通过衰减全反射红外光谱法与多元数据分析检测与定量无细胞红细胞中Plasmodium falciparum

摘要

本文介绍了一种利用衰减全反射红外光谱仪结合多元数据分析，对感染红细胞水相中Plasmodium falciparum进行检测与定量的实验方案。

摘要

我们展示了一种利用简易台式衰减全反射傅里叶变换红外光谱仪（ATR-FTIR）结合多元数据分析（MVDA）对水相红细胞（RBCs）中的寄生虫进行定量与检测的方法。将培养至10% 寄生率的环状期3D7 P. falciparum 寄生虫用于加标新鲜供体分离的红细胞，制备0–1%范围内的系列稀释样本。每个样本取10 µL滴加至ATR金刚石窗口中心，以获取光谱。对样本数据进行处理，以提高信噪比并消除水的干扰贡献，随后应用二阶导数以分辨光谱特征。然后采用两种多元数据分析方法对数据进行分析：首先使用主成分分析（PCA）识别异常值，再通过偏最小二乘回归（PLS-R）建立定量模型。

引言

疟疾是当今世界上最严重的疾病之一；全球超过一半的人口生活在流行地区，面临感染风险，且贫困人群受其影响尤为严重^1,2,3,4。问题的很大一部分在于无症状携带者和早期阶段患者，他们作为蚊媒传播的宿主库⁵，在雨季导致感染率急剧上升，并使疟疾在社区中持续传播。疟疾由五种疟原虫（Plasmodium）引起，其中最致命的是恶性疟原虫（P. falciparum），可导致最严重的疾病形式²。

目前，疟疾的诊断技术尚不完善。光学显微镜检查作为当前的金标准，仅能检测到每微升62–88个寄生虫/µL，具体取决于所使用的方法⁶此外，由于显微镜检查操作繁琐且技术要求高，在许多地区常出现误诊情况 >50%的病例，尤其是寄生虫血症水平较低的病例²，这可直接归因于该地区资源匮乏，导致抗疟药物的滥用。另外两种主要诊断方法是快速诊断检测（RDTs），其利用抗体进行检测，以及聚合酶链式反应（PCR）检测，可从DNA中....

方案

请查阅相应的材料安全数据表（MSDS），并接受适当的生物安全二级（BSL-2）培训。所有培养步骤必须在BSL-2级生物安全柜中采用无菌技术进行操作，这意味着去污过程中存在暴露于有害紫外线辐射的风险，还可能发生针刺伤，若寄生虫培养物进入伤口，则存在潜在的生物暴露和感染风险。此外，血库提供的库存血液仅针对某些疾病进行筛查，因此仍存在传播经血液传播疾病的潜在风险。一旦发生伤害，应立即寻求医疗救助。

1. 3D7 Plasmodium falciparum 寄生虫稀释系列的制备与测定

注意：Plasmodium sp. 培养物极为敏感。应使用新鲜且未过期的试剂，并定期更换培养基以喂养寄生虫。当寄生率低于5%时，每两天喂养一次；寄生率在6–10%之间时，每天喂养一至两次；寄生率在11–20%之间时，每天最多喂养四次。开始饥饿的寄生虫会失去原有形态并发生收缩。一旦出现此情况，应立即更换培养基并添加储备红细胞进行喂养和稀释。采集供体血液时，应使用含肝素作为抗凝剂的采血管，并在采血后6小时内完成测量。

1. 按照标准操作流程培养总共 30 mL 的 3D7 株 Plasmodium falciparum 寄生虫，直至寄生率达到 10% 环状体阶段。
2. 寄生虫同步化
   1. 在裂殖生殖进入寄生虫生命周....

结果

偏最小二乘回归（PLS-R）图及其相应的回归向量，即图1a和1b，表明寄生虫的信号与红细胞（RBCs）的信号具有足够差异，因此可用于建立线性回归模型，以预测未来数据集中的寄生虫。

建立了一个稳健的线性PLS-R模型，其R²值为0.87，交叉验证均方根误差（RMSECV）为0.13%寄生率，图1a。寄生率升高主要与核酸特征峰相关，尤其是1042、1083和1226/cm处的峰，分别归属于RNA核糖基团的ν(C=O)、ν_s(PO^4-)和ν_a(PO^4-)，这些峰构成了回归向量的主要负向部分。这是因为红细胞（RBC）无细胞核，因此核酸是寄生虫存在的强指示标志。此外，1226/cm处的峰表明该结构具有B型DNA构型，这突显了.......

讨论

PLS-R 模型是一种监督型多元方法，用于寻找预测变量 X（此处为每个波数处的吸光度）与连续变量 Y（此处为寄生虫血症水平）之间的线性关系，即 Y = bX + E。简而言之，该模型将 X 中的变量进行组合，生成一组新的潜在变量（LVs），以捕获 X 中与 Y 相关的方差，并计算一个回归向量（b），将该向量与新的光谱相乘即可估计出 y 值。模型的性能可通过两个指标来评估：R² 值和交叉验证均方根误差（RMSECV）值。前者描述模型的线性程度，反映其稳健性（越接近 1 越好）；当模型的 R² 值低于 0.8 时，必须仔细检查数据中是否存在离群值和噪声数据。RMSECV 值则表示预测过程中的误差大小。应尽可能降低该数值，为此需排除离群值、谨慎处理数据，并确保拥有尽可能多的生物学重复。

因此，获取高质量的数据对于构建模型至关重要。稀释系列的制备尤为关键，具体而言，必须确保每个红细胞（RBC）样品尽可能均匀。通过使用移液器将红细胞上下吸取数次，同时将微量离心管管端轻轻晃动或轻弹5–10次，可避免样品不均一的情况。同理，每次测量后清洁晶体表面以防止.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
供体血液	-	-	必须由受过培训的医疗专业人员采集
库存血液	Australian Red Cross	-
3D7 恶性疟原虫	Burnet 研究所	-	实验室菌株，相当于野生型
不含碳酸氢钠的 L-HEPES RPMI-1640 培养基	Sigma Aldrich	R6504
Albumax (Gibco)	Thermofisher	E003000PJ	分装至 50 mL 离心管中，保存于冷冻室
碳酸氢钠	Sigma Aldrich	S5761
吉姆萨染液	Sigma Aldrich	48900
山梨醇	Sigma Aldrich	S1876	使用前必须过滤
血液采集管（真空采血管）	Becton, Dickonson and Company	367671
镜油	Thermofisher	M3004
50 mL 培养皿	Falcon	353025
25 mL 移液器吸头	Falcon	357515
10 mL 移液器吸头	Falcon	357530
显微镜载玻片	Sigma Aldrich	S8902
50 mL 离心管	Sigma Aldrich	T2318
自动移液控制器	Integra-biosciences	155 015
Sorvall Legend X1R 离心机	Thermofisher	75004260
Forma™ 310 直热式 CO2 培养箱	Thermofisher	310TS
Nikon Eclipse E-100 双目光学显微镜	Nikon Instruments	E100_2CE-MRTK-1	购买时需确认 100 倍物镜为油镜
Bruker Alpha Ft-IR 光谱仪，配备 ATR 快速夹具附件	Bruker	9308-3700	购买时务必注明需配备 "Eco-ATR" 附件
Matlab	Mathworks Inc		多元数据分析软件
The Unscrambler X	CAMO		多元数据分析软件
PLS-Toolbox	Mathworks, Inc.		Matlab 的图形用户界面工具