通过毛细管等电聚焦方法对蛋白质及其亚型进行高灵敏度定量检测

摘要

毛细管等电聚焦是一种基于抗体的超灵敏、高通量技术，能够从极微量的生物样品中对蛋白质及其亚型进行详细表征。以下描述了一种自动化和机器人化检测与定量特定蛋白质及其亚型的实验方案。

摘要

免疫印迹已成为许多实验室从生物样品中进行蛋白质表征的常规技术。以下方案提供了一种替代策略——毛细管等电聚焦（cIEF），相较于传统的免疫印迹具有诸多优势。该方法基于抗体检测，是一种自动化、快速且可定量的技术，整个蛋白质印迹过程均在超细毛细管内完成。该技术无需使用凝胶和转膜、无需洗脱抗体、也无需X光胶片，而这些通常是传统免疫印迹所必需的步骤。在此方法中，蛋白质根据其电荷（等电点；pI）进行分离，仅需不到1微升（400 nL）的总蛋白裂解液。电泳完成后，蛋白质通过紫外光处理固定在毛细管内壁上，随后依次与一抗和二抗（辣根过氧化物酶（HRP）标记）孵育，通过增强型化学发光（ECL）检测抗体结合情况，产生可被电荷耦合器件（CCD）相机捕获并记录的光信号。所得数字图像可通过软件进行分析和定量（峰面积）。该高通量方法可同时处理96个样品，灵敏度极高，可检测皮克（pg）级别的蛋白质，并因自动化操作而具有高度可重复性。当样品数量有限（例如，组织样本和活检样本）时，这些优势尤为突出。该技术还具有更广泛的应用前景，包括药物或抗体筛选、生物标志物发现以及诊断用途。

引言

毛细管等电聚焦（cIEF）是一种基于毛细管的自动化免疫分析方法，可根据蛋白质的电荷特性对其进行分离^1,2,3。该方法具有高度可重复性，能够快速、定量地分辨蛋白质及其翻译后修饰的异构体，为传统方法（如蛋白质印迹法）提供了一种替代选择。尽管蛋白质印迹法在检测易获取样本中高丰度蛋白质的存在方面表现良好，但在分析生物组织样本时，其变异性、耗时性以及准确定量等方面仍存在挑战。事实上，蛋白质印迹法本身存在固有的变异性问题，因其涉及多个操作步骤，包括SDS-PAGE凝胶的上样与电泳、蛋白质向膜上的转印、与多种试剂（例如，一抗和二抗、ECL）的孵育，以及在X射线胶片上的显影⁴。目前，随着化学发光信号的数字化记录技术（数字印迹法）的应用，蛋白质印迹技术正在不断改进。最近已开发出一种自动化蛋白质印迹系统，即毛细管印迹系统（capillary western），该系统无需手动操作且无需凝胶。整个检测过程在将样品板（包含所有必要试剂的样品）加载至系统后即可自动完成^3,4。仪器将自动执行所有步骤，包括蛋白质分离、蛋白质在毛细管壁上的固定、抗体孵育、各步骤间的洗涤，以及化学发光信号的显影与定量....

方案

1. 细胞培养、刺激与裂解

注意：该方法可与多种细胞类型联用。为说明该方法，本文以人脐静脉内皮细胞（HUVECs）为例进行描述。

1. 在明胶包被的10 cm培养皿中，使用添加了适当补充剂的基础内皮细胞培养基（参见材料表），并含有5%胎牛血清（FCS）、表皮生长因子（5 ng/mL）、血管内皮生长因子（VEGF：0.5 ng/mL）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，10 ng/mL）、胰岛素样生长因子（20 ng/mL）、氢化可的松（0.2 µg/mL）和抗坏血酸（1 µg/mL），培养HUVECs细胞。
2. 使用添加1% FCS但不含生长因子补充剂的基础内皮细胞培养基对细胞进行过夜饥饿处理。
3. 吸除全部培养基，在一个培养皿中加入2 mL不含生长因子的内皮细胞培养基（饥饿培养基）作为对照；在另一培养皿中加入含50 ng/mL VEGF的2 mL饥饿培养基，作用7分钟。
4. 吸除培养基，并用10 mL室温PBS洗涤细胞两次。
5. 确保培养皿置于冰上，并从本步骤起始终保持在冰上操作。
6. 向每个10 cm培养皿中加入250–400 µL预冷的裂解缓冲液（Bicine/CHAPS；参见材料表），其中包含水溶性蛋白酶抑制剂混合物和DMSO抑制剂混合物（磷酸酶抑制剂；参见材料表）。轻轻....

