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通过核糖体图谱分析对芽殖酵母进行全基因组翻译定量分析

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DOI：

10.3791/56820

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2017年12月21日

 ,  ,  , 
1Department of Dermatology, Boston University School of Medicine

本文内容

摘要

转录后调控在控制蛋白质丰度中起着重要作用。本文中，我们描述了一种用于定量分析芽殖酵母 Saccharomyces cerevisiae 翻译水平的高通量方法。

摘要

mRNA翻译成蛋白质是一个涉及多层调控的复杂过程。人们通常认为mRNA转录水平的变化反映了蛋白质合成的变化，但已观察到许多例外情况。近年来，一种称为核糖体谱分析（或Ribo-Seq）的技术 emerged 作为一种强大方法，能够高精度地鉴定mRNA中哪些区域被翻译为蛋白质，并可在全基因组水平上量化翻译过程。本文介绍了一种在芽殖酵母中利用Ribo-Seq进行全基因组翻译定量的通用实验方案。此外，将Ribo-Seq数据与mRNA丰度测量相结合，可使我们在同一样本中同时量化数千个mRNA转录本的翻译效率，并比较这些参数在实验干预或不同生理状态下发生的变化。我们详细描述了通过核酸酶消化生成核糖体足迹、通过蔗糖梯度离心分离完整的核糖体-足迹复合物、以及为深度测序制备DNA文库的完整流程，同时包括确保in vivo翻译准确分析所必需的适当质量控制步骤。

引言

mRNA 翻译是细胞中的一项基本过程，在蛋白质表达的调控中起着重要作用。因此，mRNA 翻译会针对不同的内外生理刺激受到严格调控1,2。然而，翻译调控的机制仍研究不足。本文中，我们描述了通过核糖体谱分析在芽殖酵母中进行全基因组水平翻译定量的实验方案。核糖体谱分析技术的总体目标是研究并定量特定 mRNA 在不同细胞条件下的翻译情况。该技术利用下一代测序对全基因组范围内的核糖体占据情况进行定量分析，从而以单密码子分辨率在体内监测蛋白质合成速率in vivo3,4。目前，该方法是测量蛋白质翻译水平最先进的手段之一，已被证明是一种有效的发现工具，能够提供其他现有技术（如微阵列或翻译状态阵列分析（TSAA））无法揭示的信息5。由于核糖体谱分析同时反映转录本水平和翻译输出的综合变化，因此相比其他方法具有更高的灵敏度。

该方法基于对核糖体保护的mRNA片段进行深度测序3。在蛋白质翻译过程中，核糖体会保护约28 nt长度的mRNA片段（称为足迹片段）6。通过测定这些受核糖体保护的片段序列，Ribo-Seq可精确定位核糖体在翻译中mRNA上的位置，并识别mRNA中哪些区域可能正在被主动翻译成蛋白质3,7。此外，通过统计比对到特定mRNA转录本的足迹片段数量，我们可对mRNA的翻译水平进行定量测量。

为了分离核糖体保护的片段，首先用翻译抑制剂处理细胞裂解液，使核糖体停滞，随后进行核糖核酸酶消化。游离的mRNA以及未被核糖体保护的mRNA区域会被核糖核酸酶降解，而受核糖体保护的mRNA片段则可通过纯化完整的核糖体足迹复合物得以回收。这些mRNA足迹随后被转化为cDNA文库，并通过深度测序进行分析（图1）。在进行核糖体谱分析的同时，从同一样本中提取完整的mRNA并进行测序。通过将Ribo-Seq检测到的翻译水平与mRNA丰度数据进行比较，可以鉴定在翻译水平上特异性上调或下调的基因，并在全基因组范围内计算mRNA的翻译效率。尽管本文所述方案专用于酵母，但也应适用于 尝试在其他系统中建立Ribo-Seq实验流程的研究人员。

