通过衰减全反射红外光谱法与多元数据分析检测与定量无细胞红细胞中Plasmodium falciparum

摘要

本文介绍了一种利用衰减全反射红外光谱仪结合多元数据分析，对感染红细胞水相中Plasmodium falciparum进行检测与定量的实验方案。

摘要

我们展示了一种利用简易台式衰减全反射傅里叶变换红外光谱仪（ATR-FTIR）结合多元数据分析（MVDA）对水相红细胞（RBCs）中的寄生虫进行定量与检测的方法。将培养至10% 寄生率的环状期3D7 P. falciparum 寄生虫用于加标新鲜供体分离的红细胞，制备0–1%范围内的系列稀释样本。每个样本取10 µL滴加至ATR金刚石窗口中心，以获取光谱。对样本数据进行处理，以提高信噪比并消除水的干扰贡献，随后应用二阶导数以分辨光谱特征。然后采用两种多元数据分析方法对数据进行分析：首先使用主成分分析（PCA）识别异常值，再通过偏最小二乘回归（PLS-R）建立定量模型。

引言

疟疾是当今世界上最严重的疾病之一；全球超过一半的人口生活在流行地区，面临感染风险，且贫困人群受其影响尤为严重^1,2,3,4。问题的很大一部分在于无症状携带者和早期阶段患者，他们作为蚊媒传播的宿主库⁵，在雨季导致感染率急剧上升，并使疟疾在社区中持续传播。疟疾由五种疟原虫（Plasmodium）引起，其中最致命的是恶性疟原虫（P. falciparum），可导致最严重的疾病形式²。

目前，疟疾的诊断技术尚不完善。光学显微镜检查作为当前的金标准，仅能检测到每微升62–88个寄生虫/µL，具体取决于所使用的方法⁶此外，由于显微镜检查操作繁琐且技术要求高，在许多地区常出现误诊情况 >50%的病例，尤其是寄生虫血症水平较低的病例²，这可直接归因于该地区资源匮乏，导致抗疟药物的滥用。另外两种主要诊断方法是快速诊断检测（RDTs），其利用抗体进行检测，以及聚合酶链式反应（PCR）检测，可从DNA中鉴别并定量寄生虫。目前，RDTs仅能检测 P. falciparum 和 P. vivax 至少100个寄生虫/µ血液中的L导致该疾病的罕见类型未得到治疗。^7,8 相比之下，PCR 检测可区分并定量不同物种 疟原虫 在0.0004-5个寄生虫/的灵敏度下µL血液。然而，该方法需要昂贵的试剂、设备和技术技能，因此不适用于现场应用。

一种高灵敏度、可靠且经济实惠的技术对于缩短诊断时间、改善患者预后以及实现疾病消除至关重要。衰减全反射傅里叶变换（ATR-FTIR）光谱技术为此问题提供了潜在解决方案。先前的研究表明，可在甲醇固定的血膜中检测并定量P. falciparum，检测限达到<1个寄生虫/µL血液（<0.0002% 寄生虫血症）⁹，该灵敏度可与PCR方法相媲美。最近的研究显示，可在水相样品中检测并定量寄生虫，从而省去固定步骤。然而，为获得最佳结果，需考虑水蒸气、光谱噪声及数据处理等因素¹⁰。

本方案旨在向新用户展示如何获取红细胞（RBC）水溶液样品中恶性疟原虫（P. falciparum）的ATR-FTIR光谱，并建立用于检测的回归模型¹⁰。

方案

请查阅相应的材料安全数据表（MSDS），并接受适当的生物安全二级（BSL-2）培训。所有培养步骤必须在BSL-2级生物安全柜中采用无菌技术进行操作，这意味着去污过程中存在暴露于有害紫外线辐射的风险，还可能发生针刺伤，若寄生虫培养物进入伤口，则存在潜在的生物暴露和感染风险。此外，血库提供的库存血液仅针对某些疾病进行筛查，因此仍存在传播经血液传播疾病的潜在风险。一旦发生伤害，应立即寻求医疗救助。

