳中拉出。
注意：在此过程中，部分脂肪体可能会溢出。 - 将蛹的前半部分与后半部分分离并弃去，直至仅剩腹部囊状结构。
- 从腹部囊中提取脂肪体细胞。
- 用一只手用镊子夹住腹囊并抵住孔板底部，同时另一只手握住装有1×PBS的细玻璃移液管。
- 将细长的移液枪头对准囊状结构的开口，缓慢加入1×PBS冲洗液至腹部，以洗去围绕蛹期卵巢的脂肪体细胞。
注意：卵巢是一对小型、透明、有条纹的长椭圆形结构，应保留在腹囊内。 - 洗去脂肪体细胞，直至脂肪体减少至少三分之二，或直至在腹部囊口附近可见卵巢。此步骤必须缓慢操作，以防意外将卵巢冲出腹腔。
- 检查孔内，确认在脂肪体细胞清洗过程中卵巢是否已溢出。若在孔内不可见卵巢，则说明卵巢仍保留在腹部内。若卵巢已排出，需将新的蛹放入孔内，并重复此步骤。
- 将腹部转移至装有固定液（1x PBS，4%多聚甲醛）的透明盖玻片腔室中，并盖上盖子。为确保有足够数量的卵巢能够耐受染色和封片过程，解剖时应获取多于实际所需的卵巢样本。
注意：固定液中含有有毒的多聚甲醛。请佩戴适当的防护装备，如手套、护目镜， 等等.
4. 免疫组织化学
- 在整个染色过程中，使用镊子轻轻将漂浮的卵巢推至盖玻片孔的底部，以确保卵巢完全浸没在抗体溶液中。
- 将双面胶条贴在摇床上的平坦表面，然后将带孔的盖玻片放置在粘性表面上。
- 将卵巢在步骤 3.7 的固定缓冲液中于室温孵育 15 分钟。
- 用含 1% Triton X-100 的 1x PBS 分别清洗卵巢三次，时间分别为 5、10 和 45 分钟（总计 1 小时），以实现充分的通透处理。
- 在含 0.5% Triton X-100 的 1x PBS 中加入 10% 正常山羊血清，对卵巢进行封闭处理，孵育 30 分钟。
- 将卵巢在 4 °C 条件下，于 600 µL 含 0.5% Triton X-100 的 1x PBS 中与适当稀释浓度的目标一抗共同孵育过夜。
- 用含 0.5% Triton X-100 的 1x PBS 将卵巢清洗三次，每次 5 分钟。
- 将卵巢在室温下与 600 µL 含 0.5% Triton X-100 的 1x PBS 中适当稀释的二抗孵育 2 小时。
- 用含 0.5% Triton X-100 的 1x PBS 清洗卵巢两次，每次 5 分钟，再用 1x PBS 清洗一次，持续 5 分钟。
5. 解剖和制备蛹期卵巢
- 在载玻片上滴加一滴1x PBS。使用镊子将腔室盖玻片中的腹部囊转移到盛有1x PBS的玻璃孔中。每个蛹使用单独的孔，以避免孔内过于拥挤。
- 用镊子撕开腹部囊及任何残留的脂肪体。
注意：卵巢为一对微小、透明、有条纹且呈椭圆形的结构，应可在孔中观察到。卵巢通常被脂肪体紧密包裹，因此必须确保将所有脂肪体彻底撕碎。 - 用镊子夹住卵巢的中心部位，将卵巢从孔中转移至载玻片上的1x PBS液滴中。操作时需牢固夹持但不可挤压卵巢，以免在转移过程中丢失或损坏卵巢。若随时间推移溶液干燥，可向载玻片中补加数滴1x PBS。
- 待所有卵巢完成解剖并转移至载玻片后，用移液器吸取40 µL封片介质滴加至22 mm × 22 mm盖玻片上，然后轻轻将盖玻片覆盖在卵巢上方。将载玻片静置过夜干燥，之后进行成像。
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结果
成功执行本方案应获得清晰的抗体染色结果，以揭示黑腹果蝇（Drosophila）蛹期卵巢的结构及细胞组织特征。本方案所述的免疫组织化学方法可用于鉴定在幼虫和成虫卵巢中常见染色的细胞类型。图3展示了来源于游走细胞的蛹期卵巢 stalk 细胞（由白色轮廓标示的 Fasciclin III 标记）18。除了揭示蛹期卵巢的细胞组织结构外，针对细胞增殖的特异性抗体染色（如图3中显示的绿色磷组蛋白 H3 染色）还可用于研究干细胞及其他有丝分裂活跃细胞类型的细胞分裂模式。若在共聚焦显微镜下观察到荧光抗体信号较弱，可能是由于蛹腹部脂肪体去除不充分，导致卵巢未能充分接触抗体；另一种可能是在染色过程中蛹囊开口发生塌陷所致。
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讨论
本方案中最关键且最具挑战性的步骤是在固定前制备蛹期卵巢。为了确保位于蛹腹部内部、体积微小且被脂肪体细胞包裹的卵巢能够充分与抗体结合，不仅需要用镊子在腹部囊状结构上撕开一个较大的开口，还必须将遮挡卵巢的脂肪体细胞彻底清除，以避免其阻碍抗体的渗透。成功完成该步骤的关键在于，利用巴斯德吸管球冲洗腹部囊腔以去除脂肪体细胞时，需施加适度而精细的压力例如 每秒应有1–2个脂肪体细胞从腹部释放出来。若施力过轻，可能导致卵巢从腹部脱出并落入玻璃小孔中。由于卵巢本身体积小、呈半透明状，且难以用镊子夹取，因此在整个染色过程中必须始终保持在腹部组织囊内。因此，若在固定前的制备步骤中卵巢已从腹部脱出，则在后续实验流程中将极难对其进行回收、染色和封片操作。
