使用软件和冷却装置进行鱼类精子评估

摘要

本议定书描述了一种使用计算机辅助精子分析和冷却装置进行鱼类精子评估的程序。该软件对基于精子运动的鱼类精子质量进行了快速、准确和定量分析, 可作为水产养殖中提高繁殖成功率的有用工具。

摘要

对于配子质量评价, 有创新的, 快速的和定量的技术, 可以为水产养殖提供有用的数据。建立了精子分析的计算机系统来测量几个参数, 最常用的测量方法之一是精子运动。

最初, 这种计算机技术是为哺乳动物的物种设计的, 虽然它也可以用于鱼类精子分析。鱼类具有特定的功能, 可以影响精子评估, 如激活后的短期运动时间, 并在某些情况下, 适应较低的温度。因此, 有必要对软件和硬件组件进行修改, 使运动分析更有效地进行鱼精子分析。对于哺乳动物精子, 加热板用于维持精子的最佳温度。然而, 对于某些鱼类来说, 使用较低的温度来延长运动的持续时间是有利的, 因为精子保持活性不到2分钟。因此, 在分析时, 包括在光学显微镜上, 冷却装置是必要的, 在恒定温度下冷藏样品。该协议描述了使用精子分析软件和新的冷却装置对鱼类精子运动进行分析以优化结果。

引言

繁殖的功效取决于配子 (卵和精子) 的质量^1,2。这是促成受精成功的主要因素, 允许^3、4的存活后代的发育。对配子质量的方便评价是确定标本生育潜能的最佳工具。

混合精子的多男性是一个常见的做法, 生产许多水生商业物种⁴。然而, 男性之间的精子变异可能导致精子的竞争, 因此, 并非所有的男性都同样贡献的基因池⁵。从这个意义上说, 正确评估个别的射精/精子特征, 如运动, 是获得有关男性生育潜能的歧视性信息的根本。直接观察精子的运动可以产生不准确和主观的数据, 因为它需要时间和经验, 这导致缺乏一致性和不相容的结果^6,7。然而, 有许多创新, 快速和定量的技术, 可以提供可靠的精子质量分析^2,4。

通过计算机辅助精子分析, 提供准确的精子质量数据⁸。这项技术包括开发与相衬显微镜相关的软件, 它允许对精子运动进行评估。然而, 运动参数的限制因素是摄像机的帧速率。个体精子轨迹是基于精子头质心位置的连续帧的视频录音, 这是相关的鞭毛运动模式^{3,9,10, 11}. 测量的主要动力学参数为直线速度 (VSL)、曲线速度 (VCL) 和平均路径速度 (VAP)。VSL 是精子所采取的起始点和终点之间的距离除以时间。VCL 是沿精子精确轨迹的真实速度。VAP 是沿着导出的轨迹平滑路径的速度。这些参数允许额外的动力学信息, 包括线性 (LIN), 直线度 (STR), 抖动 (WOB) 和跳动测量, 如振幅的横向头部运动 (ALH) 和节拍交叉频率 (光华)^4,10。

精子分析系统最初用于哺乳类, 而系统的要求之一是在捐献者的体温下操作 (约37摄氏度)。该软件还可用于鱼类;但是, 有必要对精子分析结果的误差进行一些适应性的调整。在一些鱼类, 如鲑鱼和鳗鱼^8,12, 施肥发生在低温 (约4°c)^2,4。因此, 应开发冷却装置, 以避免不舒适的工作条件。此外 , 鱼精子在中 immotile , 需要渗透休克激活运动。对于淡水物种, 活化剂介质应具有低渗渗透, 而对于海洋物种则应为高渗介质。然而, 对于某些物种, 作为鲑鱼, 离子浓度也可能是重要的^3,4,9。活化后, 鱼类精子的特征是运动速度的快速下降 (少于2分钟)^13、14和高速, 对于确定最佳帧速率以获得可靠数据¹⁵至关重要。

本研究的目的是设计和应用用于鱼类精子样品的冷冻系统。此外, 该协议还定义了如何根据种类确定标准协议的最佳帧速率。使用这项议定书在鱼类精估的背景下打开新的门, 用欧洲鳗鱼作为模型。

