本文介绍了制备具有高度磁响应性的镧系离子螯合多分子组装体的方法。其磁响应性由组装体的尺寸决定，而尺寸可通过纳米孔膜挤出过程进行调控。通过双折射测量监测组装体的磁取向能力及温度诱导的结构变化，该方法可作为核磁共振和小角中子散射技术的有力补充。
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摘要
摘要
双分子层小盘（bicelles）是由多种脂质混合物形成的可调控的盘状多分子组装体。其应用范围广泛，从利用核磁共振（NMR）进行膜蛋白结构研究，到包括形成光学活性和磁性可切换凝胶在内的纳米技术开发。此类技术需要对组装体的尺寸、磁响应性和热稳定性进行高度控制。1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DMPC）与其镧系离子（Ln3+）螯合磷脂偶联物1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-二乙烯三胺五乙酸（DMPE-DTPA）的混合物可组装成具有高度磁响应性的双分子层小盘，例如DMPC/DMPE-DTPA/Ln3+（摩尔比4:1:1）小盘。在双分子层中引入胆固醇（Chol-OH）和类固醇衍生物则可形成另一类具有独特物理化学性质的组装体。对于特定脂质组成，磁取向能力与双分子层小盘的尺寸成正比。Ln3+的络合导致磁响应在强度和取向方向上均达到前所未有的水平。加热时，盘状结构可逆地塌缩为囊泡，从而可通过具有特定孔径的膜滤器挤出，以调控组装体的尺寸。通过冷却至5 °C可重新生成具有磁取向性的双分子层小盘，其组装尺寸由囊泡前体决定。本文详细说明了该制备方法，并在5.5 T磁场下通过双折射测量对组装体的磁取向能力进行量化。源自磷脂双分子层的双折射信号还可用于监测双分子层中发生的多分子变化。这一简单技术可作为常用于表征双分子层小盘的核磁共振实验的有力补充。
引言
双分子层小盘是由多种脂质混合物形成的盘状多分子聚集体。1,2,3,4,5 它们被广泛用于通过核磁共振波谱法对膜生物分子进行结构表征。6,7 然而，近期的研究致力于拓展其可能的应用领域。5,8,9 最受研究的bicelle体系由1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DMPC），构成组装体的平面部分，以及1,2-二己酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DHPC）磷脂覆盖边缘。1,2,3 构成双层结构的磷脂分子几何构型决定了自组装多分子结构的构架。4
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方案
1. DMPC/DMPE-DTPA/Tm3+（摩尔比 4:1:1）和 DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3+（摩尔比 16:4:5:5）多分子组装体的制备步骤
- 初步准备
- 用乙醇稳定化的氯仿冲洗所有玻璃器皿一次>99% 氯仿）并用压缩空气吹干。
- 制备两种不同的储备液，浓度均为 10 mg/mL，分别将 DMPC 和 DMPE-DTPA 溶于乙醇稳定的氯仿中（>99% 氯仿），10 mM 胆固醇（Chol-OH）乙醇稳定氯仿储备液（>99% 氯仿）和 10 mM 的 TmCl 储存液3 在甲醇中。
- 将0.121 g二水合磷酸二氢钠和0.599 g无水磷酸氢二钠溶于100 mL超纯水中，配制pH为7.4的50 mM磷酸盐缓冲液2O.