1. 3D7 Plasmodium falciparum 寄生虫稀释系列的制备与测定

注意：Plasmodium sp. 培养物极为敏感。应使用新鲜且未过期的试剂，并定期更换培养基以喂养寄生虫。当寄生率低于5%时，每两天喂养一次；寄生率在6–10%之间时，每天喂养一至两次；寄生率在11–20%之间时，每天最多喂养四次。开始饥饿的寄生虫会失去原有形态并发生收缩。一旦出现此情况，应立即更换培养基并添加储备红细胞进行喂养和稀释。采集供体血液时，应使用含肝素作为抗凝剂的采血管，并在采血后6小时内完成测量。

1. 按照标准操作流程培养总共 30 mL 的 3D7 株 Plasmodium falciparum 寄生虫，直至寄生率达到 10% 环状体阶段。
2. 寄生虫同步化
   1. 在裂殖生殖进入寄生虫生命周期后 11 小时，使用自动移液器重悬培养物，并转移至 50 mL 圆锥形离心管中。
   2. 在标准实验室条件（25°C 和 100 kPa）下，以 300–400 × g 离心 5 分钟。
   3. 用移液器吸取或连接真空泵的巴斯德吸管小心去除上清液，避免扰动沉淀。将废液弃入含 10% 次氯酸钠溶液中。
   4. 使用自动移液器缓慢向沉淀中加入 12–15 mL 的 4% 山梨醇溶液，盖紧管盖后反复倒置混匀，直至培养物均匀。
   5. 将培养物在 37 °C 下孵育 15 分钟。
   6. 在标准实验室条件下，以 300–400 × g 离心 5 分钟。
   7. 按步骤 1.2.3 所述方法去除上清液。
   8. 向沉淀中加入 10–15 mL 的 0.9% 生理盐水，盖紧管盖后反复倒置混匀，直至培养物均匀。
   9. 重复步骤 1.2.6–1.2.8 两次，以彻底洗去残留的山梨醇。
3. 制备寄生率稀释系列
   1. 按照步骤 1.2.6–1.2.9 的方法洗涤储备红细胞（RBCs）。
   2. 在标准实验室条件下，将培养物和储备红细胞以 300–400 × g 离心 5 分钟，按步骤 1.2.3 所述弃去上清液。
   3. 标记微量离心管为 0%、0.010%、0.025%、0.075%、0.100%、0.250%、0.750% 和 1.000%，并分别使用 0.2–20 µL 移液器加入 0 µL、1 µL、2.5 µL、7.5 µL、10 µL、25 µL、75 µL 和 100 µL 的培养物。
   4. 分别向标记为 0%、0.010%、0.025%、0.075%、0.100%、0.250%、0.750% 和 1.000% 的离心管中加入 100 µL、99 µL、97.5 µL、92.5 µL、80 µL、75 µL、25 µL 和 0 µL 的储备红细胞。
   5. 将采集于抗凝管中的新鲜供体血液在标准实验室条件下以 1,200 × g 离心 10 分钟。
   6. 按步骤 1.2.3 所述方法用移液器吸除血浆并弃去。
   7. 向每支微量离心管中加入 900 µL 分离得到的红细胞，反复倒置 10 次充分混匀。
4. 光谱采集
   1. 使用配套的光谱采集程序，点击 "Instrument Set-Up"，并将数据采集参数设置如下：背景扫描次数为 128 次；样品扫描次数为 32 次；分辨率为 8/cm，覆盖仪器的最大样品范围。
   2. 根据制造商建议或过夜预热，设置 ATR-FTIR 光谱仪的温度。
   3. 使用沾有超纯水的无绒擦拭布以轻柔的环形动作擦拭晶体表面进行清洁，随后用另一块无绒擦拭布彻底擦干。
   4. 点击 "Background Measurement" 进行空气背景测量。每 20 分钟，按步骤 1.4.3 清洁晶体并重复此测量。
   5. 点击 "Preview" 打开实时视图，观察是否出现平坦、水平的基线，以确认晶体已清洁干净。
   6. 用移液器将 10 µL 去离子水直接加在晶体中央，点击 "Measure Sample" 进行测量。每测定五个样品后重复一次水样测量。
   7. 使用无绒擦拭布以轻柔的环形动作擦干晶体。
   8. 用移液器加入 10 µL 样品，点击 "Measure Sample" 进行测量。
   9. 每测完一个样品后，按步骤 1.4.3 清洁晶体。
   10. 重复测量直至获得 3 次重复数据，确保样品及重复测量的顺序随机化。