方案

涉及动物问题的程序已获得批准 (2015/变现/豌豆/00064) 的一般方向的农业生产和牲畜在大学 Politècnica de València。

1. 在圈养的欧洲鳗鱼中收集精子

注: 使用欧洲鳗鱼雄性在水箱中保持海水和循环系统在恒温 (20 摄氏度)。通过每周腹腔注射 (人绒毛膜促性腺激素 (hCG) 来治疗激素; 1.5 的每克鱼体重)。在淡水中逐渐开始使用3天的鱼, 然后用海水替换 (水箱中总水的 1/3) 每2天, 直到达到37.0 克/毫升的盐度。

1. 麻醉24小时后, 通过激素注射获得更好的精子质量样品。
   1. 预先准备麻醉: 添加300毫克的苯佐卡因到100毫升70% 乙醇。混合好, 并存储在4摄氏度。
   2. 在5升的系统水的柔性桶中稀释苯佐卡因, 以获得60毫克/升的最终浓度, 并适当混合。
   3. 用系统水和苯佐卡因把鱼转到水桶里。等几分钟, 直到鱼平静下来。
2. 用清水清除生殖器区, 用吸水纸干燥, 以避免粪便、尿液或海水污染精子样本。
3. 在腹部使用温和的压力, 并将精子样本收集到15毫升的塑料管用真空泵。精子体积可达6-7 毫升, 取决于雄性。
4. 将精子样本保持在4摄氏度, 至少1小时, 直到进行动力分析。

2. 冷冻和稀释精子样本

1. 预先准备稀释解决方案。
   注: 精子样本应稀释在特定于每个物种的扩展剂解决方案。
   1. 制备鳗鱼精子样品的非活化剂培养基 (P1 培养基)。添加0.42 克碳酸氢钠, 1.828 克氯化钠, 0.127 克氯化镁, 0.56 克氯化钾和0.037 克氯化钙到250毫升蒸馏水。混合好溶化。存储在4摄氏度。
2. 将冷却器块设置为4摄氏度, 以保持样品在恒温下的温度。等到温度稳定下来。
3. 使用特定于每个物种的稀释溶液稀释精子样本。
   注: 稀释率为特定物种, 必须定义为规范该协议。首先, 根据在运动前分析中获得的浓度来估计精子浓度, 如步骤3和4所述。通过这种分析, 也可以根据运动的百分比选择最佳精子样本。在此之后, 研究员可以开始收集数据的实验使用最好的样本与正确的浓度。
   1. 稀释鳗鱼精子样品在 P1 培养基中的比例为1:50。为制备500µL 的鳗鱼稀释精子, 添加50µL 的新鲜精子样本和450µL P1。混合好。

3. 评估精子运动参数

1. 建立软件的运动模块
   1. 将冷却器的温度设定在4摄氏度, 等到它稳定下来。
   2. 打开软件并选择运动模块。如有必要, 请创建用户名和密码。
   3. 在开始精子分析之前, 选择属性并选择所需的参数。
      1. 点击物种 |鱼。
      2. 根据每个物种的最佳技术条件, 选择每秒帧数和图像数量。将两个选项设置为每秒120个图像。
      3. 选择负对比度。这是必须的精确重建精子轨迹¹⁶。
      4. 选择相应的计数室和摄像机的刻度。为实验中使用的放大透镜校准摄像机。将 SpermTrack10 设置为计数室和10X 刻度。
         注: 一般而言, 在计数室和10X 放大透镜的深度10µm 是推荐的条件, 因为它们提供了更好的聚焦所有精子和捕获最高数量的细胞。然而, 建议对每个物种的运动分析的最佳条件进行前期研究。
      5. 调整每个物种的粒子面积和连通性。设置最小粒子面积在2µm²和连通性在7µm。
         注意: 对于鱼来说, 粒子面积的最小值介于2-5 µm 之间, 连通性取决于精子速度和帧速率。
      6. 保存设置。
   4. 选择捕获。
2. 用软件分析欧洲鳗鱼精子
   1. 将0.946 克商业盐添加到25毫升蒸馏水中, 用 2% BSA 制备活化剂溶液 (人工海水)。
   2. 采取500毫升活化剂溶液 (人工海水) 和地方在冷却器块。
      注意: 一般来说, 鱼精子是由渗透休克事件激活的, 虽然对某些物种来说, 离子浓度也很重要。对于淡水物种, 活化剂介质应具有低渗渗透, 而对于海洋物种则应为高渗介质。
   3. 将计数室置于冷却阶段, 等到温度稳定到4摄氏度。
   4. 混合活化剂和稀释精子激活精子, 并启动运动视频记录后5-10 秒激活。
      1. 取4µL 活化剂溶液并放置在计数室中。
      2. 通过摇动离心3次, 轻轻地融汇稀释的精子, 以避免精子细胞的损伤。
      3. 服用0.5 µL 稀释精子, 与活化剂混合, 并迅速将盖子放在计数室中。
         注意: 此步骤不应超过5秒, 以尽快开始分析。
      4. 关注精子细胞并找到最佳视觉区域, 这是由少量的精子 (150 到200细胞) 定义的, 以避免细胞间的拦截 (补充图 1A)。选择捕获视频以获取精子轨迹, 并根据速度进行分离。
      5. 选择 "捕获" 以获取3到7个字段, 这是在结果中获取较低可变性的最佳间隔, 并继续进行。记录视频直到120s 后激活, 以避免在计数室的封面上凝结。
      6. 选择 "退出" 可拥有所有字段的一般视图。

