通过记录阴茎海绵体内压评估啮齿类动物勃起功能

摘要

阴茎海绵体压力记录（ICP）是评估实验动物勃起功能的重要方法。本文详细展示了通过导管插入大鼠阴茎脚并电刺激海绵神经来记录ICP的操作步骤。

摘要

勃起功能障碍（ED）是指无法获得或维持阴茎勃起状态，已成为一种常见的男性性功能障碍。许多研究采用啮齿类动物来探索勃起功能的生理学/病理学机制。啮齿动物的勃起功能可通过测量阴茎海绵体内压（ICP）进行评估。在实际操作中，可通过电刺激阴部海绵体神经（CNs）后监测ICP。颈动脉的动脉压（即平均动脉压）被用作ICP的参照标准。通过ICP记录方案，可从ICP反应曲线上获取多项勃起功能的关键参数。相比阿扑吗啡诱导的阴茎勃起实验，ICP测量能提供更多信息，且比对阴茎海绵体进行遥测监测更为经济，因此该方法成为评估勃起功能最常用的技术。然而，与操作简便的APO诱导勃起功能检测相比，成功的ICP记录需要注重细节、反复练习并严格遵循操作规程。本文介绍了大鼠ICP记录的基本方法，以提高实验操作的效率。

引言

勃起功能障碍（ED）被定义为无法获得或维持阴茎勃起，已成为一种常见的男性性功能障碍¹。实验动物被用于研究勃起功能，并可提供可重复的模型²。长期以来，已有多种较大的动物模型被用于勃起功能的研究^3,4,5。尽管啮齿类动物体型相对较小，但由于具备多项优势，也被广泛用于男性勃起功能障碍的研究⁶。首先，人类在形态学和功能性方面的性特征在啮齿类动物中得以重现。其次，与ED研究中使用的较大动物相比，啮齿类动物在购买、饲养和维护方面更为经济。第三，基因修饰的啮齿类动物模型在可重复的行为学及神经生理学研究中具有显著优势。因此，啮齿类动物已迅速成为研究男性勃起功能障碍的主要实验动物。

由于具有纯合的遗传背景和一致的培养条件，啮齿类动物模型提供了可重复性良好的实验数据^5,6,7,8。在大量涉及勃起功能多个方面的研究中，阿扑吗啡（APO）诱导的勃起反应检测和电刺激诱导的阴茎海绵体内压（ICP）反应检测是最广泛使用且能可靠反映勃起功能的两种方法^9,10,11,12。由 Heaton et al.¹³ 建立的 APO 诱导勃起功能检测是一种生物测定方法，其原理是给予大鼠阿扑吗啡后可引发勃起和打哈欠现象。作为一种操作简便、无创且稳定的生物测定手段，APO 诱导勃起功能检测已被广泛应用于多项研究中。然而，该检测方法无法充分反映勃起的质量或勃起反应过程中血流动力学的动态变化¹⁴。ICP 测量技术最初由 Quinlan et al.¹⁵ 建立。该方法通过将一根导管插入颈动脉以测量全身血压，同时将另一根导管插入阴茎海绵体脚以记录 ICP。在 ICP 记录前或记录期间，通常会对大鼠给予血管活性药物和/或对主要盆腔神经节（MPG）或阴部神经（CN）进行电场刺激¹⁴。该检测方法已成为评估勃起功能障碍（ED）治疗手段和药物的可靠工具，并有望在未来继续作为关键的评估方法之一⁶。

与易于操作的阿扑吗啡诱导勃起功能测试相比，成功的ICP记录需要注重细节、反复练习并严格遵循操作方法。因此，本文提供了ICP记录操作的详细描述。

方案

本研究使用了3月龄和18月龄的Sprague-Dawley大鼠。所有动物的饲养和操作均遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》。涉及动物实验的操作均经当地机构动物护理与伦理委员会批准，并尽可能减少动物痛苦。实验方案已通过南京工业大学（中国南京）机构动物护理与使用委员会（IACUC）的审批。

