磁响应性镧系离子螯合磷脂组装体的设计、制备工艺与双折射测量

Stéphane Isabettini; Mirjam E. Baumgartner; Peter Fischer; Erich J. Windhab; Marianne Liebi; Simon Kuster

doi:10.3791/56812

需要JoVE订阅才能观看此内容。请登录或开始免费试用

方法文章

磁响应性镧系离子螯合磷脂组装体的设计、制备工艺与双折射测量

7K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/56812

⸱

2018年1月3日

Stéphane Isabettini¹ , Mirjam E. Baumgartner¹ , Peter Fischer¹ , Erich J. Windhab¹ , Marianne Liebi² , Simon Kuster¹

¹Laboratory of Food Process Engineering, ETH Zurich, ²MAX IV Laboratory, Lund University

本文内容

摘要

本文介绍了制备具有高度磁响应性的镧系离子螯合多分子组装体的方法。其磁响应性由组装体的尺寸决定，而尺寸可通过纳米孔膜挤出过程进行调控。通过双折射测量监测组装体的磁取向能力及温度诱导的结构变化，该方法可作为核磁共振和小角中子散射技术的有力补充。

摘要

双分子层小盘（bicelles）是由多种脂质混合物形成的可调控的盘状多分子组装体。其应用范围广泛，从利用核磁共振（NMR）进行膜蛋白结构研究，到包括形成光学活性和磁性可切换凝胶在内的纳米技术开发。此类技术需要对组装体的尺寸、磁响应性和热稳定性进行高度控制。1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DMPC）与其镧系离子（Ln³⁺）螯合磷脂偶联物1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-二乙烯三胺五乙酸（DMPE-DTPA）的混合物可组装成具有高度磁响应性的双分子层小盘，例如DMPC/DMPE-DTPA/Ln³⁺（摩尔比4:1:1）小盘。在双分子层中引入胆固醇（Chol-OH）和类固醇衍生物则可形成另一类具有独特物理化学性质的组装体。对于特定脂质组成，磁取向能力与双分子层小盘的尺寸成正比。Ln³⁺的络合导致磁响应在强度和取向方向上均达到前所未有的水平。加热时，盘状结构可逆地塌缩为囊泡，从而可通过具有特定孔径的膜滤器挤出，以调控组装体的尺寸。通过冷却至5 °C可重新生成具有磁取向性的双分子层小盘，其组装尺寸由囊泡前体决定。本文详细说明了该制备方法，并在5.5 T磁场下通过双折射测量对组装体的磁取向能力进行量化。源自磷脂双分子层的双折射信号还可用于监测双分子层中发生的多分子变化。这一简单技术可作为常用于表征双分子层小盘的核磁共振实验的有力补充。

引言

双分子层小盘是由多种脂质混合物形成的盘状多分子聚集体。¹^,²^,³^,⁴^,⁵ 它们被广泛用于通过核磁共振波谱法对膜生物分子进行结构表征。⁶^,⁷ 然而，近期的研究致力于拓展其可能的应用领域。⁵^,⁸^,⁹ 最受研究的bicelle体系由1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DMPC），构成组装体的平面部分，以及1,2-二己酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DHPC）磷脂覆盖边缘。¹^,²^,³ 构成双层结构的磷脂分子几何构型决定了自组装多分子结构的构架。⁴^,⁵ 用 DMPE-DTPA 替代 DHPC 可制备出具有高磁响应性和可调控性的bicelle体系。¹⁰^,¹¹ DMPC/DMPE-DTPA/Ln³⁺ （摩尔比4:1:1）的bicelles可结合更多的顺磁性镧系离子（Ln³⁺在双层膜表面产生增强的磁响应。¹⁰ 此外，将水溶性的DHPC分子替换为DMPE-DTPA/Ln³⁺ 能够形成抗稀释的bicelles。¹¹

平面多分子组装体的磁取向性由其整体磁能决定，

静磁平衡方程 E_mag=-nΔχB²/2μ₀Nₐ，用于教学的示意图。 (1)

其中 B 为磁场强度，磁导率方程 μ₀=4π×10⁻⁷；物理概念图中的关键公式磁常数，n 为聚集数静态平衡方程中的Δχ；ΣFx=0；方法示意图；教学用途。脂质双层组分的分子抗磁化率各向异性。因此，DMPC/DMPE-DTPA/Ln 的响应³⁺ 通过改变螯合的镧系元素（Ln）的种类，可轻易调节双层磁性脂质体（bicelles）对磁场的响应性，这种响应性由其尺寸（聚集数 n）和分子抗磁化率各向异性 Δχ 所决定。³⁺.¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵ 在双分子层中引入胆固醇（Chol-OH）或其他类固醇衍生物，可调节聚集体数量 n 和组装体的磁化率 Δχ。¹¹^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹ 对于特定的脂质组成，较大的组装体含有更多能够对E产生贡献的脂质_磁（较大的聚集体数量 n），从而产生更多可比对的物种。例如，DMPC/DHPC 双层磁取向微粒（bicelles）的尺寸通常通过优化其组成脂质的比例或总浓度来控制。²⁰^,²¹^,²² 尽管这在DMPC/DMPE-DTPA/Ln中是可能的³⁺ 双分子层小片，其在加热时可发生从双分子层小片到囊泡的热可逆转变，从而提供额外的调控选择。通过膜滤器挤出等机械方法可实现对囊泡形态的塑造。冷却后，磁可取向的双分子层小片得以重新形成 5 °C 其尺寸由囊泡前体决定。¹¹ 本文重点探讨采用DMPC/DMPE-DTPA/Tm的机械法制备工艺的潜力³⁺ （摩尔比 4:1:1）或 DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm³⁺ （摩尔比16:4:5:5）作为参照体系。当使用其他Ln时，该过程以类似方式进行。³⁺ 高于 Tm³⁺这些技术所提供的广泛可能性在下文中被重点强调图1 并在其他地方进行了广泛讨论。²³