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方案

1. 提取物制备

  1. 从冷冻保存的菌种中在YPD平板（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖和2%琼脂）上划线分离酵母菌株以获得单菌落。在30 °C下培养2天。
  2. 从YPD平板上挑取单菌落接种于50 mL锥形离心管中的15 mL YPD培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖），在30 °C下振荡培养过夜（200–250 rpm）。
  3. 将过夜培养物转接至2 L无菌烧瓶中的500 mL YPD培养基中，使初始OD600 < 0.1。在30 °C下振荡培养3–5小时，直至OD600 = 0.5（对数生长中期）。
  4. 使用玻璃滤器装置通过0.45 μm膜滤器过滤收集细胞。用刮刀刮下菌体沉淀，液氮速冻后于-80 °C保存。预期冷冻菌体沉淀量约为0.2–0.5 g。
    注意：液氮温度极低，操作时需佩戴适当防护装备。
  5. 使用前立即配制新鲜裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.0、140 mM KCl、5 mM MgCl2、100 μg/mL环己酰亚胺、0.5 mM DTT、1% Triton X-100），并置于冰上保存。
  6. 向1.8 mL不锈钢研磨管中加入3颗铬钢珠（3.2 mm），在液氮中预冷后加入冷冻菌体沉淀，并用硅胶塞密封。以4200 rpm进行冷冻研磨，每次10秒，重复10次。每轮研磨之间将管子在液氮中冷却至少10秒。
    注意：务必始终保持样品处于冷冻状态。
  7. 加入1 mL裂解缓冲液，用移液器充分混匀。转移至新的1.5 mL离心管中。
  8. 在4 °C下以20,000 × g离心5分钟，于冰上操作，将上清液转移至新的1.5 mL离心管中。取100 μL裂解液转移至另一新的1.5 mL离心管中用于poly(A) mRNA的分离。立即进行RNA提取，或在液氮中速冻保存。测定剩余裂解液的OD260值（用于后续核糖体印迹提取），并在液氮中速冻后于-80 °C保存裂解液。

2. 足迹提取

  1. 蔗糖梯度的制备
    1. 配制50%、40%、30%、20%和10%的蔗糖溶液，溶剂为梯度缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.0，140 mM KCl，5 mM MgCl₂）2100 μg/mL 放线菌酮，0.5 mM DTT
    2. 将2.2 mL已配制的50%蔗糖缓冲液用移液器加入13.2 mL薄壁聚丙烯管底部，于-80 °C冷冻10分钟图2然后将2.2 mL的40%蔗糖缓冲液覆盖在已冷冻的50%蔗糖缓冲液上，于-80 °C冷冻10分钟。按照相同操作，依次叠加30%、20%和10%的蔗糖缓冲液。在叠加过程中避免产生气泡。将蔗糖梯度保存在-80 °C直至使用。蔗糖梯度液应至少在实验前一天制备，并储存在-80 °C。
  2. 核酸酶消化
    1. 实验前一晚在 4 °C 下解冻蔗糖梯度。
    2. 在冰上解冻细胞裂解液（足迹样本）。转移含有50 OD的细胞裂解液等分试样260 将单位转移至新的1.5 mL离心管中，并加入新鲜裂解缓冲液至1 mL。将剩余裂解物于-80 °C保存。加入10 μL RNase I（100 U/μL），在室温下于翻转式旋转仪上轻柔旋转孵育1小时。
    3. （可选）在 4 °C 条件下以 20,000 × g 离心 5 分钟澄清样品，并将上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中。
  3. 超速离心
    1. 将裂解样品轻轻铺加到10-50%蔗糖梯度的顶部。
    2. 使用SW-41 Ti转子在4 °C下以210,000 × g（35,000 rpm）超速离心聚丙烯管3小时。
  4. 梯度分馏系统设置
    1. 打开组件，让紫外监测器预热至少30分钟。
    2. 如果使用数字记录软件，启动计算机上的软件，并将图表的缩放范围设置为 -0.01 和 1。
    3. 用Chase溶液（20 mM Tris-HCl pH 8.0，140 mM KCl，5 mM MgCl₂）填充注射器2，60% 蔗糖），去除注射器和套管内的任何气泡。
    4. 安装装有无RNase水的超速离心管。用套管穿刺管壁，直至看到两个黑色标记。以1 mL/min的流速启动注射泵。
    5. 当水流经流过池时，按压 "自动归零" 按下紫外监测仪上的按钮，将基线调整至0。将紫外监测仪的灵敏度设置为 "2.0 AU"在建立稳定的基线后，停止注射泵。回收追迹溶液，并取出超速离心管。
  5. 单核糖体分离
    1. 安装并穿刺含有蔗糖梯度的超速离心管。以1 mL/min启动注射泵，收集1 mL馏分并监测A254 值。将代表80S单体峰的组分合并至一个离心管中，置于冰上（图3).
    2. 当Chase溶液到达流路池时，停止注射泵。回收Chase溶液并移除超速离心管。从步骤2.5.1开始，对剩余样品重复分级分离操作。
      注意：实验结束后，使用至少 30 mL 无 RNase 水清洗分级分离系统。用温水彻底冲洗管路、注射器及所有可拆卸部件。
    3. 使用 0.5 mL 离心滤器（100 kDa 截留分子量）在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 10 分钟过滤各组分，弃去滤过液，重复操作直至体积小于 < 100 μL。加入400 μL洗脱缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 7.0，2 mM EDTA，40 U/mL RNase抑制剂），用移液器吹打混匀，冰上孵育10分钟，将装置转移至新的收集管中。在4 °C下以12,000 × g离心10分钟，收集穿流液。
  6. 足迹片段纯化
    1. 将含有足迹RNA片段的流穿液转移至新的1.5 mL离心管中，加入20 μL 20% SDS（终浓度为1%），用移液器吹打混匀。
    2. 加入等体积酸性酚-氯仿（pH 4.5），涡旋振荡10秒。
      注意：酸性酚-氯仿具有毒性，避免接触皮肤和吸入。
    3. 65 °C 加热 5 分钟，冰上放置 1 分钟。在 4 °C 条件下以 12,000 x g 离心 5 分钟，将上层水相转移至新的 1.5 mL 离心管中。
    4. 加入1/10体积的醋酸钠（NaOAc，pH 5.5）、1/100体积的糖原（10 mg/mL）和2.5体积的100%乙醇，沉淀足迹RNA片段。在-20 °C孵育至少1小时。

