利用软件与冷却装置进行鱼类精子评估

摘要

本实验方案描述了一种利用计算机辅助精子分析系统和冷却装置进行鱼类精子评估的方法。该软件可根据精子的运动能力，快速、准确且定量地分析鱼类精子质量，可作为水产养殖中提高繁殖成功率的有用工具。

摘要

在配子质量评估方面，已有一些创新、快速且定量的技术可为水产养殖提供有用的数据。已开发出用于精子分析的计算机化系统，可测量多个参数，其中最常测量的参数之一是精子活力。

最初，这种计算机技术是为哺乳动物物种设计的，但也可用于鱼类精子分析。鱼类具有一些可能影响精子评估的特定特征，例如激活后运动时间较短，以及在某些情况下对较低温度的适应性。因此，有必要对软件和硬件组件进行改进，以提高鱼类精子运动分析的效率。对于哺乳动物精子，通常使用加热板来维持精子细胞的最适温度。然而，对于某些鱼类物种，采用较低温度有助于延长精子运动持续时间，因为其精子活性通常不到2分钟。因此，在分析期间（包括在光学显微镜上）需要使用冷却装置，以使样品保持恒定的低温。本实验方案描述了利用精子分析软件和新型冷却装置对鱼类精子运动能力进行分析的方法，以优化分析结果。

引言

生殖效率取决于配子（卵子和精子）的质量^1,2。这是决定受精是否成功并产生可存活后代的主要因素^3,4。对配子质量进行便捷评估是判断个体生育潜力的最佳手段。

将多个雄性的精子混合是许多水产商业物种生产中的常见做法⁴。然而，不同雄性之间的精子存在差异，可能导致精子竞争，因此并非所有雄性对基因库的贡献均等⁵。在此背景下，对单个精液或精子特征（如运动能力）进行准确评估，对于获取有关个体雄性生育潜力的区分性信息至关重要。直接观察精子运动能力可能产生不准确且主观的数据，因其需要时间和经验，从而导致结果缺乏一致性和可比性^6,7。然而，目前已存在多种创新、快速且定量的技术，可提供可靠的精子质量分析^2,4。

计算机辅助精子分析技术的发展旨在提供关于精子质量的准确数据⁸。该技术包括与相差显微镜配套使用的软件开发，可用于评估精子的运动能力。然而，影响运动参数准确性的一个限制因素是摄像机的帧率。单个精子的运动轨迹基于视频记录连续帧中精子头部中心点的位置变化，该变化与鞭毛运动模式相关^3,9,10,11。主要测定的动力学参数包括直线速度（VSL）、曲线速度（VCL）和平均路径速度（VAP）。VSL 是指精子运动起点与终点之间的直线距离除以时间。VCL 是指精子沿其实际轨迹行进的真实速度。VAP 是指沿轨迹经平滑处理后路径的运动速度。这些参数可进一步提供其他动力学信息，包括直线性（LIN）、前向性（STR）、摆动性（WOB），以及如精子头部侧向摆动幅度（ALH）和鞭打交叉频率（BCF）等鞭打相关测量指标^4,10。

精子分析系统最初用于哺乳动物物种，该系统的一个要求是在供体体温（约37 °C）下运行。该软件也可用于鱼类物种，但需要进行一些调整，以减少精子分析结果的误差。在某些鱼类物种中，例如鲑科鱼类和鳗鱼^8,12，受精发生在低温条件下（约4 °C）^2,4。因此，应开发冷却装置，以避免操作时产生不适的工作环境。此外，鱼类精子在精液中处于不活动状态，需要渗透压冲击来激活其运动能力。对于淡水物种，激活介质应具有低渗渗透压，而对于海水物种，介质则应为高渗。然而，对于某些物种（如鲑科鱼类），离子浓度也可能至关重要^3,4,9。激活后，鱼类精子表现出运动能力迅速下降（少于2分钟）^13,14且运动速度较高的特征，因此确定最佳帧率以获得可靠数据显得尤为关键¹⁵。

本研究的目的是设计并应用适用于鱼类精子样本的制冷系统。此外，本方案还定义了如何根据物种确定建立标准方案所需的最优帧率。通过使用欧洲鳗鱼作为模型，该方案为鱼类精液评估领域开辟了新的途径。