脂质膜水合与挤出过程示意图；DMPC，胆固醇；温度效应；囊泡形成。
图1：可能的制备流程示意图。 所研究的磁性可取向 Ln³⁺ 螯合多分子组装体由 DMPC/DMPE-DTPA/Tm³⁺（摩尔比 4:1:1）或 DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm³⁺（摩尔比 16:4:5:5）组成。干燥的脂质膜用 pH 7.4 的 50 mM 磷酸盐缓冲液进行水合，总脂质浓度为 15 mM。脂质膜的有效水合需要经过冻融循环（FT）或加热-冷却循环（H&C）。在最后一次冻融步骤后，或对于长期冷冻保存后拟使用且无需进一步挤出的样品，需进行 H&C 循环以实现再生。这些步骤已在 Isabettini et al.²³ 的研究中被广泛讨论。通过调控脂质组成，可获得最大磁取向性的多分子组装体，并形成不同的组装结构。通过纳米孔膜过滤器挤出（Ext）可调节双层微粒（bicelle）的尺寸和磁取向性。所示的取向因子 A_f 是基于经 800、400、200 或 100 nm 孔径挤出的 DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm³⁺（摩尔比 16:4:5:5）样品的二维小角中子散射（SANS）图谱计算得出。SANS 测量是一种量化双层微粒取向程度的补充手段，本文不对此做进一步详细讨论。¹¹^,¹⁶ A_f 的取值范围为 -1（中子散射呈平行分布，即双层微粒相对于磁场方向垂直取向）至 0（各向同性散射）。请点击此处查看该图的放大版本。

双分子层结构（bicelles）的结构已通过多种表征技术得到了广泛研究。¹³ 对于暴露在磁场中的双分子层结构，其取向性可通过核磁共振（NMR）波谱法或小角中子散射（SANS）实验进行定量分析。⁵^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁴^,²⁵ 然而，在存在 Ln³⁺ 的情况下，NMR 谱峰的位移和展宽对该方法构成了严重限制。¹⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁸ 尽管 SANS 实验不受此限制，但仍需要其他更简便易行的技术，以实现对溶液中磁诱导组装取向的常规定量分析。双折射测量是一种可行且相对简单的方法。与 NMR 实验类似，双折射测量可提供有关双分子层中脂质重排及脂质相变的有价值信息。此外，还可监测多分子组装体在温度等环境条件变化时发生的几何形变。¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁶ 磁诱导双折射 Δn′ 已被用于研究多种类型的磷脂体系。¹³^,²⁹^,³⁰ 基于磁场中相位调制技术的双折射测量，是一种检测双分子层结构取向的有效方法。¹²^,¹⁶^,¹⁸^,²⁹^,³¹^,³² M. Liebi et al. 还证明了在高达 35 T 的强磁场下利用双折射研究双分子层结构的可能性。¹³

当偏振光进入各向异性材料时，会被折射为寻常波和非寻常波。¹¹ 这两列波具有不同的传播速度，并因延迟量 δ 而产生相位偏移。通过测量延迟量 δ，并将其转换为双折射信号 Δn', 折射率变化, 光学研究, 公式, 光子学, 光谱拟合图，可利用以下公式量化材料的各向异性程度：

折射率变化方程 Δn'=-δλ/2πd；光学测量分析公式。 (2)

其中 λ 为激光的波长，d 为样品的厚度。磷脂具有光学各向异性，其光轴与其长分子轴一致，与烃链尾部平行。¹¹^,¹² 若磷脂在溶液中随机取向，则测不到延迟效应。当磷脂相互平行排列时，可测得延迟效应。磁诱导双折射 $Δn', refractive index change, optical study, formula, photonics, spectral fitting diagram.$ 的符号可正可负，取决于分子在磁场中的取向；见图2。沿 x 轴平行排列的磷脂将产生负的 $Δn', refractive index change, optical study, formula, photonics, spectral fitting diagram.$ ，而沿 z 轴排列的磷脂则产生正的 $Δn', refractive index change, optical study, formula, photonics, spectral fitting diagram.$ 。当光轴与光传播方向一致时（即磷脂平行于 y 轴排列），不观察到双折射现象。

光源自、磁场（B）、布朗运动、Δn' 方程的静态平衡示意图。
图2：磷脂分子的取向及其对应的磁致双折射符号 Δn' 符号，光学研究中折射率变化的概念。。所测得的符号取决于磷脂分子在磁场中的取向。虚线表示分子的光轴。入射光偏振方向为45°，沿y方向传播。磁场B沿z方向。本图改编自M. Liebi¹¹。请点击此处查看此图的放大版本。