3. 聚腺苷酸 mRNA 提取

  1. 总RNA提取
    1. 将100 μL细胞裂解液（总RNA样品）在冰上解冻，加入300 μL 20 mM Tris-HCl（pH 7.0）和20 μL 20% SDS（终浓度为1%），用移液器吹打混匀。
    2. 加入1体积（400 μL）酸性酚:氯仿（pH 4.5），涡旋振荡10秒。
    3. 65 °C加热5分钟，冰上放置1分钟。在4 °C下以12,000 x g离心5分钟，转移上层水相至新的1.5 mL离心管中。
    4. 进行第二次酚抽提。加入1体积酸性酚:氯仿（pH 4.5），涡旋振荡10秒；65 °C加热5分钟，冰上放置1分钟。在4 °C下以12,000 x g离心5分钟，将上层水相转移至新的1.5 mL离心管中。
    5. 沉淀RNA：加入1/10体积3 M NaOAc（pH 5.5）、1/100体积糖原（10 mg/mL）和2.5体积100%乙醇。在-20 °C孵育至少1小时。
  2. 多聚(A) mRNA分离
    1. 在4 °C下以20,000 x g离心RNA样品30分钟，去除乙醇。最大转速短暂离心30秒，用加样枪头吸除残余乙醇，将沉淀在空气中干燥5分钟。
    2. 将沉淀溶解于300 μL多聚(A) mRNA分离试剂盒中的裂解/结合缓冲液中。按照多聚(A) mRNA分离试剂盒制造商的操作说明进行多聚(A) mRNA提取。
    3. 通过加入1/10体积3 M NaOAc（pH 5.5）、1/100体积糖原（10 mg/mL）和2.5体积100%乙醇沉淀mRNA样品。在-20 °C孵育至少1小时。
  3. mRNA片段化
    1. 在4 °C下以20,000 x g离心mRNA样品30分钟，去除乙醇。短暂离心30秒，用加样枪头吸除残余乙醇，将沉淀在空气中干燥5分钟。
    2. 将mRNA重悬于18 μL无RNase的水中，加入2 μL 10× RNA片段化缓冲液。在94°C孵育5分钟。将离心管转移至冰上冷却。
    3. 通过加入1/10体积3 M NaOAc（pH 5.5）、1/100体积糖原（10 mg/mL）和2.5体积100%乙醇进行沉淀。在-20 °C孵育至少1小时。