脂肪体细胞主要由脂滴组成，是常见于昆虫（包括Drosophila melanogaster19,20）中的甘油三酯储存细胞器。由于固定时部分脂肪体细胞仍残留在蛹的腹部，本方案在前三个PBS清洗步骤中使用...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（D.K. 获资助号 RO1 GM079351）资助。我们感谢 Dorothea Godt 根据其原始实验方案在蛹期卵巢解剖方面提供的有益建议。同时感谢 Amy Reilein 在稿件撰写过程中提供的帮助和意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 杜蒙特 #5 镊子，生物学用 | 精细科学工具公司 | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek 带腔室盖玻片 | 赛默飞世尔科技 | 155383 | |
| 解剖显微镜 | 尼康 | SMZ-10A | |
| 共聚焦显微镜 | 卡尔·蔡司 | LSM 700 | |
| 分析软件 | 卡尔·蔡司 | Zen | |
| 9孔凹玻片 | 派热克斯 | 7220-85 | |
| 巴斯德移液管 | 费舍尔科学公司 | 13-678-6B | |
| 巴斯德移液管橡胶吸头 | 多个供应商 | ||
| 本生灯 | 多个供应商 | ||
| Fisherfinest 优质磨砂载玻片 | 赛默飞世尔科技 | 12-544-2 | |
| 22 × 22 mm 盖玻片，1号 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| 双面胶带 | Scotch | ||
| 旋转混匀仪（Nutator） | Clay Adams | ||
| 细毛刷 #0，#3-#5 | 多个供应商 | ||
| Gilson Pipetman 移液器入门套装 | Thomas Scientific | F167300 | 包含 p20、p200、p1000 移液器 |
| 16% 多聚甲醛 | 电子显微技术科学公司 | 15710 | 用 1× PBS 稀释至 4% 多聚甲醛 |
| 吐温-20（Triton） | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10× PBS | Ambion | AM9624 | 稀释为 1× PBS |
| 正常山羊血清 | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | 用含 0.5% Triton 的 PBST 稀释至 10% 正常山羊血清 |
| 一抗（实验方案中：7G10 抗 Fasciclin III 抗体，1:250 稀释；兔抗磷酸化组蛋白 H3 抗体，1:1000 稀释） | 多个供应商（实验方案中：发育研究杂交瘤库，Millipore） | 用含 0.5% Triton 的 PBST 稀释 | |
| 二抗（实验方案中：Alexa-546 标记、FITC 标记的抗兔血清） | 多个供应商（实验方案中：Molecular Probes，Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.） | 用含 0.5% Triton 的 PBST 稀释 | |
| 果蝇培养管 | Denville Scientific | V9406 | |
| 棉球，适用于宽口培养管 | Genesee Scientific | 51-102W | |
| 酵母，干活性面包酵母 | MP Biomedicals | 101400 | |
| 果蝇培养基 | 实验室自制 | 由水、啤酒酵母、玉米粉、糖蜜、琼脂、乙醇、青霉素、对羟基苯甲酸甲酯和丙酸混合而成 | |
| 雄性和雌性 Drosophila 果蝇（实验方案中使用的基因型：yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2） | 布卢明顿果蝇品系中心 |
参考文献
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