根据年龄以及在记录ICP之前进行的APO诱导勃起功能测试中的初步表现，将大鼠分为两组：年轻正常组（YN组）和老年勃起功能障碍组（AE组）¹⁰。

1. 手术前准备

1. 手动制作一对用于ICP记录的双极电极（图1）。将电极末端略微弯曲，并调节两电极之间的距离至1–2 mm宽，如图1A所示。
2. 使用两个鳄鱼夹将电极连接至刺激器（图1A、B）。
3. 组装导管系统：首先，将一支23G皮下注射针头通过导管连接至三通旋塞阀，再将旋塞阀连接至压力传感器。然后，将一支10 mL注射器连接至旋塞阀的第三个端口，用于提供肝素化生理盐水。
4. 在用肝素生理盐水（200 U/mL）充满整个系统后，仔细检查是否存在泄漏。随后将三通旋塞阀旋转至关闭注射器通道或压力传感器通道的位置（图1C）。
5. 将针头抬高至比木垫高20 cm的位置，然后将压力记录系统校准为20 cm H₂O。之后，调节针头高度以验证记录系统的准确性。重复校准过程，直至确认系统准确无误。
6. 将大鼠从动物饲养设施转移至手术室，并使其适应手术室环境至少30分钟。
7. 手术前立即用70%乙醇喷洒已灭菌的器械

2. 手术步骤

1. 以戊巴比妥钠按每公斤体重 45 mg 的剂量进行腹腔注射麻醉大鼠，等待 5–10 分钟。通过夹捏脚趾确认麻醉效果。
2. 使用电动剃刀剃除腹部和颈部的毛发，并将大鼠仰卧位放置于加热垫上。
3. 用浸有 10% 聚维酮碘溶液的棉球擦拭手术区域，随后用浸有 70% 乙醇的棉球擦拭。同时涂抹眼用软膏，防止眼睛干燥。
4. 插管左侧颈总动脉。
   1. 用镊子夹住颈部皮肤，在颈部中央做一横向切口。切开肌肉，小心暴露左侧颈总动脉，并分离出约 5 mm 长的一段血管。
   2. 用镊子小心将颈总动脉与迷走神经分离，在颈总动脉下方穿入丝线缝合线，在血管尾端打一松结，然后在头端打一紧结。
   3. 在缝线近端上方用动脉夹夹闭血管，以阻断血流。
   4. 用显微外科剪刀小心在血管上剪开一小口，在显微解剖钩和镊子的辅助下，将动脉导管向心脏方向插入。
   5. 收紧尾端的松结，将导管固定。移除动脉夹以恢复血流。
5. 分离阴部神经并放置电极
   1. 用镊子提起腹部的皮肤和肌肉，使用解剖剪从下腹部沿中线剪至阴茎，形成一个正中切口。
   2. 用棉签轻轻将肠管推向上腹部腔内。
   3. 用镊子夹住膀胱，将其从腹腔中拉出，暴露位于尿道腹侧的前列腺腹侧叶。
   4. 拉出前列腺腹侧叶、精囊和输精管，以暴露前列腺背侧叶。找到输精管与前列腺的附着点。
   5. 分离前列腺与输精管之间的间隙。小心暴露位于前列腺与输精管连接点后方的纤维囊。然后找到主要盆腔神经节（图 2）。
      注：主要盆腔神经节和海绵体神经可在前列腺表面观察到。
   6. 用无菌棉签小心擦干海绵体神经区域。 小心分离并用双极电极钩住右侧海绵体神经。
6. 插管左侧阴茎脚
   1. 用解剖剪在阴茎皮肤上剪开一小切口，然后小心剥离阴茎干的皮肤。
   2. 解剖阴茎横纹肌，找到耻骨的上支。
   3. 暴露覆盖海绵体球的球海绵体肌。
   4. 使用弯头镊子将球海绵体肌与坐骨海绵体肌分开。
   5. 用弯头镊子小心分离坐骨海绵体肌，然后剪开该肌肉，以暴露阴茎脚白膜（白膜）。
   6. 沿阴茎脚海绵体的解剖方向，小心通过白膜将针头插入阴茎脚海绵体。
      注：此步骤是成功插管的关键。可注射少量肝素化生理盐水，若针头位置正确，应可观察到轻微的阴茎肿胀。
   7. 小心释放针头，避免针头滑动或连接管路移位。检查是否有渗漏。

3. 刺激 CN

1. 打开压力信号记录软件程序，并开始记录压力信号。
2. 设置刺激参数：15 赫兹，脉冲宽度为 5 毫秒，电压为 5 伏，持续时间为 60 秒。以 15 Hz 的频率和 5 ms 的脉冲宽度刺激 CN。
   注意：施加电刺激时可观察到颅内压（ICP）迅速升高。
3. 每次刺激之间留出 30 分钟的休息间隔。每只动物最多连续刺激三次。