对于各向同性的bicelle胶体悬浮液，由于双层中磷脂排列所诱导的取向将消失，导致延迟δ为零。为了使双层中的光学活性磷脂发生取向，bicelle必须实现定向排列，从而引起偏振光的延迟δ。因此，双折射是一种灵敏的工具，可用于量化多分子组装体的磁取向能力。当bicelle垂直于磁场方向排列时，将产生正的 Δn', 折射率变化, 光学研究, 公式, 光子学, 光谱拟合图；而当其平行于磁场排列时，则产生负的。该符号取决于实验装置的取向，可通过参考样品进行验证。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. DMPC/DMPE-DTPA/Tm³⁺（摩尔比 4:1:1）和 DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm³⁺（摩尔比 16:4:5:5）多分子组装体的制备步骤

初步准备
1. 用乙醇稳定化的氯仿冲洗所有玻璃器皿一次>99% 氯仿）并用压缩空气吹干。
2. 制备两种不同的储备液，浓度均为 10 mg/mL，分别将 DMPC 和 DMPE-DTPA 溶于乙醇稳定的氯仿中（>99% 氯仿），10 mM 胆固醇（Chol-OH）乙醇稳定氯仿储备液（>99% 氯仿）和 10 mM 的 TmCl 储存液₃ 在甲醇中。
3. 将0.121 g二水合磷酸二氢钠和0.599 g无水磷酸氢二钠溶于100 mL超纯水中，配制pH为7.4的50 mM磷酸盐缓冲液₂O.
干燥脂质膜的制备
1. 称取所需量的两亲分子（DMPC、DMPE-DTPA，以及可选的 Chol-OH）和 Ln³⁺ 使用2.5 mL玻璃注射器将储备液分别加入3 mL玻璃扣杯中。
  1. 对于3 mL的DMPC/DMPE-DTPA/Tm3+样品（摩尔比为4:1:1，总脂质浓度为15 mM），称取3.6435 g DMPC储备液、1.4731 g DMPE-DTPA储备液和0.7126 g TmCl₃₃ 储备液
  2. 对于3 mL体积的DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm样品³⁺ （摩尔比16:4:5:5，总脂质浓度15 mM），称取2.9148 g DMPC储备液、1.4731 g DMPE-DTPA储备液、1.0749 g Chol-OH储备液和0.7126 g TmCl₃₃ 储备液
    警告：氯仿和甲醇在室温下具有毒性和挥发性。应在通风橱中操作，并立即进行质量测定。
2. 将 snap-cups 中的内容物转移至 25 mL 圆底烧瓶中。用约 2.5 mL 相应溶剂冲洗每个 snap-cup，并将洗涤液一并转入圆底烧瓶中。
3. 在旋转蒸发仪中减压除去溶剂 40 °C将初始压力设为 30 000 Pa，直至大部分溶剂被去除。随后将压力降至 100 Pa，在旋转条件下干燥样品至少 2 小时。在烧瓶的玻璃壁上获得一层均匀的干燥脂质膜。
4. 将干燥的脂质膜置于稳定的氩气气流下1分钟，以避免脂质在空气中氧化，并在重新水化前将样品储存于冷冻器中。
干燥脂质膜的水合
1. 向圆底烧瓶中加入 3 mL 磷酸盐缓冲液，使总脂质浓度达到 15 mM。
2. 通过将烧瓶在旋转条件下浸入液氮中进行冻融（FT）循环，直至完全冻结（液氮停止沸腾），然后重新加热至 60 °C 将样品置于水浴中5分钟，并持续旋转烧瓶以促进融化过程。每次冷冻循环前，当样品处于液态时，进行30秒涡旋振荡，以促进脂质膜的水合。
  注意：第二次冻融循环后，烧瓶壁上不应有可见的脂质膜。
3. 重复步骤1.3.2共五次。当样品处于高温时，用瓶盖封闭烧瓶，以避免磷酸盐缓冲液不必要的蒸发。当样品处于冷冻状态时，可暂停本实验方案。
4. 继续进行两轮加热与冷却（H&C) 进行循环以稳定经过最后一次冷冻步骤后的样品，或在最长两个月内保持冷冻状态。将样品加热至 40 或 60 °C 用于DMPC/DMPE-DTPA/Tm³⁺ （摩尔比 4:1:1）或 DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm³⁺ （摩尔比为16:4:5:5），随后降温至 5 °C 在 1 °C每分钟维持样品在循环的最高和最低温度下5分钟。
5. 现在，可选择在外部磁场中测定样品的双折射信号（步骤2），或进一步挤出样品以调节bicelle的尺寸和磁取向能力（步骤1.4）。
  注意：DMPC/DMPE-DTPA/Tm³⁺ （摩尔比4:1:1）样品主要由平均流体动力学直径D的bicelles构成_H 70 nm，由动态光散射（DLS）测量获得的粒径分布结果显示 5 °C这些样品还含有较大的多分子组装体，其平均D_H 由强度分布揭示的500 nm粒径。DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm³⁺ （摩尔比16:4:5:5）样品的粒径分布高度多分散，典型的强度分布显示其平均D_H 700 nm，而数量分布显示，粒径在200 nm范围内的较小bicelles占主导。这些样品更详细的粒径分布和冷冻透射电子显微镜图像已由Isabettini等人报道等²³
多分子组装体的挤出
1. 如图所示组装挤出机图3使用手套和镊子操作，并用保护性硅胶管保护硅胶管。在滤纸（5）上滴加数滴缓冲液使其湿润，以利于膜滤器（6）的准确放置。放置O形圈（7）后，确保滤纸无任何褶皱。
  注意：已使用孔径为800、400、200和100 nm的膜滤器（6）测试挤出过程；参见图7.
2. 将水浴锅温度设定为 40 °C 用于DMPC/DMPE-DTPA/Tm³⁺ （摩尔比 4:1:1）样品或 60 °C 用于 DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm³⁺ （摩尔比16:4:5:5）样品，以确保可挤出囊泡的形成。
3. 将挤出机通过一根高压PVC管连接至加压氮气瓶（> 4 MPa）并配备Serto接头，通过膜挤出液体材料。通常需要1 MPa的压力，以使样品通过孔径为200 nm及以上的膜滤器（6）；对于孔径为100 nm的较小膜滤器（6），则需要1.5–2.5 MPa的压力。
  注意：如果压力异常升高（>2.5 MPa）时，样品难以挤出（这是堵塞的第一个迹象）。
4. 打开盖子（10），使用2 mL玻璃移液管加入样品。然后关闭盖子（10），在握住样品出口管（2）的同时打开压力阀（12）。挤出循环完成后关闭压力阀（12），排气后继续下一个循环。
  注意：为避免样品因蒸发而过度损失，切勿使样品与加热套式容器（8）长时间接触。对于3 mL样品，在打开压力阀（12）前，30–60秒足以使其在挤出器中达到平衡。
5. 对给定膜孔径进行10次挤出循环，如图所示图3大多数bicelle体系需通过孔径为200 nm的膜挤压10次，再通过孔径为100 nm的膜挤压10次，以确保样品间的可比性。
6. 现在，测定样品在外部磁场中的双折射信号（步骤 2）。

