方法文章

Intracavernosal 压力记录对啮齿动物勃起功能的评价

DOI：

10.3791/56798

⸱

2018年6月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, School of Life Sciences, Jiangsu Engineering Research Center for microRNA Biology and Biotechnology, Nanjing University, 2Department of Andrology, The Affiliated Obstetrics and Gynecology Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing Maternity and Child Health Care Hospital, 3School of Pharmaceutical Sciences, Nanjing Tech University, 4Department of Urology, Affiliated Drum Tower Hospital, School of Medicine, Nanjing University, 5Department of Ultrasound, Nanjing Qixia District Maternity and Child Health Care Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Intracavernosal 压力记录 (ICP) 是评价实验动物勃起功能的重要方法。在这里, 通过置管下肢的小弟弟, 然后电刺激大鼠的海绵神经, 证明了比较 ICP 的记录过程的详细协议。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

勃起功能障碍 (ED) 被定义为不能达到或保持勃起的小弟弟, 这已经成为一个普遍的男性性障碍。啮齿类动物被许多研究用来研究勃起功能的生理学/病理学。通过测量 intracavernosal 压力 (ICP) 可以评价啮齿动物的勃起功能。在实际应用中, 可以通过电刺激海绵神经 (CNs) 来监测 ICP。应用颈动脉压 (平均动脉压) 作为 ICP 的参考。利用 icp 记录协议, 可以从 icp 反应曲线测量勃起功能的许多关键参数。ICP 测量比阿扑吗啡诱导的勃起试验提供更多的信息, 而且比海绵的人的小弟弟的遥测监测更便宜, 这使得这种方法最受欢迎的一个评价阳痿的功能。然而, 与易于执行的蛋白能诱导勃起功能测试相比, 成功的 ICP 记录需要注意细节, 实践和坚持的操作方法。在这项工作中, 介绍了在大鼠的 ICP 记录, 以有效补充程序。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ED 被定义为无法达到或保持勃起, 并已成为常见的男性性障碍1。实验动物被使用并且提供可再生的模型调查勃起功能2。长期以来, 一些较大的动物模型被用于调查勃起功能3,4,5。虽然啮齿动物比其他动物相对较小, 但它们也被用来研究男性勃起功能障碍, 因为它表现出了几个优点6。首先, 人类的形态和功能性特征在啮齿类动物中概括。第二, 与 ED 研究中使用的大型动物相比, 啮齿动物更经济的购买, 房子和维护。第三, 转基因啮齿动物模型在重现性和后续行为以及神经研究中提供了优势。因此, 啮齿类动物很快就成为了研究男性勃起功能障碍的主要方法。

啮齿动物模型得益于纯遗传背景和一致的文化条件, 提供了一致的可重现数据5,6,7,8。在许多与勃起功能相关的研究中, 阿扑吗啡的勃起反应试验和电刺激诱发的 ICP 反应试验是最广泛使用的方法, 可以可靠地反映勃起函数9,10,11,12。由希顿et 等开发的蛋白诱导的勃起功能测试。13是一种生物检测方法, 它利用阿扑吗啡对大鼠进行勃起和打呵欠的现象。作为一种简便、无创、稳定的生物检测方法, 对勃起功能进行评价, 在许多研究中广泛应用了该蛋白诱导的勃起功能检测。然而, 这项化验并不能充分反映勃起的质量或血液流量的动态变化, 与阳痿的反应14。ICP 测量最初是由昆兰et 等人开发的。15. 在该方法中, 将导管放入颈动脉以测量全身血压, 另一导管插入小腿语料库海绵以记录 ICP。在 ICP 记录之前或期间, 主要骨盆神经节 (加仑) 或 CN 的血管活性剂和/或电场刺激经常被给予老鼠14。这种检测方法是评估 ED 治疗和药物的可靠工具, 在未来的6中很有可能被用作重要的评估手段。

与易于执行的蛋白能诱发的勃起功能测试相比, 成功的 ICP 记录需要注意细节、练习和坚持操作方法。因此, 在这里, 我们提供了如何执行 ICP 记录的详细说明。

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方案

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本研究采用三月大、18月大的大鼠。所有动物都是按照 NIH 的护理和使用实验动物的指导方针处理的。涉及动物问题的程序得到当地机构动物照料和道德委员会的批准, 努力尽量减少动物的痛苦。这些议定书是由南京理工大学 (中国南京) 机构动物保育和使用委员会 (IACUC) 批准的。