4. 去磷酸化

  1. 用T4多核苷酸激酶处理足迹（Footprint）和片段化mRNA样品。具体操作为：将样品在4 °C下以20,000 × g离心30分钟，去除乙醇；再以最大转速离心30秒，用加样枪头吸除残留乙醇；将沉淀在空气中干燥5分钟。
  2. 将沉淀重悬于7.75 µL水中，加入1 µL 10× T4多核苷酸激酶缓冲液、1 µL T4多核苷酸激酶（10,000 U/mL）和0.25 µL RNase抑制剂（20 U/µL），在37 °C孵育1小时。
  3. （可选）使用1× TBE缓冲液，在180 V条件下预电泳15% TBE-尿素凝胶15分钟。
  4. 向每份足迹（Footprint）和mRNA样品各取10 µL，加入10 µL 2× TBE-尿素上样缓冲液。为足迹样品准备对照：包含1 µL 10 µM上端大小标记寡核苷酸（32 nt）、1 µL 10 µM下端大小标记寡核苷酸（28 nt）、8 µL水和10 µL 2× TBE-尿素上样缓冲液。为mRNA样品准备对照：包含1 µL 10 µM RNA大小标记寡核苷酸（63 nt）、9 µL水和10 µL 2× TBE-尿素上样缓冲液。
  5. 将样品和对照在75 °C孵育3分钟，短暂离心后置于冰上1分钟。将每个样品分别上样至15% TBE-尿素凝胶的两个加样孔中，在180 V条件下进行凝胶电泳分离RNA片段，持续1小时。
  6. 用核酸凝胶染料（按10,000倍稀释于水中）染色5分钟，并避光保存。
  7. 在蓝光透射仪下，使用洁净的剃须刀片切取足迹样品中位于28 nt与32 nt标记之间的正确条带（图4A），以及mRNA样品中约50–70 nt范围内的条带（图4B）。将切下的聚丙烯酰胺凝胶条带于-80 °C冷冻至少10分钟。
  8. 按以下步骤从聚丙烯酰胺凝胶中提取RNA：将凝胶条带在70 °C加热2分钟，使用一次性研磨棒充分研磨；加入300 µL洗脱缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 7.0，2 mM EDTA）洗脱RNA，再加入1 µL RNase抑制剂（20 U/µL），于37 °C孵育3小时。
  9. 将样品在4 °C下以12,000 × g离心5分钟，收集上清液，加入1/10体积的乙酸钠（NaOAc，pH 5.5）、1/100体积的糖原（10 mg/mL）和2.5体积的100%乙醇进行沉淀，在-20 °C孵育至少1小时。

5. 3'-接头连接

  1. 在 4 °C 条件下，以 20,000 × g 离心 Footprint 和 mRNA 样品 30 分钟，去除乙醇。以最大转速离心 30 秒，用加样枪头吸除残留乙醇，沉淀在空气中干燥 10 分钟。
  2. 将沉淀重悬于 4.75 µL 无核酸酶水、2 µL 50% PEG8000、1 µL 10× T4 RNA 连接酶缓冲液、1 µL 3'-接头（100 ng/µL）、0.25 µL RNase 抑制剂（20 U/µL）和 1 µL T4 RNA 连接酶 2 截短型 KQ（200,000 U/mL）中，16 °C 过夜孵育。
  3. 次日早晨，向连接反应体系中直接加入 0.5 µL 5'-脱腺苷酸酶（10 U/µL）和 0.5 µL Rec J 核酸外切酶（10 U/µL），以去除过量接头。30 °C 孵育 30 分钟。
  4. 对样品进行沉淀处理：加入 30 µL 无核酸酶水、1 µL 糖原（10 mg/mL）、1/10 体积的乙酸钠（NaOAc，pH 5.5）和 2.5 体积的 100% 乙醇，-20 °C 孵育至少 1 小时。

