毛细管电聚焦法对蛋白质及其亚型的高灵敏度和定量检测

Summary

毛细管等电聚焦是一种基于抗体的、超灵敏的高通量技术, 它能够从极小的生物样品中详细描述蛋白质及其亚型。下面介绍了一种自动和机器人的方法, 用于检测和量化特定蛋白质及其亚型。

Abstract

免疫印迹法已成为许多实验室的常规技术, 用于从生物样品中进行蛋白质的表征。下面的协议提供了一种替代策略, 毛细管等电聚焦 (cIEF), 与传统的免疫印迹法相比有许多优点。这是一种基于抗体的、自动化的、快速的和定量的方法, 在超薄毛细管内发生完全的西方印迹过程。这种技术不需要凝胶转移到膜, 剥离的印迹, 或 x 射线胶片, 这是通常需要的常规免疫印迹法。在这里, 蛋白质被分离根据他们的充电 (电性点; pI), 使用少于微升 (400 nL) 总蛋白质裂解。电泳后, 蛋白质通过紫外线照射固定在毛细血管壁上, 其次是初级和次生 (辣根过氧化物酶 (HRP) 共轭) 抗体孵化, 通过增强的方法检测其结合化学发光 (ECL), 产生一个光信号, 可以捕获和记录的电荷耦合器件 (CCD) 相机。数字图像可以通过软件进行分析和量化 (峰值区域)。这个高吞吐量程序可以一次处理96个样本;高度敏感, 蛋白质检测在微量范围内;并产生高度可重复性的结果, 因为自动化。当样品数量 (例如组织样本和活检) 是一个限制因素时, 所有这些方面都非常有价值。该技术也有广泛的应用, 包括筛选药物或抗体, 生物标志物发现和诊断目的。

Introduction

毛细管电聚焦 (cIEF) 是一种基于毛细管的自动免疫分析法, 根据其电荷^1、2、3来解析蛋白质。它具有高度的重现性, 能够快速、定量地解决蛋白质及其后 translationally 修饰亚型。它提出了一种替代传统方法, 如西方印迹。虽然西方印迹是非常好的确认存在丰富的蛋白质在容易接近的样品;可变性、时间消耗和准确定量所有目前的挑战, 特别是在检查生物组织样本。事实上, 变异是西方印迹中的一个固有问题, 因为有许多步骤, 例如 SDS 页凝胶的装载和运行, 蛋白质转移到膜上, 用各种试剂孵化 (e., 初级和中级抗体, ECL), 并发展到 x 射线胶片⁴。目前, 随着化学发光信号 (数字西部) 数字记录的实施, 西方印迹技术正在得到改进。最近, 一个自动化的西方印迹系统已经开发, 即毛细管西部, 这是一个更无免提和无凝胶系统。整个化验是自动化的在样品板材 (样品与所有必要的试剂) 的装载以后入系统^3,4。该仪器将执行所有步骤, 如蛋白质分离, 固定化的蛋白质在毛细血管壁, 抗体孵化, 洗涤之间的不同步骤, 以及发展和量化的化学发光信号。因此, 这里提出的 cIE....

Protocol

1. 细胞培养、刺激和裂解

注意: 此方法可与许多单元格类型一起使用。以人脐静脉内皮细胞 (血管内皮细胞) 为例, 说明该方法的应用。

1. 培养血管内皮细胞对凝胶涂层, 10 厘米培养皿在内皮细胞基底培养基适当补充 (参见材料表), 并且包含 5% FCS, 表皮生长因子 (5 ng/毫升), 血管内皮生长因子 (VEGF:0.5 ng/毫升), 基本的后代 (10), 胰岛素样生长因子 (20 ng/毫升), 松 (0.2 µg/毫升) 和抗坏血酸 (1 µg/毫升)。
2. 一夜间用内皮细胞基底培养基补充1% 的细胞, 无生长因子补充。
3. 吸入所有培养基, 加入2毫升的内皮细胞培养基, 无生长因子 (饥饿培养基) 在一盘 (控制), 然后添加 50 ng/毫升 VEGF 在2毫升的饥饿培养基中的第二道菜7分钟。
4. 吸入培养基和洗涤细胞2倍, 10 毫升室温 PBS。
5. 确保培养皿在冰上, 并保持他们在那里从这个步骤开始。
6. 添加250-400 µL 的冰冷裂解缓冲液 (Bicine/章; 见材料表) 含水蛋白酶抑制剂混合和亚砜抑制剂混合物 (磷酸酶抑制剂; 见材料表), 每10厘米板。旋转盘子, 确保适当的覆盖, 并保持10分钟的冰。
   注: 蛋白酶和亚砜抑制剂混合物....