4. 获取动力数据

1. 选择域 |部分 |保存并选择一个文件名。单击 "保存"。
   注意: 电子表格提供了精子轨迹的部分数据、图表和图像的平均值。
2. 选择常规数据 |文件名 |保存。
   注: 数据为各个领域的个体精子提供了动力学值。

结果

精子运动时间效应分析

在欧洲鳗鱼的情况下, 静态精子的百分比从十五年代增加到120s 在激活以后 (从24.4% 到 40.7%), 并且移动的进步精子的百分比减少 (从36.9% 到 20.9%)(图 1A和1B)。根据速度, 精子细胞显示速度随着时间的推移 (图 1C和1D) 减少。快速速度的精子比例下降了约 23% (从49.4% 到 26.6%), 中等速度精子的比例增加了约7%。

帧速率和计数室的影响

讨论

在这个协议中使用的精子分析软件已经被全世界的研究人员用于不同的物种, 包括鱼类。然而, 鱼有一些特定的特点, 可以影响精子评估。在活化的瞬间, 鱼精子表现出很高的速度, 在活化后迅速下降, 并导致短暂的运动时间。此外, 繁殖的温度是物种依赖性的, 在某些情况下, 可能是大约4°c^2,4,8,12。因此, 有必要对提高鱼类精子分析系统的效率进行一些适应。动力参数的基本原理是对运动精子的连续图像进行采集和分析。大多数系统使用标准帧速率 (16、25、30、50或 60 fps), 因为硬件和软件的限制为¹⁷、18、^19、20...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人绒毛膜促性腺激素	Argent 化学实验室	hCG	激素
苯佐卡因	默克	E1501 Sigma 麻醉
氢钠	默克	S5761 Sigma	P1 培养基
氯化钠	默克	1.06406 EMD 米利波尔	P1 培养基
氯化镁	默克	1374248 USP	P1 培养基
氯化钾	默克	P3911-500G	P1 培养基
氯化钙	默克	C7902-500G	P1 培养基
商业盐	Aqua Medic	Meersalz	活化剂溶液
BSA	Merck	05470 Sigma	活化剂溶液
Falcon 管 15 ml	Merck	T1943-1000EA
Falcon 管支持	Merck	R5651-5EA
Eppendorfs	Merck	T9661-1000EA
微量移液器 20 &微量;l	吉尔森·	皮佩特曼®Classic
Micropipet 10 &微量移液器l	默克	Z683787-1EA
微量移液器吸头 20 和微量移液器;l	默克	Z740030-1000EA
微量移液器 10 &l	默克	Z740028-2000EA
Spermtrack	PROiSER	计数室
TruMorph	PROiSER	TruMorph
显微镜 UB 200i 系列	PROiSER	显微镜
冷却板	PROiSER		原型
冷却器模块	PROiSER		原型
ISAS v1	PROiSER	ISAS	软件