方案

涉及动物受试者的实验程序已获得瓦伦西亚理工大学农业生产和畜牧业总务处的批准（编号：2015/VSC/PEA/00064）。

1. 采集人工养殖的成熟欧洲鳗鱼的精子

注意：使用在海水和循环系统中饲养且温度恒定（20 °C）的欧洲鳗鲡雄鱼。通过每周一次的腹腔注射给予激素处理（人绒毛膜促性腺激素（hCG），剂量为每克鱼体重1.5 IU）。将鱼逐步适应海水环境，起始时在淡水中饲养3天，之后每隔2天更换1/3体积的总水量为海水，直至盐度达到37.0 g/mL。

1. 在激素注射后24小时对鳗鱼进行麻醉，以获得精子质量更佳的样本。
   1. 预先配制麻醉剂：将300 mg苯佐卡因加入100 mL 70%乙醇中，充分混合后于4 °C保存。
   2. 在容量为5 L的塑料桶中，用系统水稀释苯佐卡因，使其终浓度为60 mg/L，并充分混匀。
   3. 将鱼转移至含有系统水和苯佐卡因的桶中，静置数分钟，直至鱼体活动平静。
2. 用水清洗生殖区域，并用吸水纸擦干，以避免粪便、尿液或海水污染精子样本。
3. 轻轻按压腹部区域，使用真空泵将精子收集至15 mL塑料管中。精子体积可达6–7 mL，具体取决于个体雄鱼。
4. 将精子样本置于4 °C环境中至少1小时，待进行活力分析。

2. 冷藏并稀释精子样本

1. 提前准备好稀释液。
   注意：精子样本应使用针对每种物种特异的稀释保存液进行稀释。
   1. 制备鳗鱼精子样本的非激活培养基（P1 培养基）。将 0.42 g 碳酸氢钠、1.828 g 氯化钠、0.127 g 氯化镁、0.56 g 氯化钾和 0.037 g 氯化钙加入 250 mL 蒸馏水中，充分混匀至溶解。于 4 °C 保存。
2. 将冷却块设置为 4 °C，以维持样本温度恒定。等待温度稳定。
3. 使用针对每种物种特异的稀释液对精子样本进行稀释。
   注意：稀释比例因物种而异，必须明确以标准化实验流程。首先，根据使用软件在运动能力预分析中获得的浓度估算精子浓度，具体方法见步骤 3 和 4。通过该分析，还可根据运动率百分比筛选出最佳的精子样本。完成此步骤后，研究人员即可选用浓度合适且质量最佳的样本开始实验数据采集。
   1. 将鳗鱼精子样本按 1:50 的比例在 P1 培养基中稀释。为制备 500 µL 稀释后的鳗鱼精子，加入 50 µL 新鲜精子样本和 450 µL P1 培养基，充分混匀。

