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方法文章

通过毛细管等电聚焦方法对蛋白质及其亚型进行高灵敏度定量检测

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DOI：

10.3791/56794

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2018年9月19日

1Uppsala University, Dept. Immunology, Genetics and Pathology, Rudbeck Laboratory, 751 85, Uppsala, Sweden

本文内容

摘要

毛细管等电聚焦是一种基于抗体的超灵敏、高通量技术，能够从极微量的生物样品中对蛋白质及其亚型进行详细表征。以下描述了一种自动化和机器人化检测与定量特定蛋白质及其亚型的实验方案。

摘要

免疫印迹已成为许多实验室从生物样品中进行蛋白质表征的常规技术。以下方案提供了一种替代策略——毛细管等电聚焦（cIEF），相较于传统的免疫印迹具有诸多优势。该方法基于抗体检测，是一种自动化、快速且可定量的技术，整个蛋白质印迹过程均在超细毛细管内完成。该技术无需使用凝胶和转膜、无需洗脱抗体、也无需X光胶片，而这些通常是传统免疫印迹所必需的步骤。在此方法中，蛋白质根据其电荷（等电点；pI）进行分离，仅需不到1微升（400 nL）的总蛋白裂解液。电泳完成后，蛋白质通过紫外光处理固定在毛细管内壁上，随后依次与一抗和二抗（辣根过氧化物酶（HRP）标记）孵育，通过增强型化学发光（ECL）检测抗体结合情况，产生可被电荷耦合器件（CCD）相机捕获并记录的光信号。所得数字图像可通过软件进行分析和定量（峰面积）。该高通量方法可同时处理96个样品，灵敏度极高，可检测皮克（pg）级别的蛋白质，并因自动化操作而具有高度可重复性。当样品数量有限（例如，组织样本和活检样本）时，这些优势尤为突出。该技术还具有更广泛的应用前景，包括药物或抗体筛选、生物标志物发现以及诊断用途。

引言

毛细管等电聚焦（cIEF）是一种基于毛细管的自动化免疫分析方法，可根据蛋白质的电荷特性对其进行分离1,2,3。该方法具有高度可重复性，能够快速、定量地分辨蛋白质及其翻译后修饰的异构体，为传统方法（如蛋白质印迹法）提供了一种替代选择。尽管蛋白质印迹法在检测易获取样本中高丰度蛋白质的存在方面表现良好，但在分析生物组织样本时，其变异性、耗时性以及准确定量等方面仍存在挑战。事实上，蛋白质印迹法本身存在固有的变异性问题，因其涉及多个操作步骤，包括SDS-PAGE凝胶的上样与电泳、蛋白质向膜上的转印、与多种试剂（例如，一抗和二抗、ECL）的孵育，以及在X射线胶片上的显影4。目前，随着化学发光信号的数字化记录技术（数字印迹法）的应用，蛋白质印迹技术正在不断改进。最近已开发出一种自动化蛋白质印迹系统，即毛细管印迹系统（capillary western），该系统无需手动操作且无需凝胶。整个检测过程在将样品板（包含所有必要试剂的样品）加载至系统后即可自动完成3,4。仪器将自动执行所有步骤，包括蛋白质分离、蛋白质在毛细管壁上的固定、抗体孵育、各步骤间的洗涤，以及化学发光信号的显影与定量。因此，本文所介绍的cIEF方法具有更高的分辨率和灵敏度。

该方法具有高灵敏度，可从皮克级别的蛋白质中产生并量化信号1。其高灵敏度和优异的重复性使该技术在临床样本分析中极具应用价值。该技术不仅能够检测蛋白质，还可区分其翻译后修饰（例如，不同磷酸化形式的蛋白质亚型）。该技术已成功应用于解析多种信号通路4,5，在旨在开发癌症新疗法的临床研究中发挥了重要作用3，并在蛋白质生物标志物发现和药物研发方面展现出巨大潜力。