6. 逆转录

  1. 在 4 °C 条件下，以 20,000 × g 离心样品 30 分钟，去除乙醇。以最大转速短暂离心 30 秒，用加样枪头吸除残留乙醇。将沉淀在空气中干燥 10 分钟。
  2. 将沉淀重悬于 11.5 µL 无核酸酶水中，加入 0.5 µL 8 µM 的逆转录引物（RT 引物）和 1 µL dNTP 混合液（10 mM）。在 65 °C 下孵育 5 分钟，然后置于冰上。
  3. 加入 4 µL 5× 第一链缓冲液、2 µL 0.1 M DTT、0.5 µL RNase 抑制剂（20 U/µL）和 0.5 µL 逆转录酶（200 U/µL）。在 48 °C 下孵育 30 分钟，随后在 65 °C 下孵育 1 分钟，在 80 °C 下孵育 5 分钟。
  4. 无需沉淀，立即进行 RNA 水解：加入 0.8 µL 2 M NaOH，于 98 °C 孵育 30 分钟。加入 0.8 µL 2 M HCl 以中和反应体系。
  5. 对样品进行沉淀处理：加入 20 µL 无核酸酶水、1 µL 甘油（10 mg/mL）、1/10 体积的 NaOAc（pH 5.5）和 2.5 倍体积的 100% 乙醇。在 -20 °C 下孵育至少 1 小时。
  6. 在 4 °C 条件下，以 20,000 × g 离心样品 30 分钟，去除乙醇。以最大转速短暂离心 30 秒，用加样枪头吸除残留乙醇。将沉淀在空气中干燥 10 分钟。
  7. 将沉淀重悬于 5 µL 无核酸酶水中，加入 5 µL 2× TBE-尿素上样缓冲液。在 75 °C 下孵育 3 分钟，短暂离心后置于冰上 1 分钟。
  8. （可选）使用 1× TBE 缓冲液，在 180 V 条件下预电泳 10% TBE-尿素凝胶 15 分钟。
  9. 将样品上样至 10% TBE-尿素凝胶的一个泳道中。在 180 V 条件下进行凝胶电泳分离逆转录反应产物，持续 50 分钟。作为对照，制备一份包含 1 µL 2.5 µM RT 引物、1 µL 2.5 µM 128 nt 标记寡核苷酸、3 µL 水和 5 µL 2× TBE-尿素上样缓冲液的样品，并上样至凝胶的另一独立泳道中运行。
  10. 用核酸染料（以水稀释 10,000 倍）染色凝胶 5 分钟，避光操作。使用蓝光透射仪，用洁净的剃刀切下约 128 nt 及以上大小的条带（图 5）。将聚丙烯酰胺凝胶碎片在 -80 °C 冷冻至少 10 分钟。
  11. 将凝胶碎片在 70 °C 加热 2 分钟，使用一次性研磨棒研磨。加入 300 µL 20 mM Tris-HCl（pH 7.0）溶液洗脱 DNA，并在 37 °C 下孵育 3 小时。
  12. 在 4 °C 条件下，以 12,000 × g 离心样品 5 分钟，收集上清液，并通过加入 1/10 体积的 NaOAc（pH 5.5）、1/100 体积的甘油（10 mg/mL）和 2.5 倍体积的 100% 乙醇进行沉淀。在 -20 °C 下孵育至少 1 小时。

7. 环化

  1. 在 4 °C 条件下，以 20,000 × g 离心样品 30 分钟，去除乙醇。以最大转速离心 30 秒，用加样枪头吸除残留乙醇，将沉淀在空气中干燥 10 分钟。
  2. 将沉淀重悬于 16.75 µL 无核酸酶水中。加入 2 µL 10× 单链 DNA（ssDNA）连接酶缓冲液、1 µL 50 mM MnCl2 和 0.25 µL ssDNA 连接酶（100 U/µL）。在 60 °C 下孵育 1 小时，然后在 80 °C 下孵育 10 分钟。无需沉淀，将单链 DNA 连接反应产物储存于 -20 °C。