用于固液分离的板框压滤机装置；包含滤盘、阀门；示意图。
图3：用于制备bicelle和囊泡的实验室挤出装置。 挤出装置自下而上组装：（1）底座，（2）样品收集空间，配有内径为2.4 mm的塑料出液管和O形圈，（3）和（4）大、小稳定网片，（5）滤纸，（6）膜过滤器，（7）O形圈，（8）夹套容器，（9）带进液口和压力连接口的上盖，（10）盖子，（11）蝶形螺钉，（12）压力阀。右侧为组装后挤出装置的示意图。氮气（N₂）由压力容器提供，夹套容器（9）连接水浴以控制温度。对于任意给定孔径的膜过滤器，样品需经过10次挤出循环（样品路径以蓝色表示）。请点击此处查看该图的放大版本。

2. DMPC/DMPE-DTPA/Tm³⁺（摩尔比 4:1:1）和 DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm³⁺（摩尔比 16:4:5:5）多分子组装体的双折射测量。

按照图4所示搭建并连接双折射实验装置，并为相应的电子元件供电。此阶段不要将光弹调制器（PEM）、样品和第二个偏振片放入激光光路中。为避免检测到背向散射的激光，可用黑纸覆盖反射表面（例如铝制镜片支架）。
调节反射镜，使探测器处的激光强度达到最大，该强度由图4B中低通滤波器输出的直流电流表示。
警告：调节反射镜时请佩戴合适的眼部防护装备；若首次操作激光器，请咨询激光安全指导人员。
旋转第一个正交线性偏振片（保持其与入射激光束垂直），以使达到最大值。

偏振测量装置；光学示意图 A，电子流程图 B，设备照片 C；用于研究双折射。
图4：双折射实验装置及光信号连接的示意图 A) 超导电磁体提供5.5 T的磁场。波长为635 nm的二极管激光器发出的光通过两个正交偏振片进行偏振。光电弹性调制器PEM-90在50 kHz频率下工作，振幅为A₀ 2.405 弧度，并置于两个偏振器之间。样品位于磁体中，处于 PEM 与第二个偏振器之间。非偏振镜将光引导通过各个元件，最终由光电探测器检测。一次谐波和二次谐波 $光子学方程图中用于光谱分析的光学激发公式 $I_{1\omega}$。$ 和光学激发过程，I2ω 公式，与光子学研究相关，示意图。交流信号的幅度被监测，从而能够计算双折射信号，以提供有关镧系元素磁取向能力的信息³⁺ 螯合多分子组装体。样品池通过外部水浴连接以控制温度（蓝色）。样品温度由温度探针监测（红色）。 B) 光电探测器的信号通过一根±12 V直流电源编织电缆（3）输入至一个二阶Sallen-Key低通滤波器（24 V交流电源），该滤波器的截止频率为360 Hz。低通滤波器提取直流分量静力平衡公式，ΣFx=0，用于教学参考与分析的数字示意图。并通过BNC 50 Ω电缆将其传输至PC接口（4）。光电探测器的信号被送至两个锁相放大器（用于提取一次谐波和二次谐波） $光子学方程图中用于光谱分析的光学激发公式 $I_{1\omega}$。$ 和光学激发过程，I2ω 公式，与光子学研究相关，示意图。 ) 通过 BNC 50 Ω 电缆 (1) & （2）通过相敏检测来探测谐波强度。因此，将PEM信号用作锁相放大器的参考信号（PEM的1f输出接入第一台锁相放大器，2f输出接入第二台锁相放大器，均通过BNC 50 Ω电缆连接）。输出信号通过BNC 50 Ω电缆传输至PC接口单元。模拟采集单元cFP-AI-110和cFP-CB-1对信号进行数字化处理，并通过RS 232电缆将数据传送到计算机进行监测。K型温度探头也连接至PC接口单元，由模拟采集单元cFP-CB-3和cFP-TC-120对信号进行数字化处理后，再通过RS 232电缆将数据传送到计算机进行监测。C）对应B中所示示意图的实物图。关键部件以1至4的编号标识。请点击此处以查看此图的放大版本。