2. 多元数据解析（MVDA）

注意：必须对整个数据集进行数据处理，以避免噪声及非生物来源峰的引入。相反，应针对生物学相关区域进行分析：2980-2800/cm 和 1750-850/cm。

1. 数据处理
   注意：两种软件， 例如， Matlab（下文简称软件1）和The Unscrambler X（下文简称软件2）被用作多变量数据分析（MVDA）的示例软件。软件1能够在不附加图形用户界面（GUI）的情况下执行MVDA。然而，建议购买GUI材料表）。下述关于软件1的操作说明均基于其与市售GUI工具箱配合使用的情况，且示例数据处理脚本已附上。
   1. 打开相应的多变量数据分析软件，点击 "导入数据" 并选择用于分析的文件类型。
      1. 在软件1中输入 "分析" 在命令窗口中输入以打开图形用户界面。右键单击 X 框以查找 "导入数据".
      2. 在软件2中，单击选项卡 "文件" 找到 "导入".
   2. 将样品、水和基线光谱作为数据集导入工作区，方法是分别选中每组中的所有光谱，然后点击 "打开" 并为每组分配一个简短的名称， 例如， 用于水光谱数据集的“wat”。
   3. 通过点击选择新表格/矩阵 "新矩阵/向量" 并生成一个 n×1 的向量，其中 n 为样本数量。输入每个样本的寄生率，并将该向量命名为 'Parasitemia'。
      1. 在软件 1 中，单击 "新变量" 在命令窗口中。
      2. 在软件2中，单击图标 "新基质".
   4. 单击以绘制数据 "绘图数据图标". 通过点击检查光谱中的水蒸气影响 "缩放" 并在1800-1400/cm范围内放大观察；最明显表现为酰胺I带和酰胺II带斜坡上的短而尖锐、狭窄的峰。
   5. 在水蒸气极端情况下，打开编辑/预处理数据选项卡，然后选择 "平滑处理"通过使用最多25个数据点对样品和水的光谱进行平滑处理，或采用水蒸气校正方法，以降低噪声和/或强烈的水蒸气干扰。
   6. 如有必要，在步骤 2.1.4 中相同的“编辑/预处理数据”选项卡下，使用基线校正算法校正非水平基线。
   7. 平均水光谱，并将各行复制到一个与样本数据集等效的 n×m 矩阵中，通过乘以 0.7 将其强度降低至 70%。
      1. 在软件1中，通过在命令窗口输入以下脚本进行操作 "AverageWater = mean(WaterDataset)"然后复制并粘贴行以匹配样本数据集。为降低强度，请输入 "AverageWater70 = AverageWater × 0.70".
   8. 从每个样品光谱中减去平均水光谱。
      1. 在软件1中，通过在命令窗口输入以下脚本进行操作 "WaterCorrectedData=SampleDataset-AverageWater70".
   9. 打开编辑/预处理数据选项卡，应用二阶导数函数，然后选择单个标准变量（SNV）函数并对数据进行均值中心化以实现归一化。
      1. 在软件1中，需一次性完成操作。首先选择 "衍生物"，对样本集使用25个点的平滑、3阶多项式以及导数阶数，并应用Savitzky-Golay函数进行处理。然后选择 "单核苷酸变异" 和 "均值中心化". 点击 "确定/应用".
   10. 打开编辑/预处理数据选项卡并在 "柱变量"选择 2,980–2,800/cm 和 1,750–850/cm，确保仅勾选这两个范围的复选框。
2. 数据分析
   1. 主成分分析（PCA）
      1. 点击 "分析 | 分解" 并选择主成分分析（PCA）。
         1. 在软件1中，单击 "构建模型".
         2. 在软件2中，输入PCA方法。输入最优主成分（PCs）数量——本研究中为7——以及最大迭代次数100，并选择交叉验证作为验证方法。点击 "运行".
      2. 观察主成分1与主成分2得分图上的95%置信限（虚线圆环）。
      3. 使用以下方法对标记样本光谱中超出限值的得分进行标注，以识别潜在的离群值 "选择光谱工具".
      4. 如果标记的光谱具有较高的霍特林T² 数值和高Q残差值使其被排除在进一步分析之外。
   2. 偏最小二乘回归（PLS-R）
      1. 点击 "分析 | 回归" 并选择 "PLS-R".
         1. 在软件1中，右键单击Y模块并选择该向量 "寄生虫血症 | 构建模型".
         2. 在软件2中输入PLS-R方法，选择向量 "寄生虫血症" 作为 "Y 参考" 以及样本数据集作为 "X 数据集" 并选择交叉验证作为验证方法。点击 "运行".
      2. 分析回归模型。R² 大于0.80的值以及交叉验证均方根误差（RMSECV）低于0.1%寄生虫血症的模型为可接受模型。
      3. 分析回归向量并识别生物学特征峰。