- 干燥脂质膜的制备
- 称取所需量的两亲分子（DMPC、DMPE-DTPA，以及可选的 Chol-OH）和 Ln3+ 使用2.5 mL玻璃注射器将储备液分别加入3 mL玻璃扣杯中。
- 对于3 mL的DMPC/DMPE-DTPA/Tm3+样品（摩尔比为4:1:1，总脂质浓度为15 mM），称取3.6435 g DMPC储备液、1.4731 g DMPE-DTPA储备液和0.7126 g TmCl₃
- 称取所需量的两亲分子（DMPC、DMPE-DTPA，以及可选的 Chol-OH）和 Ln3+ 使用2.5 mL玻璃注射器将储备液分别加入3 mL玻璃扣杯中。
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结果
在5.5 T磁场下，监测了非挤出DMPC/DMPE-DTPA/Tm3+（摩尔比4:1:1）样品在5至40 °C之间以1 °C/min的速率进行升温和降温循环过程中的双折射信号（图6）。双折射结果证实，在5 °C时具有较高的磁取向性，其值为1.5 × 10-5，是已报道的挤出体系的两倍。6,7,23 当温度超过DMPC的相变温度Tm（24 °C）时，双折射信号归零，这是由于形成了无法取向的囊泡。液态无序相的出现引发了多分子组装体的重大重排，这些重排具有热可逆性。当降温至Tm以下时，可取向物种重新生成，双折射信号的变化趋势与升温时相同。在Tm附近出现的明显峰标志着可取向组装体被不可取向囊泡所取代。
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讨论
Isabettini 等23详细描述了如何将双折射测量与小角中子散射（SANS）实验相结合，用于评估制备具有高磁响应性的Ln3+螯合磷脂组装体的方法。所提出的制备方案同样适用于由较长链的DPPC和DPPE-DTPA磷脂组成的组装体，或其双分子层中含有化学修饰类固醇衍生物的组装体11,12,17,18,19。唯一的要求是在步骤1.3.2、1.3.3、1.3.4和1.4.2中将样品逐步加热至足够高的温度。该温度必须足以使双分子层中的脂质进入液态无序相，以确保干燥脂质膜或样品再生过程中的充分水合。例如，DPPC/DPPE-DTPA/Tm3+（摩尔比4:1:1）组装体需加热至超过DPPC相变温度42 °C的温度，而.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢瑞士国家科学基金会对SMhardBi项目（项目编号200021_150088/1）的资助。小角中子散射（SANS）实验在瑞士保罗谢勒研究所（Paul Scherrer Institute）位于维利根的瑞士散裂中子源SINQ完成。作者衷心感谢Joachim Kohlbrecher博士在SANS实验方面的指导。在强磁场下进行双折射测量的实验装置设计灵感来源于荷兰奈梅亨的高场磁实验室（HFML）现有的装置。我们感谢Bruno Pfister在双折射装置电子系统开发中的帮助，感谢Jan Corsano和Daniel Kiechl在构建激光精密且便捷对准所需框架方面的工作，以及Bernhard Koller博士在技术上的持续支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1,2-二肉豆蔻酰基-sn二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DMPC） | Avanti Polar Lipids | 850345P | >99% |
| 1,2-二肉豆蔻酰基-sn二亚乙基三胺五乙酸-二甲基磷乙醇胺己铵盐（DMPE-DTPA） | Avanti Polar Lipids | 790535P | >99% |
| 氯化铥(III) | Sigma-Aldrich | 439649 | 无水，粉末，99.9% 痕量金属基准 |
| 氯化镝(III) | Sigma-Aldrich | 325546 | 无水，粉末，99.9% 痕量金属基准 |
| 氯化镱(III) | Sigma-Aldrich | 439614 | 无水，粉末，99.9% 痕量金属基准 |
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | 319988 | 含乙醇作为稳定剂，ACS级试剂， ≥99.8% |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | 34860 | ≥99.9% |
| 胆固醇 | Amresco | 433 | 超纯级 |
| D2O | ARMAR 化学品 | 1410 | 99.8 原子百分比 D |
| 超纯水 | Millipore | Synergy pak2 (SYPK0SIX2)，Millipack GP (MPGP02001) | |
| 电子pH计 | Metrohm | 17440010 | |
| Whatmann Nuclepore 25 mm 100 nm 膜滤器 | VWR | 515-2028 | |