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方案

1. 细胞培养、刺激与裂解

注意：该方法可与多种细胞类型联用。为说明该方法，本文以人脐静脉内皮细胞（HUVECs）为例进行描述。

  1. 在明胶包被的10 cm培养皿中，使用添加了适当补充剂的基础内皮细胞培养基（参见材料表），并含有5%胎牛血清（FCS）、表皮生长因子（5 ng/mL）、血管内皮生长因子（VEGF：0.5 ng/mL）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，10 ng/mL）、胰岛素样生长因子（20 ng/mL）、氢化可的松（0.2 µg/mL）和抗坏血酸（1 µg/mL），培养HUVECs细胞。
  2. 使用添加1% FCS但不含生长因子补充剂的基础内皮细胞培养基对细胞进行过夜饥饿处理。
  3. 吸除全部培养基，在一个培养皿中加入2 mL不含生长因子的内皮细胞培养基（饥饿培养基）作为对照；在另一培养皿中加入含50 ng/mL VEGF的2 mL饥饿培养基，作用7分钟。
  4. 吸除培养基，并用10 mL室温PBS洗涤细胞两次。
  5. 确保培养皿置于冰上，并从本步骤起始终保持在冰上操作。
  6. 向每个10 cm培养皿中加入250–400 µL预冷的裂解缓冲液（Bicine/CHAPS；参见材料表），其中包含水溶性蛋白酶抑制剂混合物和DMSO抑制剂混合物（磷酸酶抑制剂；参见材料表）。轻轻晃动培养皿以确保充分覆盖，冰上孵育10分钟。
    注：蛋白酶抑制剂混合物和DMSO抑制剂混合物的终浓度应为1x。
  7. 用细胞刮刀刮下细胞，转移至预冷的微量离心管中，上下吹打5次以裂解细胞。
  8. 在4 °C下短暂超声处理细胞。设定超声仪参数如下：循环次数 = 5，功率 = 低，开启时间 = 5秒，关闭时间 = 30秒。此步骤旨在降解核酸，而非进一步裂解细胞。
    注：超声处理应温和，以防止蛋白质变性。
  9. 涡旋振荡管子，每次2秒，共3次（总时长不超过5秒），然后置于冰上。
  10. 在4 °C下以14,000 × g离心15分钟澄清裂解液，立即小心转移上清液至洁净的预冷微量离心管中。
  11. 使用二辛可宁酸（BCA）蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度4。
  12. 将样品分装为每份10 µL，置于干冰或液氮中速冻，随后储存在-80 °C直至使用。

2. 样品混合液的制备（150 µL 样品混合液的计算）

  1. 首先，通过将1 µL DMSO抑制剂混合液（50倍储存液）和2 µL蛋白酶抑制剂（25倍储存液）加入47 µL样品稀释液中，制备样品稀释液混合液（参见 材料表），使DMSO抑制剂和蛋白酶抑制剂的终浓度为1×。接着，使用样品稀释液混合物稀释蛋白裂解液，以获得所需的浓度（见步骤2.3）。
  2. 通过添加 3.325 µL 标准分子量标记物（参见 材料表；60倍储存液），6 µL 蛋白酶抑制剂（25倍），3 µL DMSO（50倍）抑制剂加入137.675 µL 两性电解质预混液中（参见 材料表). 涡旋振荡管至少15秒，每次5秒，重复3-4次，并置于冰上。
  3. 将步骤 2.1 和 2.2 的溶液按 1:3 的比例混合，使 DMSO、蛋白酶抑制剂和等电点标准蛋白梯度的终浓度均为 1X，毛细管中的蛋白质达到最终所需浓度（例如，使用了50 µg/mL 图2).
    注意：毛细管和孔中的蛋白质浓度相同。
  4. 根据384孔板检测模板布局，将10 µL样品混合物加入相应的孔中（参见步骤3和 图1并将培养板置于冰上。
  5. 用抗体稀释液稀释一抗（pERK1/2，1:50；ERK1/2，1:100；HSP 70，1:500）和二抗（1:300）（参见 材料表加入10 µL一抗和15 µL二抗至各孔中。
    注意：与常规的蛋白质印迹法相比，cIEF 分析通常需要更高浓度的抗体。
  6. 混合Luminol与过氧化物XDR（1:1比例；参见 材料表将两者混合后，每孔加入15 µL。
    注意：每次使用前需新鲜配制这些溶液，并置于冰上保存。
  7. 将样本和所有试剂加入孔板后，于4 °C条件下以2,500 × g离心10分钟，使液体沉降至管底并去除气泡。若仍有气泡残留，可用细小的移液枪头手动去除。
    注意：每个孔中加入的样品或试剂体积不得超过 20 µL，否则仪器的移液针无法正常清洗。请严格按照试剂生产商提供的说明书配制所有试剂。