结果

新检测方法的设计：检测板布局如图1A所示。在384孔板中，最多可使用96个孔，每12个孔组成一个区块，用于每个实验条件（抗体）。每个12孔区块可从A1-A12或A13-A24开始。通过颜色编码的行可区分不同的样品或试剂。图1B所示的检测模板中可存储该特定检测的相关信息，供后续结果分析阶段使用。图1C展示了实验流程的概要。

检测经 VEGF 刺激的 HUVEC 裂解液中磷酸化与非磷酸化细胞外调节激酶（pERK1/2 和 ERK1/2）蛋白：通常，翻译后修饰蛋白（如磷酸化蛋白）由于含量低、存在时间短暂以及特异性抗体缺乏，难以被检测。在血清饥饿后经血管内皮生长因子（VEGF）刺激，可激活受体酪氨酸激酶（VEGFR2.......

讨论

蛋白质的灵敏度和分辨率对于生物样本的蛋白质组学研究至关重要。能够检测细胞中微量存在的蛋白质具有重要意义。毛细管等电聚焦电泳（cIEF）可提高蛋白质及其亚型检测的灵敏度和分辨率⁴。

该技术已成功应用于多项蛋白质组学研究报告中^5,6,7。然而，该技术仍存在一些局限性，例如，并非所有在传统免疫印迹中表现良好的一抗均能产生信号。由于该技术较新，目前尚无经过验证、确认可在cIEF中有效工作的抗体列表。最后，仪器每次运行的样本数量不能少于12个，也不能超过96个。

毛细管等电聚焦电泳（cIEF）是传统免疫印迹法的一种替代技术，但其结果可能与后者不完全相同。研究表明，cIEF 在灵敏度和分辨率方面显著优于传统免疫印迹法。此外，cIEF 具有高通量、稳定性好、自动化、机器人化以及高灵敏度等优点，根据不同分析的蛋.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NanoPro 1000	ProteinSimple
pH 5–8（嵌套）分离梯度Premix G2，pH 2–4插塞	ProteinSimple	040-972	两性电解质预混液
DMSO抑制剂混合液	ProteinSimple	040-510	磷酸酶抑制剂；用于cIEF，使用时稀释1:50
水相抑制剂混合液	ProteinSimple	040-482	蛋白酶抑制剂；用于cIEF，使用时稀释1:25
pI标准梯度3	ProteinSimple	040-646	用于cIEF，使用时稀释1:60
样品稀释液	ProteinSimple	040-649
抗体稀释液	ProteinSimple	040-309
洗涤浓缩液	ProteinSimple	041-108
阳极液补充液	ProteinSimple	040-337
阴极液补充液	ProteinSimple	040-338
过氧化物XDR	ProteinSimple	041-084
鲁米诺	ProteinSimple	040-652
Bicine/CHAPS裂解缓冲液	ProteinSimple	040-764
电荷分离毛细管（1包）用于	ProteinSimple	CBS700
检测板/盖板套件	ProteinSimple	040-663
辣根过氧化物酶标记的驴抗兔IgG（H+L）	Jackson ImmunoResearch	711-035-152	用于cIEF（1:300）
辣根过氧化物酶标记的驴抗鼠IgG（H+L）	Jackson ImmunoResearch	715-035-150	用于cIEF（1:300）
磷酸化Erk 1/2一抗	Cell Signaling	9101	用于cIEF（1:50）
总Erk一抗	Cell Signaling	9102	用于cIEF（1:100）
Compass软件	ProteinSimple
HUVEC	ATCC	PCS-100-010
MV2（EBM-2）	PromoCell	C-22221	内皮细胞基础培养基
内皮细胞生长培养基MV2补充剂套装	PromoCell	C-39221	用于上述MV2培养基的补充
VEGFA	PeproTech	100-20
Long R3 IGF	Sigma-Aldrich	85580C/I1146	类胰岛素生长因子
Bioruptor（超声破碎仪）	Diagenode	B01020001
BCA蛋白定量检测试剂盒	Thermo Fischer Scientific	23225
NuPAGE 4-12% Bis-Tris蛋白凝胶	Thermo Fischer Scientific	NP0322BOX
NuPAGE MOPS SDS电泳缓冲液（20X）	Thermo Fischer Scientific	NP0001
NuPAGE转移缓冲液（20X）	Thermo Fischer Scientific	NP0006
Immobilon PVDF膜	Millipore	IPVH00010
微量离心管涡旋振荡器
离心机
离心机用微量滴定板适配器
移液器
吸头
冰