4. 结束实验流程

1. 记录完成后，通过注射过量戊巴比妥钠（剂量为每公斤体重150 mg）实施安乐死。通过检测大鼠的动脉压确认其死亡。移走大鼠，并清洁手术器械。

5. 数据分析

1. 保存并导出软件中的数据。反应通常表示为颅内压（ICP）与全身平均动脉压（MAP）的比值。通过计算峰值ICP/MAP比值来评估勃起功能。
2. 汇总至少五只大鼠的数据，并使用统计学软件进行分析。采用Student t检验，当p < 0.05时认为差异具有统计学意义。

结果

大量研究表明，老年男性勃起功能障碍正成为一个常见问题。然而，在治疗与衰老相关的勃起功能障碍（ED）方面，医学手段仍存在局限性¹⁶。在与衰老相关的ED啮齿类动物模型中，许多疗法已在老年大鼠的勃起功能上进行了测试。正如上文所述，阴茎海绵体内压（ICP）记录检测可用于从全部实验动物中区分出ED动物，同时也可用于量化潜在治疗手段或药物对勃起功能的影响。

如图3A所示，ED组（老年ED大鼠，AE，18月龄）典型的ICP反应曲线明显低于对照组（年轻正常大鼠，YN，3月龄）。通常选择最高ICP值进行统计分析。通过计算ICP/MAP比值，来自5只大鼠的汇总数据显示，AE组的ICP/MAP比值也较对照组显著降低（图3B）。除这两个关键参数外，老年ED大鼠的峰值ICP、平台期ICP、消退时间、反应持续时间以...

讨论

作为勃起功能的直接测量指标，ICP 是一种可靠的方法¹⁴可获取基础颅内压、峰值颅内压、平台期颅内压、勃起潜伏时间及消退时间、反应持续时间等数据， 等等除了这些直接测量的参数外，还有一些其他指标参数：（1） "T80"达到峰值颅内压80%所需的时间；（2） "D20"，降至峰值ICP的20%所需的时间；（3）“ΔT80”"，T80 时压力的上升速率（每秒）；以及（4）“ΔD20”"D20时每秒压力下降速率。这些参数可用于量化各个阶段及ICP反应的质量，从而反映疾病的影响并评估药物的疗效^14,17该ICP记录方法在ED动物模型中被广泛应用。在本方案中，我们比较了年轻与老年ED大鼠的ICP反应。如果给予药物 通过 如果需要放置阴茎海绵体导管，可通过将另一根阴茎海绵体导管置入对侧阴茎海绵体脚来完成¹⁷注射总体积应小于0.1 mL。药物可经腹腔或皮下途径...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
动物
大鼠			品系：Sprague-Dawley 年龄：2-3 月龄
大鼠			品系：Sprague-Dawley 年龄：15-18 月龄
名称	公司	货号	备注
试剂
生理盐水	Sigma-Aldrich, S7653		将 8.5 克氯化钠溶解于蒸馏水中
戊巴比妥钠溶液	Sigma-Aldrich, P3761		将 1 克溶解于 100 ml 生理盐水中
聚维酮碘	BTP Pharmaceutical Co. Limited		10% (V/V)
乙醇	中国医药集团有限公司（SINOPHARM）		70% (V/V)
肝素	Sigma-Aldrich, H3149		将 20000U 肝素溶解于 100 ml 生理盐水中
名称	公司	货号	备注
材料
皮下注射针头	山东威高集团医用高分子制品股份有限公司	23G
注射器	山东威高集团医用高分子制品股份有限公司	10 ml
三通阀	成都仪器厂	TSK 01
电极	成都仪器厂	JST-1
导管管路	成都仪器厂	PE-10, PE-50
手术剪	上海手术器械厂	J22010, J22020
眼科手术剪	上海手术器械厂	Y00010, Y00020
眼科镊	上海手术器械厂	JD1010, JD1020
显微剪	World Precision Instruments	WAA260
丝线缝合线	山东威高集团医用高分子制品股份有限公司	5-0
名称	公司	货号	备注
设备
刺激器	南京美迪赛科技有限公司（型号 4C501H）		15 Hz，5 ms 脉冲，5 V，持续时间 60 s，间隔 5 分钟
多通道信号采集处理系统	南京美迪赛科技有限公司（型号 4C501H）		血压模型
压力传感器	北京欣航星业科技贸易有限公司（型号 YP100）		40KPa