Results

一种新的检测方法的设计:图 1A显示了检测板布局。最大地, 96 个井可以使用从384井板材在12个井块为每个情况 (抗体)。每块12口井都可以从 A1-A12 或 A13-A24 开始。颜色编码行允许一个区分样品或试剂从彼此。在检测模板 (图 1B) 中, 可以存储该特定化验的相关信息, 可用于结果分析的后期阶段。图 1C显示了协议的摘要。

血管内皮生长因子刺激 HUVEC 裂解酶磷酸化和 unphosphorylated 细胞外调节激酶 (pERK1/2 和 ERK1/2) 蛋白的检测:一般情况下, 后 translationally 修改后的蛋白质, 如磷酸, 很难检测, 因为它们的数量和瞬态性质, 缺.......

Discussion

蛋白质的敏感性和分辨力是生物蛋白质组学研究的关键。能够检测出细胞中微小数量的蛋白质是很有价值的。cIEF 可以为蛋白质及其亚型⁴的检测提供改进的灵敏度和分辨率。

该技术已成功地应用于许多蛋白质组研究报告^5,6,7。尽管如此, 还是有一些限制与它相关, 例如, 并不是所有的主要抗体都能发出信号, 即使它们在传统的 immunoblots 中工作得很好。目前还没有一份证明在 cIEF 中起作用的抗体清单, 因为这种技术是新的。最后, 该仪器一次不能处理少于12个样品或超过96个样品。

cIEF 是常规免疫印迹法的替代技术, 但它可能不会给出相同的结果。cIEF 在灵敏度和分辨率方面已被证明远远优于传统的免疫印迹法。此外, cIEF 是高通量, 健壮, 自动, 机器人和高度敏感, 产生信号从少于25细.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NanoPro 1000	ProteinSimple
预混料 G2，pH 5–8（嵌套）分离梯度，pH 2–4 个插头	ProteinSimple	040-972	两性电解质预混液
DMSO 抑制剂混合物	ProteinSimple	040-510	磷酸酶抑制剂;对于 cIEF 1：50 稀释液 使用
水性抑制剂混合物	ProteinSimple	040-482	蛋白酶抑制剂;对于 cIEF 1：25 稀释液 使用
pI 标准分子量标准 3	ProteinSimple	040-646	对于 cIEF 1：60 稀释液 使用
样品稀释剂	ProteinSimple	040-649
抗体稀释剂	ProteinSimple	040-309
洗涤浓缩	液 ProteinSimple	041-108
阳极液补充	蛋白Simple	040-337
阴极液补充	蛋白Simple	040-338
过氧化物 XDR	蛋白Simple	041-084
鲁米醇	蛋白Simple	040-652
Bicine/CHAPS 裂解缓冲液	ProteinSimple	040-764
毛细管 - 电荷分离（1 包）适用于	ProteinSimple	CBS700
检测板/盖试剂盒	ProteinSimple	040-663
过氧化物酶-AffiniPure 驴抗兔 IgG （H+L）	杰克逊免疫研究	711-035-152	用于 cIEF （1：300）
过氧化物酶-Affini纯驴抗小鼠 IgG （H+L）	杰克逊免疫研究	715-035-150	用于 cIEF 使用 （1： 300）
Phospho-Erk 1/2 一抗	Cell Signaling	9101	用于 cIEF 使用 （1： 50）
Pan Erk 一抗	Cell Signaling	9102	用于 cIEF 使用 （1： 100）
指南针软件	ProteinSimple
HUVEC	ATCC	PCS-100-010
MV2 （EBM-2）	PromoCell	C-22221	内皮细胞基础培养基
内皮细胞生长培养基 MV2 补充剂包	PromoCell	C-39221	补充 MV2 以上
VEGFA	PeproTech	100-20
Long R3 IGF	Sigma-Aldrich	85580C/I1146	胰岛素样生长因子
Bioruptor （Sonicator）	Diagenode	B01020001
BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Fischer Scientific	23225
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 蛋白凝胶	Thermo Fischer Scientific	NP0322BOX
NuPAG MOPS SDS 电泳缓冲液 （20X）	Thermo Fischer Scientific	NP0001
NuPAGE 转印缓冲液 （20X）	Thermo Fischer Scientific	NP0006
Immobilon PVDF 膜	Millipore	IPVH00010
微量离心管涡旋仪
离心
微量滴定板适配器，适用于离心
移液器
小贴士
冰