3. 评估精子运动参数

1. 设置软件的运动性分析模块
   1. 将冷却载台设置为 4 °C，并等待其温度稳定。
   2. 打开软件并选择 运动性分析模块。如有需要，创建用户名和密码。
   3. 选择 属性，并在开始精子分析前设定所需的参数。
      1. 点击 物种 | 鱼类。
      2. 根据各物种的最佳技术条件选择 每秒帧数 和 图像数量。将两个选项均设为每秒 120 帧。
      3. 选择负反差模式。这是准确重建精子运动轨迹的必要条件¹⁶。
      4. 选择相应的 计数室 和视频显微镜的 标尺。根据实验所用物镜的放大倍数校准视频显微镜。设置计数室为 SpermTrack10，标尺为 10X。
         注：通常情况下，计数室深度为 10 µm，物镜放大倍数为 10X 是推荐条件，因为这能更好地聚焦所有精子，并捕获最多数量的细胞。然而，建议针对每种物种预先研究其运动性分析的最佳条件。
      5. 针对每种物种调整 颗粒面积 和 连接距离。将最小颗粒面积设为 2 µm²，连接距离设为 7 µm。
         注：对于鱼类，颗粒最小面积范围通常在 2–5 µm 之间，而连接距离取决于精子运动速度和帧率。
      6. 保存设置。
   4. 选择 采集。
2. 使用软件分析欧洲鳗鲡精子
   1. 通过将 0.946 g 商业海盐加入含 2% BSA 的 25 mL 蒸馏水中，配制激活液（人工海水）。
   2. 取 500 mL 激活液（人工海水）置于冷却块中。
      注：通常鱼类精子通过渗透压冲击激活，但对某些物种而言，离子浓度也可能起重要作用。对于淡水物种，激活液应为低渗溶液；而对于海水物种，激活液应为高渗溶液。
   3. 将计数室置于冷却载台上，并等待温度稳定至 4 °C。
   4. 混合激活液与稀释后的精子以激活精子，并在激活后 5–10 秒内开始录制精子运动视频。
      1. 取 4 µL 激活液加入计数室中。
      2. 轻轻振荡离心管 3 次，使稀释后的精子均匀混合，避免损伤精子细胞。
      3. 取 0.5 µL 稀释后的精子，与激活液混合后迅速盖上盖玻片。
         注：此步骤应在 5 秒内完成，以便尽快开始分析。
      4. 聚焦精子细胞，寻找最佳观察区域，即精子数量较少（150 至 200 个细胞）的区域，以避免细胞间轨迹交叉（补充图 1A）。选择 采集视频 以获取按速度区分的精子运动轨迹。
      5. 选择 采集 以获取 3 至 7 个视野，这是获得较低结果变异性的最佳区间，操作方式同前。在激活后 120 秒内完成视频录制，以避免计数室盖片上产生冷凝水。
      6. 选择 退出 以查看所有视野的总体情况。

4. 获取运动性数据

1. 选择 字段 | 部分 | 保存，并选择一个文件名。点击 保存。
   注意：电子表格提供部分数据的平均值、精子运动轨迹的图表和图像。
2. 选择 总览数据 | 文件名 | 保存。
   注意：这些数据提供所有视野中各个精子的运动学参数值。

结果

分析时间效应对精子活力的影响

对于欧洲鳗鲡，在激活后15秒至120秒期间，静止精子的比例从24.4%上升至40.7%，而具有前向运动能力的活动精子比例则下降（从36.9%降至20.9%）（图1A 和 1B）。根据速度分析，精子细胞的运动速度随时间推移而降低（图1C 和 1D）。高速运动精子的比例下降约23%（从49.4%降至26.6%），中速运动精子的比例则上升约7%。

帧率和计数室的影响

讨论

本方案中使用的精子分析软件已被全球研究人员应用于包括鱼类在内的多种物种。然而，鱼类具有一些可能影响精子评估的特定特征。鱼类精子在激活瞬间表现出高速运动，但其活力迅速下降，导致激活后运动时间较短。此外，繁殖温度因物种而异，在某些情况下可能低至 4 °C^2,4,8,12。因此，有必要对计算机化系统进行一些调整，以提高其在鱼类精子分析中的效率。精子运动参数的基本原理是对活动精子的连续图像进行采集和分析。由于软硬件的限制，大多数系统采用标准帧率（16、25、30、50 或 60 fps）^17,18,19,20,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人绒毛膜促性腺激素	Argent Chemical Laboratories	hCG	激素
苯佐卡因	Merck	E1501 Sigma	麻醉剂
碳酸氢钠	Merck	S5761 Sigma	P1 培养基
氯化钠	Merck	1.06406 EMD Millipore	P1 培养基
氯化镁	Merck	1374248 USP	P1 培养基
氯化钾	Merck	P3911-500G	P1 培养基
氯化钙	Merck	C7902-500G	P1 培养基
商用海盐	Aqua Medic	Meersalz	激活液
BSA	Merck	05470 Sigma	激活液
15 ml Falcon 管	Merck	T1943-1000EA
Falcon 管架	Merck	R5651-5EA
Eppendorf 管	Merck	T9661-1000EA
20 µl 微量移液器	Gilson	PIPETMAN® Classic
10 µl 微量移液器	Merck	Z683787-1EA
20 µl 微量移液器吸头	Merck	Z740030-1000EA
10 µl 微量移液器吸头	Merck	Z740028-2000EA
Spermtrack	PROiSER	计数板
TruMorph	PROiSER	TruMorph
UB 200i Serie 显微镜	PROiSER	显微镜
冷却板	PROiSER		原型
冷却块	PROiSER		原型
ISAS v1	PROiSER	ISAS	软件