将第二个交叉线性偏振器垂直于入射激光束放置，如图所示 图4A. 尽量减少通过将第二个偏振器设置为 90° 相对于第一个的角度
将光弹调制器（PEM）放置于 0° 位于两块交叉的线性偏振片之间，且垂直于入射激光束，如图所示 图4A将 PEM 调整至频率 50 kHz，振幅 A0 调整为 2.405 rad，如图所示 图5A这使得直流分量与双折射无关，并增强了 .
注意：可通过调节 PEM 的光轴几度，以保持恒定在测量任何样品之前，先在空气中进行校准。
打开激光器和电子设备后，等待1小时以使信号稳定。当锁相放大器的自动锁相保持恒定时，信号即达到稳定。
将样品置于光程为10 mm的控温石英比色皿中，并连接至初始设定温度的外部水浴 5 °C.
将一支0.5 mm厚的K型热电偶（温度探针）直接放入样品中，以监测样品温度。通过在激光光路（比色皿后方）放置一张白纸并观察探针是否产生阴影，来确认探针是否干扰激光光束。
注意：存在一个 2-3 °C 水浴温度记录与样品温度之间的差异
将比色皿放入磁体的孔隙中，如图所示 图 4A激光光束水平穿过样品，经非偏振镜反射后，由光电探测器检测。
注意：激光沿垂直方向穿过样品后原路返回，以抵消法拉第效应（即光在向下穿过磁场时其偏振面发生旋转，而在反向返回时该旋转效应被抵消）。
在比色皿上施加室温、10000 Pa的稳定压缩空气流，以防止水分在细胞壁上冷凝，否则会降低信号强度并增加噪声。这一点在进行测量时尤为重要 5 °C.
检测第一和第二谐波 $光子学方程图中用于光谱分析的光学激发公式 $I_{1\omega}$。$ 和使用两个锁相放大器检测交流信号的相位。通过按下图中所示按钮（2）对锁相放大器进行自动调相。 图5B 并根据所示调整灵敏度 图5B (1). 确保放大器上的红色条不超过四个，如图所示 图5B (3) 以避免信号过载。记录程序中两个锁相放大器所使用的灵敏度 Tesla_Magnet_Const_V092 如图所示 图5C (8). 该程序作为补充信息提供。
通过程序向磁体供电，将磁场强度逐步增加至5.5 T Tesla_Magnet_Const_V092 如图所示 图5C (5).
获得双折射使用公式 2 计算滞后量，其中滞后量的计算采用
(3)
其中和是第一类贝塞尔函数，具有和 .¹¹^,¹³^,¹⁸^,³³^,³⁴ 在程序中绘制滞后图 Tesla_Magnet_Const_V092，如图所示 图5C (4).
注意：如果两个锁相放大器未在相同的灵敏度下运行（参见步骤 2.12），则不应使用程序提供的延迟值来计算双折射信号。记录的谐波强度 $光子学方程图中用于光谱分析的光学激发公式 $I_{1\omega}$。$ 和必须乘以锁相放大器的灵敏度才能得到正确的量纲。此外，在磁场下测得的双折射信号必须通过减去在0 T时获得的平均双折射信号进行归一化处理。
在恒定或变化的温度下监测样品的双折射信号（1 °C/min）通过调节与比色皿相连的水浴温度来实现图4.
通过填写实验描述来记录实验数据 图5C (8)，在(9)中提供文件名，然后按下“START log”按钮(10)。