3. 使用系统软件设计新的检测模板（图1）

  1. 打开系统软件并点击 "新" 从“文件”菜单中。
  2. 转到布局面板，在384孔板中为试剂和样本分配位置。每块384孔板最多使用96个孔。
  3. 通过点击任意一个孔来分配试剂。选择每行包含12个孔的孔板区域。孔， 例如默认情况下，编号从1-12或13-24的组会作为一个整体进行分配。
  4. 转到布局窗格工具栏，插入一个空行块，或样本、一抗、二抗或鲁米诺行块。每个块分配有不同的颜色，便于区分。
    注意：单击某个孔时，可在面板中看到新块将插入位置的周围出现黑色边框。行块也可被删除。
  5. 转到方案面板，选择板上的试剂位置。然后点击样本列中的一个单元格，从下拉菜单中选择试剂。
  6. 以相同方式，为每个循环选择一抗、二抗和鲁米诺的试剂位置。
  7. 依次点击主要或次要抗体列中的细胞，如有必要，更改孵育时间。
    注意：也可为每个周期添加备注。
  8. 通过点击方案部分的“添加”按钮来增加循环次数。可选择添加1个循环、4个循环或全部循环 （最多可向该方案中添加8个循环）。
    注意：在此步骤中，可以复制并粘贴循环信息：选择一个循环，进入编辑，进行复制和粘贴。
  9. 输入与样品相关的信息，例如一抗和二抗的名称、货号及稀释比例， 等等。，位于模板窗格中。此步骤为可选，但在运行后分析期间非常有用。
  10. 保存新的检测文件。在单击“开始”按钮之前，快速检查布局，确保所有设置均正确无误。

4. cIEF 仪器设置方案

  1. 设置毛细管等电聚焦电泳分离条件。功率应为15,000 µW，时间为40分钟，紫外光固定时间为80秒。然而，紫外光固定时间可在80–140秒范围内设置，可能需要根据目标蛋白进行优化。
    注意：每个循环可设置一个紫外光固定时间点，但不能针对每根毛细管单独设置。
  2. 设置洗涤1步骤为1–2次洗涤，每次150秒（默认），一抗孵育时间为120分钟。
  3. 设置洗涤2步骤为2次洗涤，每次150秒（默认），二抗孵育时间为60分钟。
  4. 设置洗涤3步骤，应为2次洗涤，每次150秒（默认）。
  5. 设置化学发光检测时的曝光时间，分别为30、60、120、240、490和960秒。所有步骤（1–8）将在同一根毛细管中完成。

5. 运行检测文件

  1. 一切准备就绪后，单击“开始”以启动运行。软件将提示您移除废液，重新加注水和毛细管盒，向试剂资源托盘中添加阳极液和阴极液，加入洗涤缓冲液，最后将样品板装入冷却的样品托盘中。
    注意：请取下毛细管盒的盖子，但不要取下检测板的盖子。检测板的盖子可在必要时由仪器自动移除。这有助于防止试剂蒸发。
  2. 运行开始几分钟后，计算机屏幕上将显示仪器状态栏。可看到对应于仪器当前阶段的状态信息和进度条。
    注意：初始阶段，仪器会首先检查所有设置是否正确，然后继续将阳极液和阴极液移取至分离托盘，拾取第一组12根毛细管，移除样品板盖子，将样品从样品板转移至毛细管中，最后将样品送入分离室进行电泳。
  3. 单击运行摘要界面，可看到两个窗格：状态和分离。用户可查看运行进度，且在每个循环的电泳步骤完成后，可保存该循环的分离过程视频（包含12根毛细管）。如需观察某根毛细管中的电泳分离过程，请在控制面板中选择相应的循环编号，然后单击播放按钮以播放该毛细管的分离视频。
  4. 运行结束后，运行文件将自动保存。

6. 分析数据（图 S1）

  1. 打开运行文件并选择分析界面选项卡。在 图 S1A，样本图中显示的数据（峰）来自所选毛细管即, 4th 毛细管（来自第1个循环）。
  2. 点击编辑，然后选择分析（图 S1B在此阶段，用户可更改等电点（pI）范围，应用适合特定实验的pI标准，添加峰拟合，并命名峰。
    注意：当使用pH 5-8两性电解质预混液（如此处所示）时，推荐使用的标准蛋白梯度标记物为含有等电点（pI）分别为4.9、6.0、6.4、7.0和7.3的荧光标记肽段；当使用pH 3-10预混液时，推荐的梯度标记物其pI值分别为4.0、4.9、6.0、6.4和7.3。2
  3. 结果在“峰”选项卡中显示；样品显示的数值包括峰位置、等电点（pI）、峰高和峰面积、峰面积百分比（% Area）、峰宽以及信噪比（S/N）图 S1C）。选择要使用哪些数据，并导出数据以进行进一步分析。
    注意：只有在标记峰之后才能导出数据图 S1C).

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结果

新检测方法的设计：检测板布局如图1A所示。在384孔板中，最多可使用96个孔，每12个孔组成一个区块，用于每个实验条件（抗体）。每个12孔区块可从A1-A12或A13-A24开始。通过颜色编码的行可区分不同的样品或试剂。图1B所示的检测模板中可存储该特定检测的相关信息，供后续结果分析阶段使用。图1C展示了实验流程的概要。

检测经 VEGF 刺激的 HUVEC 裂解液中磷酸化与非磷酸化细胞外调节激酶（pERK1/2 和 ERK1/2）蛋白：通常，翻译后修饰蛋白（如磷酸化蛋白）由于含量低、存在时间短暂以及特异性抗体缺乏，难以被检测。在血清饥饿后经血管内皮生长因子（VEGF）刺激，可激活受体酪氨酸激酶（VEGFR2...