8. PCR文库扩增

  1. 在冰上操作，于PCR管中混合以下组分：146 µL无核酸酶水、2 µL 20 µM正向引物、2 µL 20 µM带索引的反向引物、40 µL 5x高保真DNA聚合酶缓冲液、4 µL dNTPs（10 mM）、4 µL单链DNA连接反应产物，以及2 µL高保真DNA聚合酶。对于每个将进行测序文库合并（multiplexing）的样本，选择不同的带索引反向引物。将50 µL PCR混合液分装至4个新的PCR管中。
  2. 使用以下程序，以不同循环数（8、10、12、14）进行PCR扩增：
    98 °C预变性1分钟
    8至14个循环：
    94 °C变性15秒
    55 °C退火5秒
    65 °C延伸10秒
    65 °C终末延伸2分钟
  3. 通过加入1/10体积的3 M NaOAc（pH 5.5）、1/100体积的糖原（10 mg/mL）和2.5体积的100%乙醇，沉淀PCR产物。于-20 °C孵育至少1小时。
  4. 在4 °C条件下以20,000 × g离心30分钟，弃去乙醇。以最大转速离心30秒，用加样枪头吸除残留乙醇，将沉淀空气干燥。
  5. 将沉淀重悬于8 µL无核酸酶水中，加入2 µL非变性5x核酸上样缓冲液。将样品上样至非变性8% TBE凝胶的一个加样孔中。在150 V电压下电泳35分钟以分离DNA产物。作为对照，制备一个包含0.5 µL 10 bp DNA Ladder（1 µg/µL）、7.5 µL水和2 µL非变性5x核酸上样缓冲液的样品，并上样至凝胶的另一泳道中运行。
  6. 用核酸染料染色凝胶5分钟（以水稀释10,000倍），避光操作。使用蓝光透射仪，用洁净的剃须刀片切下约150 bp处的条带（用于footprint样品）和约180 bp处的条带（用于mRNA样品）（图6）。将凝胶片段于-80 °C保存至少10分钟。
  7. 将凝胶片段在70 °C加热2分钟，使用一次性研磨杵充分研碎。加入300 µL 20 mM Tris-HCl（pH 7.0）洗脱DNA，并在37 °C孵育3小时。
  8. 在4 °C条件下以12,000 × g离心5分钟，收集上清液，并通过加入1/10体积NaOAc（pH 5.5）、1/100体积糖原（10 mg/mL）和2.5体积100%乙醇进行沉淀。于-20 °C孵育至少1小时。
  9. 在4 °C条件下以20,000 × g离心30分钟，弃去乙醇。以最大转速离心30秒，用加样枪头吸除残留乙醇，将沉淀空气干燥。最后，将文库重悬于20 µL无核酸酶水中，并进行定量、质量控制及测序。

9. 文库定量与高通量测序

  1. 在将样品送测序之前，需确定PCR扩增文库的产量和质量。足迹图谱（Footprint）和mRNA测序文库的代表性图谱如图7所示。Footprint样品的PCR扩增文库预期大小为148–152 bp，mRNA样品为170–190 bp。
  2. 若多个带有不同条形码的样品将被混合后进行测序，请使用基于qPCR的测序文库定量检测方法对文库进行准确定量。
  3. 以等摩尔比例混合文库。将混合文库的总体积计算为3 µL × 需混合的样品总数。计算每种文库需加入的体积，使各文库以等摩尔比例混合，最终达到10 nM的混合文库浓度。将计算好的各文库体积加入一个新的1.5 mL离心管中，用移液器吹打混匀。加水至计算所得的总体积。将混合后的文库储存于-20 °C。
  4. 取部分混合文库，使用Illumina测序平台进行50 bp单端测序。我们通常在一个测序运行中 multiplex（多重混合）12个样品，每个测序通道可获得约2亿条reads。
    注意：每个样品最终获得的足迹图谱reads数量取决于起始材料的量以及rRNA污染的程度。

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结果

核糖体谱分析数据的生物信息学详细分析流程此前已有描述8,9。此外，多个研究团队已开发出针对核糖体谱分析方法特异性的生物信息学工具，用于差异基因表达分析和测序数据处理10,11,12,13,14,15,16,17,18。Ribo-Seq 数据分析的第一步是使用 ...