光弹性调制器装置、特斯拉磁体控制界面、光学性质测量、数据展示。
图5：实验装置示意图及程序界面截图。A) PEM 设置参数：延迟量 2.405 rad，波长 635 nm，频率 50 Hz。白色圆圈标示需激活的设置选项（USR = 用户自定义延迟量，LOC = 本地操作模式）。B) 锁相放大器设置。每次测量前应根据步骤 2.11 的要求选择合适的灵敏度（1）。显示屏（3）上的红色条数不应超过四个，以避免信号过载。当（1）处的红色 LED 灯亮起时，表示发生过载，此时无法进行测量。每次测量前应按下自动相位按钮（2）。C) 随补充材料提供的程序 Tesla_Magnet_Const_V092 的界面截图。该程序可用于控制磁场，并记录所有信号输出随时间的变化。图中（1）显示了磁场强度和样品温度的变化曲线。（2）显示了两个锁相放大器测得的交流信号的一次谐波 $光子学光谱分析中的光学激发公式 $I_{1\omega}$ 示意图。$ 和二次谐波光学激发过程，I2ω 公式，与光子学研究相关的示意图。。（3）显示了直流信号强度静态平衡公式，ΣFx=0，用于教学参考与分析的数字示意图。的变化曲线。延迟量的计算方法如步骤 2.13 所述，并在（4）中绘出。磁场强度在（5）中设定。（6）显示由 K 型热电偶直接测得的温度值，输出信号（静态平衡方程 ΣFx=0, MA=0，示意图，教学关键词，应力分析。和 $非线性光学概念，符号 $I_{2\omega}$，与倍频过程相关。$ ）显示在（7）中。（8）可用于输入其他样品信息，例如放大器使用的灵敏度、样品名称等。数据可记录并导出为（9）中提供的 .txt 文件。通过“START log”按钮（10）启动或停止数据采集。请点击此处查看此图的放大版本。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

在5.5 T磁场下，监测了非挤出DMPC/DMPE-DTPA/Tm³⁺（摩尔比4:1:1）样品在5至40 °C之间以1 °C/min的速率进行升温和降温循环过程中的双折射信号（图6）。双折射结果证实，在5 °C时具有较高的磁取向性，其值为1.5 × 10^-5，是已报道的挤出体系的两倍。⁶^,⁷^,²³ 当温度超过DMPC的相变温度T_m（24 °C）时，双折射信号归零，这是由于形成了无法取向的囊泡。液态无序相的出现引发了多分子组装体的重大重排，这些重排具有热可逆性。当降温至T_m以下时，可取向物种重新生成，双折射信号的变化趋势与升温时相同。在T_m附近出现的明显峰标志着可取向组装体被不可取向囊泡所取代。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

Isabettini 等²³详细描述了如何将双折射测量与小角中子散射（SANS）实验相结合，用于评估制备具有高磁响应性的Ln³⁺螯合磷脂组装体的方法。所提出的制备方案同样适用于由较长链的DPPC和DPPE-DTPA磷脂组成的组装体，或其双分子层中含有化学修饰类固醇衍生物的组装体¹¹^,¹²^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹。唯一的要求是在步骤1.3.2、1.3.3、1.3.4和1.4.2中将样品逐步加热至足够高的温度。该温度必须足以使双分子层中的脂质进入液态无序相，以确保干燥脂质膜或样品再生过程中的充分水合。例如，DPPC/DPPE-DTPA/Tm³⁺（摩尔比4:1:1）组装体需加热至超过DPPC相变温度42 °C的温度，而...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢瑞士国家科学基金会对SMhardBi项目（项目编号200021_150088/1）的资助。小角中子散射（SANS）实验在瑞士保罗谢勒研究所（Paul Scherrer Institute）位于维利根的瑞士散裂中子源SINQ完成。作者衷心感谢Joachim Kohlbrecher博士在SANS实验方面的指导。在强磁场下进行双折射测量的实验装置设计灵感来源于荷兰奈梅亨的高场磁实验室（HFML）现有的装置。我们感谢Bruno Pfister在双折射装置电子系统开发中的帮助，感谢Jan Corsano和Daniel Kiechl在构建激光精密且便捷对准所需框架方面的工作，以及Bernhard Koller博士在技术上的持续支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