在 ICP 记录前, 根据其年龄和早期表现, 将大鼠分为两组: 青年正常组 (YN 组) 和老年勃起功能障碍组 (AE 组)10。

1. 手术前准备

  1. 手动为 ICP 记录制作一对双极性电极 (图 1)。稍微弯曲电极的两端, 并将两个电极之间的距离调整为1-2 毫米宽, 如图 1A所示。
  2. 使用两个鳄鱼钳 (图 1A, B) 将电极连接到刺激器。
  3. 装配导管系统:首先, 将皮下注射的23G 针连接到带有油管的3路旋塞阀, 然后将旋塞阀连接到压力传感器。接下来, 在旋塞阀的第三端附上一个10毫升的注射器, 以提供肝素生理盐水。
  4. 在用肝素盐 (200 U/毫升) 填充整个系统后, 仔细检查是否有渗漏。然后将3路旋塞阀关闭注射器通道或压力传感器通道(图 1C)。
  5. 提起针20厘米的木垫水平。然后将压力记录系统校准到20厘米 H2O。之后, 移动针的高度, 以验证记录系统的准确性。重复校准, 直到确认准确性。
  6. 将老鼠从动物设施转移到手术室, 让他们习惯于手术室至少30分钟。
  7. 在手术前用70% 乙醇喷洒蒸压设备

2. 手术程序

  1. 麻醉大鼠腹腔注射戊巴比妥钠, 剂量为45毫克/千克体重, 并等待5-10 分钟. 捏脚趾以确认适当的麻醉。
  2. 用电动剃须刀剃去腹部和颈部的皮毛, 然后把老鼠放在暖气垫上。
  3. 用10% 聚维酮碘溶液浸泡棉球, 然后用70% 只乙醇浸泡棉球擦拭手术区。同时, 应用眼科软膏防止眼部干燥。
  4. Catheterize 左颈动脉。
    1. 用镊子抓住颈部的皮肤, 在颈部中部做水平切口。切开肌肉, 仔细暴露左颈动脉, 并隔离血管的5毫米部分。
    2. 用镊子仔细地将颈动脉与迷走神经分开, 在颈动脉下画一条丝缝线, 并在血管的尾端放一条松散的领带, 然后在血管的颅骨末端再做一个紧的结。
    3. Caudally 钳夹在缝合线上方的牛头犬钳, 以阻止血液流动。
    4. 用显微外科剪刀在血管上做切口, 在微解剖钩和镊子的协助下, 将动脉导管插入心脏。
    5. 把松动的尾鳍绑在导管上以确保它的安全。取出牛头犬钳以恢复血液流动。
  5. 隔离 CN 并放置电极
    1. 用钳子抬起腹部的皮肤和肌肉。用解剖剪刀, 切开下腹部到小弟弟做中线切开。
    2. 用拭子轻轻地将肠道推入腹腔上部。
    3. 用一副镊子抓住膀胱, 从腹腔取出膀胱。暴露前列腺的腹叶, 位于尿道的腹部。
    4. 拔出前列腺、精囊和输精管的腹叶, 露出前列腺的背叶。找出输精管和前列腺的粘连点。
    5. 分离前列腺和输精管之间的空间。仔细暴露的纤维胶囊, 这是位于后到连接点的前列腺和输精管。然后找到主要的骨盆神经节 (图 2)。
      注: 在前列腺表面可以看到主要的盆腔神经节和海绵状神经。
    6. 小心干燥 CN 区域与无菌拭子。用两极电极仔细隔离并钩住右海绵状神经。
  6. Catheterize 左下肢
    1. 用解剖剪刀在小弟弟的皮肤上切开一个小切口, 然后仔细掀的小弟弟的皮肤。
    2. 解剖纹状的小弟弟肌组织。找到耻骨骨的上部分支。
    3. 暴露 bulbospongiosus 的肌肉, 包括 spongious 灯泡。
    4. 用弯钳将 bulbospongiosus 肌从 ischiocavernosus 肌中分离出来。
    5. 小心地将 ischiocavernosus 肌肉与弯曲钳隔离, 然后切开 ischiocavernosus 肌以暴露小腿海绵的白色膜。
    6. 遵循小腿语料库海绵的解剖方向, 小心地将针插入小腿语料库海绵通过白色的膜。
      注意: 这是成功导尿的关键步骤。如果针插入正确, 少量的血气盐水可以被注射, 并且应该观察轻微的小弟弟膨胀。
    7. 小心释放针头, 避免任何滑动的针头或中断连接管。检查是否有渗漏。

3. 刺激 CN

  1. 打开压力信号记录软件程序, 启动压力信号记录。
  2. 设置刺激的参数:15 赫兹, 脉冲宽度为5毫秒, 5 伏, 和六十年代的持续时间。以15赫兹的频率刺激 CN, 脉冲宽度为5毫秒。
    注: 在应用电刺激时, 可观察到 ICP 的急剧上升。
  3. 让刺激之间有30分钟的休息时间。每只动物的连续刺激的最大值是三倍。