| Whatmann Nuclepore 25 mm 200 nm 膜滤器 | VWR | 515-2029 | |
| Whatmann Nuclepore 25 mm 400 nm 膜滤器 | VWR | 515-2030 | |
| Whatmann Nuclepore 25 mm 800 nm 膜滤器 | VWR | 515-2032 | |
| 沃特曼滤纸 | VWR | 230600 | |
| 25 ml 圆底烧瓶 | VWR | 201-1352 | 14/23 染色体易位 |
| 3 ml 玻璃扣盖管 | VWR | 548-0554 | ND18，18×30毫米 |
| 2.5 ml 玻璃注射器 | Hamilton | ||
| 磷酸二氢钠二水合物 | Merk | 1.06342 | 用于配制磷酸盐缓冲液的盐 |
| 磷酸氢二钠 | Merk | 1.06586 | 用于制备磷酸盐缓冲液的盐 |
| 液氮 | Carbagas | - | |
| 加压氮气 | Carbagas | - | 200 巴气瓶 |
| 10 ml 脂质挤出器 | Lipex | - | 配备完整的热筒装置 |
| 高压PVC管 | GR NETUM | - | 必须能承受超过 4 MPa 的压力 |
| Serto 适配器 | Sertot | - | |
| 腈纶手套 | VWR | - | |
| 2 ml 玻璃移液管 | VWR | 612-1702 | 230 毫米长 |
| 二极管激光器 | 纽波特 | LPM635-25C | |
| DSP双相锁相放大器 | SRS | SR830 | |
| 光电二极管检测器 | Silonex Inc. | SLSD-71N5 | 5 mm²，硅，光电导 |
| 5.5 T 低温磁体 | Cryogenic/Oerlikon 公司 | - | 12 巴氦气冷却。RW4000/6000 压缩机，RGD 5/100 TA 冷头 |
| 二阶低通滤波器 | 自制 | - | 线性电源 24V 直流，二阶，Sallen-Key 型，截止频率 360 Hz，±12V，最大电流 10 mA |
| 光弹性调制器 | Hinds Instruments | PEM-90 | |
| 格兰-汤普森方解石偏振器 | 纽波特 | 10GT04 | 25.4 mm 直径 |
| 石英样品比色皿 | 赫尔马 | 165-10-40 | 温度控制样品池，0.8 ml，10 mm 光程 |
| 温度探针 | 温度控制 | - | K型，0.5 mm直径，Thermocoax |
| 非偏振镜 | 纽波特 | 50326-1002 | 25.4 mm |
| RS 232 电缆 | 国家仪器公司 | 189284-02 | 用于连接 Compact FieldPoint 控制器前面板上的 RS-232 端口 |
| BNC 50 Ω 电缆和连接器 | 国家仪器公司 | 763389-01 | |
| cFP-AI-110 | 国家仪器公司 | 777318-110 | Compact FieldPoint 的 8 通道模拟电压和电流输入模块 |
| cFP-CB-1 | 国家仪器公司 | 778618-01 | 用于 Compact FieldPoint I/O 接线的集成连接器模块 |
| cFP-CB-3 | 国家仪器公司 | 778618-03 | 用于将热电偶连接至 cFP-TC-120 模块的集成等温连接块 |
| cFP-TC-120 | 国家仪器公司 | 777318-120 | Compact FieldPoint 8通道热电偶输入模块 |
| cFP-1804 | 国家仪器公司 | 779490-01 | NI Compact FieldPoint 的以太网/串行接口 |
| LabView 2010 | 国家仪器公司 | - | |
| 工业电源 | Traco Power | TCL 060-124 | 100-240V 交流电 |
| 水浴锅 | Julabo | FP40-HE | 制冷/加热循环器 |
参考文献
- Sanders, C. R., Hare, B. J., Howard, K. P., Prestegard, J. H. Magnetically-oriented phospholipid micelles as a tool for the study of membrane-associated molecules. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 26, 421-444 (1994).
- Glover, K. J., et al. Structural evaluation of phospholipid bicelles for solution-state studies of membrane....
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重印与许可