1,2-二肉豆蔻酰基-sn二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DMPC）	Avanti Polar Lipids	850345P	>99%
1,2-二肉豆蔻酰基-sn二亚乙基三胺五乙酸-二甲基磷乙醇胺己铵盐（DMPE-DTPA）	Avanti Polar Lipids	790535P	>99%
氯化铥(III)	Sigma-Aldrich	439649	无水，粉末，99.9% 痕量金属基准
氯化镝(III)	Sigma-Aldrich	325546	无水，粉末，99.9% 痕量金属基准
氯化镱(III)	Sigma-Aldrich	439614	无水，粉末，99.9% 痕量金属基准
氯仿	Sigma-Aldrich	319988	含乙醇作为稳定剂，ACS级试剂， ≥99.8%
甲醇	Sigma-Aldrich	34860	≥99.9%
胆固醇	Amresco	433	超纯级
D2O	ARMAR 化学品	1410	99.8 原子百分比 D
超纯水	Millipore		Synergy pak2 (SYPK0SIX2)，Millipack GP (MPGP02001)
电子pH计	Metrohm	17440010
Whatmann Nuclepore 25 mm 100 nm 膜滤器	VWR	515-2028
Whatmann Nuclepore 25 mm 200 nm 膜滤器	VWR	515-2029
Whatmann Nuclepore 25 mm 400 nm 膜滤器	VWR	515-2030
Whatmann Nuclepore 25 mm 800 nm 膜滤器	VWR	515-2032
沃特曼滤纸	VWR	230600
25 ml 圆底烧瓶	VWR	201-1352	14/23 染色体易位
3 ml 玻璃扣盖管	VWR	548-0554	ND18，18×30毫米
2.5 ml 玻璃注射器	Hamilton
磷酸二氢钠二水合物	Merk	1.06342	用于配制磷酸盐缓冲液的盐
磷酸氢二钠	Merk	1.06586	用于制备磷酸盐缓冲液的盐
液氮	Carbagas	-
加压氮气	Carbagas	-	200 巴气瓶
10 ml 脂质挤出器	Lipex	-	配备完整的热筒装置
高压PVC管	GR NETUM	-	必须能承受超过 4 MPa 的压力
Serto 适配器	Sertot	-
腈纶手套	VWR	-
2 ml 玻璃移液管	VWR	612-1702	230 毫米长
二极管激光器	纽波特	LPM635-25C
DSP双相锁相放大器	SRS	SR830
光电二极管检测器	Silonex Inc.	SLSD-71N5	5 mm²，硅，光电导
5.5 T 低温磁体	Cryogenic/Oerlikon 公司	-	12 巴氦气冷却。RW4000/6000 压缩机，RGD 5/100 TA 冷头
二阶低通滤波器	自制	-	线性电源 24V 直流，二阶，Sallen-Key 型，截止频率 360 Hz，±12V，最大电流 10 mA
光弹性调制器	Hinds Instruments	PEM-90
格兰-汤普森方解石偏振器	纽波特	10GT04	25.4 mm 直径
石英样品比色皿	赫尔马	165-10-40	温度控制样品池，0.8 ml，10 mm 光程
温度探针	温度控制	-	K型，0.5 mm直径，Thermocoax
非偏振镜	纽波特	50326-1002	25.4 mm
RS 232 电缆	国家仪器公司	189284-02	用于连接 Compact FieldPoint 控制器前面板上的 RS-232 端口
BNC 50 Ω 电缆和连接器	国家仪器公司	763389-01
cFP-AI-110	国家仪器公司	777318-110	Compact FieldPoint 的 8 通道模拟电压和电流输入模块
cFP-CB-1	国家仪器公司	778618-01	用于 Compact FieldPoint I/O 接线的集成连接器模块
cFP-CB-3	国家仪器公司	778618-03	用于将热电偶连接至 cFP-TC-120 模块的集成等温连接块
cFP-TC-120	国家仪器公司	777318-120	Compact FieldPoint 8通道热电偶输入模块
cFP-1804	国家仪器公司	779490-01	NI Compact FieldPoint 的以太网/串行接口
LabView 2010	国家仪器公司	-
工业电源	Traco Power	TCL 060-124	100-240V 交流电
水浴锅	Julabo	FP40-HE	制冷/加热循环器