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讨论

核糖体谱分析技术（Ribo-Seq）已成为研究mRNA翻译的有力工具 体内 在全基因组水平上 3采用这种方法的研究能够以单密码子分辨率监测翻译过程，增进了我们对翻译调控机制的理解。尽管如此，核糖体谱分析（Ribo-Seq）仍存在若干局限性。在分离核糖体保护片段的过程中，核糖体RNA（rRNA）片段总会伴随共纯化，从而降低Ribo-Seq实验中可获得的有效测序读段的产量。 9,25我们的数据表明，rRNA污染可能占所有测序读长的40-50%图8）。克服这一限制的方法之一是提高测序深度。应进行额外的测序轮次，直至每个分析样本达到所需的测序读数。采用本方案制备的测序文库分析显示，当在Illumina HiSeq 2000平台上进行标准的50 bp单端测序并同时 multiplex 12个样本时，每个足迹文库可获得超过500万条足迹读数。然而，若观察到明显的rRNA污染，可选择性地进行rRNA去除步骤。<...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究工作由美国国立卫生研究院基金 AG040191 和 AG054566 资助 VML。该研究是在VML获得美国老化研究联合会（AFAR）研究基金期间开展的。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.45 μM 膜过滤器MilliporeHVLP04700
0.5 M EDTAInvitrogenAM9261
0.5 mL 离心过滤器（100 kDa 截留分子量）MilliporeUFC510024
1 M Tris-HCl，pH 7.0InvitrogenAM9850G
1 M Tris-HCl，pH 7.5（4°C 时 pH 8.0）Invitrogen15567-027
10X TBE 缓冲液InvitrogenAM9863
10% TBE-尿素凝胶InvitrogenEC6875BOX
15% TBE-尿素凝胶InvitrogenEC6885BOX
2 M MgCl2RPIM24500-10.0
2X TBE-尿素上样缓冲液InvitrogenLC6876
3M NaOAc，pH 5.5InvitrogenAM9740
5' 脱腺苷酸酶（10 U/μL）EpicentreDA11101K
5X 核酸上样缓冲液Bio-Rad161-0767
8% TBE 凝胶InvitrogenEC6215BOX
酸性酚:氯仿，pH 4.5（含 IAA，125:24:1）InvitrogenAM9722
蓝光透射仪Clare Chemical ResearchDR-46B
铬钢珠，3.2 mmBioSpec Products11079132c
冷冻研磨机Biospec product3110BX
放线菌酮RPIC81040-5.0
数据采集系统DATAQ InstrumentsDI-245
脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液混合物（10 mM）NEBN0447L
糖原InvitrogenAM9510
梯度分馏系统BrandelBR-184X
高保真 DNA 聚合酶（2,000 U/mL）NEBM0530S随附 5X Phusion HF 缓冲液
下一代测序文库定量试剂盒Kapa BiosystemsKK4824
核酸凝胶染色剂InvitrogenS11494
Optima XE-90 超速离心机Beckman CoulterA94471
聚(A) mRNA 分离试剂盒Invitrogen61011
Rec J 外切核酸酶（10 U/μL）EpicentreRJ411250
逆转录酶（200 U/μL）Invitrogen18080093随附 5X 第一链缓冲液和 0.1 M DTT
RNA 断裂缓冲液NEBE6186A
RNase I（100 U/μL）InvitrogenAM2295
RNase 抑制剂（20 U/μL）InvitrogenAM2696
硅橡胶帽BioSpec Products2008
单链 DNA 连接酶（100 U/μL）EpicentreCL9021K随附 10X CircLigase II 缓冲液和 50 mM MnCl2
不锈钢微量管，1.8 mLBioSpec Products2007
蔗糖RPIS24060-5000.0
SW-41 Ti 转子Beckman Coulter331362
注射泵New Era Pump SystemsNE-300
T4 多核苷酸激酶（10,000 U/mL）NEBM0201S随附 10X T4 多核苷酸激酶缓冲液
T4 RNA 连接酶 2 截短型 KQ（200,000 U/mL）NEBM0373S随附 10X T4 RNA 连接酶缓冲液和 50% PEG8000
PCR 仪Bio-Rad1851148
薄壁聚烯烃管，13.2 mLBeckman Coulter331372
Triton X-100Sigma AldrichX100-100ML
紫外监测仪Bio-Rad7318160
酿酒酵母菌株 BY4741Open BiosystemsYSC1048

参考文献

  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
  2. Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. Regulation of mRNA translation during mitosis. Elife. 4, (2015).
  3. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  4. Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).
  5. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
  6. Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).
  7. Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).
  8. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
  9. Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling. Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).
  10. Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).
  11. Zhong, Y., et al. RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints. Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).
  12. Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data. Nat Commun. 7, 11194(2016).
  13. Chung, B. Y., et al. The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis. RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).
  14. Popa, A., et al. RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing. F1000Res. 5, 1309(2016).
  15. Dunn, J. G., Weissman, J. S. Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data. BMC Genomics. 17 (1), 958(2016).
  16. Baranov, P. V., Michel, A. M. Illuminating translation with ribosome profiling spectra. Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).
  17. Calviello, L., et al. Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data. Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).
  18. Michel, A. M., et al. RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data. RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).
  19. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).
  20. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25(2009).
  21. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
  22. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550(2014).
  23. van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).
  24. Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
  25. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
  26. Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).
  27. Weinberg, D. E., et al. Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation. Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).
  28. Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle. Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).
  29. Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability. J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).
  30. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic Acids Res. 45 (2), e6(2017).
  31. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Res. 42 (17), e134(2014).
  32. O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density. Nat Commun. 7, 12915(2016).

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