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讨论

蛋白质的灵敏度和分辨率对于生物样本的蛋白质组学研究至关重要。能够检测细胞中微量存在的蛋白质具有重要意义。毛细管等电聚焦电泳（cIEF）可提高蛋白质及其亚型检测的灵敏度和分辨率4。

该技术已成功应用于多项蛋白质组学研究报告中5,6,7。然而，该技术仍存在一些局限性，例如，并非所有在传统免疫印迹中表现良好的一抗均能产生信号。由于该技术较新，目前尚无经过验证、确认可在cIEF中有效工作的抗体列表。最后，仪器每次运行的样本数量不能少于12个，也不能超过96个。

毛细管等电聚焦电泳（cIEF）是传统免疫印迹法的一种替代技术，但其结果可能与后者不完全相同。研究表明，cIEF 在灵敏度和分辨率方面显著优于传统免疫印迹法。此外，cIEF 具有高通量、稳定性好、自动化、机器人化以及高灵敏度等优点，根据不同分析的蛋...

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致谢

作者感谢瑞典乌普萨拉大学的Lena Claesson-Welsh教授对本项目开发提供的支持。此外，作者感谢乌普萨拉大学的Ross Smith和Lena Claesson-Welsh对稿件提出的审阅意见和改进建议。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
NanoPro 1000ProteinSimple
pH 5–8（嵌套）分离梯度Premix G2，pH 2–4插塞ProteinSimple040-972两性电解质预混液
DMSO抑制剂混合液ProteinSimple040-510磷酸酶抑制剂；用于cIEF，使用时稀释1:50
水相抑制剂混合液ProteinSimple040-482蛋白酶抑制剂；用于cIEF，使用时稀释1:25
pI标准梯度3ProteinSimple040-646用于cIEF，使用时稀释1:60
样品稀释液ProteinSimple040-649
抗体稀释液 ProteinSimple040-309
洗涤浓缩液ProteinSimple041-108
阳极液补充液ProteinSimple040-337
阴极液补充液ProteinSimple040-338
过氧化物XDRProteinSimple041-084
鲁米诺ProteinSimple040-652
Bicine/CHAPS裂解缓冲液ProteinSimple040-764
电荷分离毛细管（1包）用于 ProteinSimpleCBS700
检测板/盖板套件ProteinSimple040-663
辣根过氧化物酶标记的驴抗兔IgG（H+L） Jackson ImmunoResearch 711-035-152用于cIEF（1:300）
辣根过氧化物酶标记的驴抗鼠IgG（H+L） Jackson ImmunoResearch 715-035-150用于cIEF（1:300）
磷酸化Erk 1/2一抗Cell Signaling9101用于cIEF（1:50）
总Erk一抗Cell Signaling9102用于cIEF（1:100）
Compass软件ProteinSimple
HUVECATCCPCS-100-010
MV2（EBM-2）PromoCell C-22221内皮细胞基础培养基
内皮细胞生长培养基MV2补充剂套装PromoCellC-39221用于上述MV2培养基的补充
VEGFAPeproTech100-20
Long R3 IGFSigma-Aldrich85580C/I1146类胰岛素生长因子
Bioruptor（超声破碎仪）DiagenodeB01020001
BCA蛋白定量检测试剂盒 Thermo Fischer Scientific23225
NuPAGE 4-12% Bis-Tris蛋白凝胶Thermo Fischer ScientificNP0322BOX
NuPAGE MOPS SDS电泳缓冲液（20X）Thermo Fischer ScientificNP0001
NuPAGE转移缓冲液（20X）Thermo Fischer ScientificNP0006
Immobilon PVDF膜MilliporeIPVH00010
微量离心管涡旋振荡器
离心机
离心机用微量滴定板适配器
移液器 
吸头
冰

参考文献

  1. O'Neill, R. A., et al. Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).
  2. Aspinall-O'Dea, M., et al. Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines. Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).
  3. Fan, A. C., et al. Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens. Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).
  4. Padhan, N., et al. High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer. BMC Cancer. 16 (1), 683(2016).
  5. Sun, Z., et al. VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd. J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).
  6. Iacovides, D. C., et al. Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay. Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).
  7. Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
  8. Unger, F. T., et al. Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue. J Transl Med. 14, 6(2016).
  9. Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice. PLoS One. 11 (1), e0146994(2016).
  10. Schmidt, L., et al. Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene. Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).

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