4. 结束程序

  1. 记录后, 通过注射过量的戊巴比妥钠剂量150毫克/千克体重来管理安乐死。通过检查动脉压力来证实老鼠的死亡。取出老鼠, 清理手术工具。

5. 数据分析

  1. 保存并导出软件中的数据。反应通常表示为 ICP 与全身平均动脉压的比值 (图)。计算了峰值比值/MAP 对勃起功能的评价。
  2. 从至少五只老鼠那里采集数据, 并用统计软件进行分析。当p < 0.05 使用学生的 t 测试时, 差异被认为具有统计学意义。

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结果

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许多研究表明, 老年男性勃起功能障碍正成为一个普遍的问题。然而, 在管理衰老相关的教育16方面, 医疗治疗受到限制。在衰老相关的啮齿动物模型中, 对老龄大鼠的勃起功能进行了多种治疗。正如我们前面所介绍的那样, ICP 记录试验可用于将 ED 动物与实验动物的总人口区分开来, 这对于量化潜在治疗或药物对勃起功能的影响也很有价值。

如图 3A所示, ed 组典型的 ICP 反应曲线 (年龄为18月的大鼠 AE) 远低于对照组的曲线 (幼鼠、YN、3月龄)。通常, 最高的 ICP 选择的统计分析。在计算了 icp/图的比值后, 5 大鼠的聚集数据表明 AE 组的 ICP/map 比与对照组相比显著降低 (图 3B)。在老年 ED 大鼠中, 除这两个关键参数外, 峰值 icp、高原 icp、消肿...

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讨论

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作为勃起功能的直接措施, ICP 是一种可靠的方法14。它允许获得关于基 icp 备、峰值比较、高原 icp、安装时间和消肿时间、响应时间、等的数据。除这些直接测量参数外, 还有一些其它指标参数: (1) "T80", 达到80% 峰值的时间;(2) "D20", 时间减少到20% 峰值 ICP;(3) "ΔT80", T80 压力增加率 (每秒);(4) "ΔD20", 在 D20 的压力降低率 (每秒)。这些参数允许量化每个阶段和 ICP 反应的质量, 这可以反映疾病的影响和检查药物的功效14,17。这种 ICP 记录方法广泛应用于 ED 动物模型中。在本议定书中, 我们比较了青年和老年 ED 大鼠的 ICP 反应。如果需要用药通过海绵导管, 则可以通过将另一海绵导管放置到对侧小腿语料库海绵17来完成。注射总容积应少于0.1 毫升。系统的药物管理可以通过腹腔或皮下注射进行。如果需要静脉用...

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披露

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作者没有什么可透露的

致谢

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这项工作得到了中央大学基础研究基金 (020814380018, 020814380077), 中国奖学金理事会 (CSC, 201606195024 号), 江苏省自然科学基金 (BK20160138) 和重点项目的支持。由南京医科大学科技发展基金会 (2014NJMUZD053) 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
动物
大鼠品系：Sprague-Dawley 年龄：2-3个月
大鼠品系：Sprague-Dawley 年龄：15-18
名称Company目录号Comments
<强>试剂
盐水Sigma-Aldrich， S7653将 8.5 克氯化钠溶于蒸馏水中
Sigma-Aldrich， P37611 克溶于 100 毫升生理盐水中
聚维酮碘BTP 制药有限公司10% （V/V）
乙醇中国医药集团公司 （SINOPHARM）70% （V/V）
肝素Sigma-Aldrich， H314920000U 肝素溶于 100 ml 生理盐水中
名称Company目录号评论
材料
皮下注射针山东威高集团医用高分子有限公司 23G
注射器山东威高集团医用高分子有限公司10 ml
三通旋塞阀成都仪器厂TSK 01
电极成都仪器厂JST-1
导管管成都仪器厂PE-10、PE-50
手术剪刀上海手术设备J22010、J22020
眼科手术剪刀上海手术设备厂Y00010、Y00020
眼科钳上海手术设备厂JD1010、JD1020
微型剪刀世界精密仪器WAA260
丝线山东威高集团医用高分子有限公司 5-0
名称公司目录号评论
设备
刺激器南京美迪斯科技有限公司（型号 4C501H）15 Hz，5 ms 脉冲，5 V，60 s 持续时间和 5 分钟间隔
多通道信号采集处理系统南京美易科技有限公司（型号 4C501H）血压
型号 压力传感器北京鑫航兴业科技贸易有限公司（型号 YP100）40KPa
个月 将 将

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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