结果

偏最小二乘回归（PLS-R）图及其相应的回归向量，即图1a和1b，表明寄生虫的信号与红细胞（RBCs）的信号具有足够差异，因此可用于建立线性回归模型，以预测未来数据集中的寄生虫。

建立了一个稳健的线性PLS-R模型，其R²值为0.87，交叉验证均方根误差（RMSECV）为0.13%寄生率，图1a。寄生率升高主要与核酸特征峰相关，尤其是1042、1083和1226/cm处的峰，分别归属于RNA核糖基团的ν(C=O)、ν_s(PO^4-)和ν_a(PO^4-)，这些峰构成了回归向量的主要负向部分。这是因为红细胞（RBC）无细胞核，因此核酸是寄生虫存在的强指示标志。此外，1226/cm处的峰表明该结构具有B型DNA构型，这突显了...

讨论

PLS-R 模型是一种监督型多元方法，用于寻找预测变量 X（此处为每个波数处的吸光度）与连续变量 Y（此处为寄生虫血症水平）之间的线性关系，即 Y = bX + E。简而言之，该模型将 X 中的变量进行组合，生成一组新的潜在变量（LVs），以捕获 X 中与 Y 相关的方差，并计算一个回归向量（b），将该向量与新的光谱相乘即可估计出 y 值。模型的性能可通过两个指标来评估：R² 值和交叉验证均方根误差（RMSECV）值。前者描述模型的线性程度，反映其稳健性（越接近 1 越好）；当模型的 R² 值低于 0.8 时，必须仔细检查数据中是否存在离群值和噪声数据。RMSECV 值则表示预测过程中的误差大小。应尽可能降低该数值，为此需排除离群值、谨慎处理数据，并确保拥有尽可能多的生物学重复。

因此，获取高质量的数据对于构建模型至关重要。稀释系列的制备尤为关键，具体而言，必须确保每个红细胞（RBC）样品尽可能均匀。通过使用移液器将红细胞上下吸取数次，同时将微量离心管管端轻轻晃动或轻弹5–10次，可避免样品不均一的情况。同理，每次测量后清洁晶体表面以防止...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
供体血液	-	-	必须由受过培训的医疗专业人员采集
库存血液	Australian Red Cross	-
3D7 恶性疟原虫	Burnet 研究所	-	实验室菌株，相当于野生型
不含碳酸氢钠的 L-HEPES RPMI-1640 培养基	Sigma Aldrich	R6504
Albumax (Gibco)	Thermofisher	E003000PJ	分装至 50 mL 离心管中，保存于冷冻室
碳酸氢钠	Sigma Aldrich	S5761
吉姆萨染液	Sigma Aldrich	48900
山梨醇	Sigma Aldrich	S1876	使用前必须过滤
血液采集管（真空采血管）	Becton, Dickonson and Company	367671
镜油	Thermofisher	M3004
50 mL 培养皿	Falcon	353025
25 mL 移液器吸头	Falcon	357515
10 mL 移液器吸头	Falcon	357530
显微镜载玻片	Sigma Aldrich	S8902
50 mL 离心管	Sigma Aldrich	T2318
自动移液控制器	Integra-biosciences	155 015
Sorvall Legend X1R 离心机	Thermofisher	75004260
Forma™ 310 直热式 CO2 培养箱	Thermofisher	310TS
Nikon Eclipse E-100 双目光学显微镜	Nikon Instruments	E100_2CE-MRTK-1	购买时需确认 100 倍物镜为油镜
Bruker Alpha Ft-IR 光谱仪，配备 ATR 快速夹具附件	Bruker	9308-3700	购买时务必注明需配备 "Eco-ATR" 附件
Matlab	Mathworks Inc		多元数据分析软件
The Unscrambler X	CAMO		多元数据分析软件
PLS-Toolbox	Mathworks, Inc.		Matlab 的图形用户界面工具