参考文献

Sanders, C. R., Hare, B. J., Howard, K. P., Prestegard, J. H. Magnetically-oriented phospholipid micelles as a tool for the study of membrane-associated molecules. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 26, 421-444 (1994).
Glover, K. J., et al. Structural evaluation of phospholipid bicelles for solution-state studies of membrane-associated biomolecules. Biophys. J. 81 (4), 2163-2171 (2001).
Katsaras, J. H. T. A., Pencer, J., Nieh, M. -P. "Bicellar" lipid mixtures as used in biochemical and biophysical studies. Naturwissenschaften. 92 (8), 355-366 (2005).
Sanders, C. R., Prosser, R. S. Bicelles: a model membrane system for all seasons? Structure. 6 (10), 1227-1234 (1998).
Dürr, U. H. N., Soong, R., Ramamoorthy, A. When detergent meets bilayer: birth and coming of age of lipid bicelles. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 69, 1-22 (2013).
Dürr, U. H. N., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelles lights up membrane protein structure. Chem. Rev. 112, 6054-6074 (2012).
Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lepidic bicelle method. J. Vis. Exp. (59), (2012).
Barbosa-Barros, L., et al. Bicelles: lipid nanostructured platforms with potential dermal applications. Small. 6, 807-818 (2012).
Lin, L., et al. Hybrid bicelles as a pH-sensitive nanocarrier for hydrophobic drug delivery. RSC Adv. 6, 79811-79821 (2016).
Beck, P., et al. Novel type of bicellar disks from a mixture of DMPC and DMPE-DTPA with complexed lanthanides. Langmuir. 26 (8), 5382-5387 (2010).
Liebi, M. Tailored phospholipid bicelles to generate magnetically switchable material. , ETH Zürich. Switzerland. PhD Thesis n° 21048, ISBN 978-3-905609-55-4 (2013).
Liebi, M., et al. Magnetically enhanced bicelles delivering switchable anisotropy in optical gels. ACS. Appl. Mater. Interfaces. 6 (2), 1100-1105 (2014).
Liebi, M., et al. Alignment of bicelles studied with high-field magnetic birefringence and small-angle neutron scattering measurements. Langmuir. 29, 3467-3473 (2013).
Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system. Biophys J. 74, 2405-2418 (1998).
Prosser, R. S., Bryant, H., Bryant, R. G., Vold, R. R. Lanthanide chelates as bilayer alignment tools in NMR studies of membrane-associated peptides. J. Magn. Reson. 141, 256-260 (1999).
Liebi, M., Kohlbrecher, J., Ishikawa, T., Fischer, P., Walde, P., Windhab, E. J. Cholesterol increases the magnetic aligning of bicellar disks from an aqueous mixture of DMPC and DMPE-DTPA with complexed thulium ions. Langmuir. 28 (29), 10905-10915 (2012).
Liebi, M., et al. Cholesterol-diethylenetriaminepentaacetate complexed with thulium ions integrated into bicelles to increase their magnetic alignability. J. Phys. Chem. B. 117 (47), 14743-14748 (2013).
Isabettini, S., et al. Tailoring bicelle morphology and thermal stability with lanthanide-chelating cholesterol conjugates. Langmuir. 32, 9005-9014 (2016).
Isabettini, S., et al. Mastering the magnetic susceptibility of magnetically responsive bicelles with 3β-Amino-5-Cholestene and complexed lanthanide ions. Phys. Chem. Chem. Phys. 19, 10820-10824 (2017).
De Angelis, A. A., Opella, S. J. Bicelle samples for solid-state NMR of membrane proteins. Nat. Protoc. 2 (10), 2332-2338 (2007).
Son, W. S., et al. "Q-Titration" of long-chain and short-chain lipids differentiates between structured and mobile residues of membrane proteins studied in bicelles by solution NMR spectroscopy. J. Magn. Reson. 214, 111-118 (2012).
Avanti Polar Lipids Inc. Bicelle Preparation. , Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation/bicelle-preparation (2017).
Isabettini, S., et al. Methods for Generating Highly Magnetically Responsive Lanthanide-Chelating Phospholipid Polymolecular Assemblies. Langmuir. 33, 6363-6371 (2017).
Nieh, M. -P., Glinka, C. J., Krueger, S., Prosser, R. S., Katsaras, J. SANS study on the effect of lanthanide ions and charged lipids on the morphology of phospholipid mixtures. Biophysical Journal. 82 (5), 2487-2498 (2002).
Watts, A., Spooner, P. J. R. Phospholipid phase transitions as revealed by NMR. Chem. Phys. Lip. 57, 195-211 (1991).
Bleaney, B. Nuclear magnetic-resonance shifts in solution due to lanthanide ions. J. Magn. Reson. 8, 91-100 (1972).
Prosser, R. S., Volkov, V. B., Shiyanovskaya, I. V. Solid-state NMR studies of magnetically aligned phospholipid membranes: taming lanthanides for membrane protein studies. Biochem. Cell Biol. 76, 443-451 (1998).
Prosser, R. S., Volkov, V. B., Shiyanovskaya, I. V. Novel chelate-induced magnetic alignment of biological membranes. Biophys. J. 75, 2163-2169 (1998).
Shklyarevskiy, I. O., et al. Magnetic alignment of self-assembled anthracene organogel fibers. Langmuir. 21, 2108-2112 (2005).
Christianen, P. C. M., Shklyarevskiy, I. O., Boamfa, M. I., Maan, J. C. Alignment of molecular materials in high magnetic fields. Physica B: Condens. Matter. 346, 255-261 (2004).
Maret, G., Dransfeld, K. Biomolecules and polymers in high steady magnetic fields. Top. App. Phys. 57, 143-204 (1985).
Gielen, J. C., Shklyarevskiy, I. O., Schenning, A. P. H. J., Christianen, P. C. M., Maan, J. C. Using magnetic birefringence to determine the molecular arrangement of supramolecular nanostructures. Sci. Tech. Adv. Mater. 10 (1), 014601(2009).
Shklyarevskiy, I. O. Deformation and ordering of molecular assemblies in high magnetic fields. , Nijmegen University. The Netherlands. PhD Thesis, ISBN 90-9018956-4 (2005).
Fuller, G. G. Optical rheometry of complex fluids. , Oxford University Press. NY. (1995).
Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).
Avanti Polar Lipids Inc. Liposome Preparation. , Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation (2017).
Avanti Polar Lipids Inc. Preparing Large, Unilamellar Vesicles by Extrusion (LUVET). , Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation/luvet (2017).
Isabettini, S., et al. Molecular engineering of lanthanide ion chelating phospholipids generating assemblies with a switched magnetic susceptibility. Phys. Chem. Chem. Phys. 19, 20991-21002 (2017).
Battaglia, M. R., Ritchie, G. L. D. Molecular magnetic anisotropies from the Cotton-Mouton effect. J. Chem. Soc., Faraday Trans. 2. 73 (2), 209-221 (1977).
Sprunt, S., Nounesis, G., Litster, J. D., Ratna, B., Shashidhar, R. High-field magnetic birefringence study of the phase behavior of concentrated solutions of phospholipid tubules. Phys. Rev. E. 48 (1), 328-339 (1993).
Zhao, J., et al. Continuous paranematic ordering of rigid and semiflexible amyloid-Fe3O4 hybrid fibrils in an external magnetic field. Biomacromolecules. 17 (8), 2555-2561 (2016).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

磁响应性镧系离子螯合磷脂组装体的设计、制备工艺与双折射测量

本文内容

摘要

摘要

引言

方案

结果

讨论

披露

致谢

材料

参考文献

重印与许可

标签