使用软件和冷却装置进行鱼类精子评估

Summary

本议定书描述了一种使用计算机辅助精子分析和冷却装置进行鱼类精子评估的程序。该软件对基于精子运动的鱼类精子质量进行了快速、准确和定量分析, 可作为水产养殖中提高繁殖成功率的有用工具。

Abstract

对于配子质量评价, 有创新的, 快速的和定量的技术, 可以为水产养殖提供有用的数据。建立了精子分析的计算机系统来测量几个参数, 最常用的测量方法之一是精子运动。

最初, 这种计算机技术是为哺乳动物的物种设计的, 虽然它也可以用于鱼类精子分析。鱼类具有特定的功能, 可以影响精子评估, 如激活后的短期运动时间, 并在某些情况下, 适应较低的温度。因此, 有必要对软件和硬件组件进行修改, 使运动分析更有效地进行鱼精子分析。对于哺乳动物精子, 加热板用于维持精子的最佳温度。然而, 对于某些鱼类来说, 使用较低的温度来延长运动的持续时间是有利的, 因为精子保持活性不到2分钟。因此, 在分析时, 包括在光学显微镜上, 冷却装置是必要的, 在恒定温度下冷藏样品。该协议描述了使用精子分析软件和新的冷却装置对鱼类精子运动进行分析以优化结果。

Introduction

繁殖的功效取决于配子 (卵和精子) 的质量^1,2。这是促成受精成功的主要因素, 允许^3、4的存活后代的发育。对配子质量的方便评价是确定标本生育潜能的最佳工具。

混合精子的多男性是一个常见的做法, 生产许多水生商业物种⁴。然而, 男性之间的精子变异可能导致精子的竞争, 因此, 并非所有的男性都同样贡献的基因池⁵。从这个意义上说, 正确评估个别的射精/精子特征, 如运动, 是获得有关男性生育潜能的歧视性信息的根本。直接观察精子的运动可以产生不准确和主观的数据, 因为它需要时间和经验, 这导致缺乏一致性和不相容的结果^6,7。然而, 有许多创新, 快速和定量的技术, 可以提供可靠的精子质量分析^2,4。

通过计算机辅助精子分析, 提供准确的精子质量数据

Protocol

涉及动物问题的程序已获得批准 (2015/变现/豌豆/00064) 的一般方向的农业生产和牲畜在大学 Politècnica de València。

1. 在圈养的欧洲鳗鱼中收集精子

注: 使用欧洲鳗鱼雄性在水箱中保持海水和循环系统在恒温 (20 摄氏度)。通过每周腹腔注射 (人绒毛膜促性腺激素 (hCG) 来治疗激素; 1.5 的每克鱼体重)。在淡水中逐渐开始使用3天的鱼, 然后用海水替换 (水箱中总水的 1/3) 每2天, 直到达到37.0 克/毫升的盐度。

1. 麻醉24小时后, 通过激素注射获得更好的精子质量样品。
   1. 预先准备麻醉: 添加300毫克的苯佐卡因到100毫升70% 乙醇。混合好, 并存储在4摄氏度。
   2. 在5升的系统水的柔性桶中稀释苯佐卡因, 以获得60毫克/升的最终浓度, 并适当混合。
   3. 用系统水和苯佐卡因把鱼转到水桶里。等几分钟, 直到鱼平静下来。
2. 用清水清除生殖器区, 用吸水纸干燥, 以避免粪便、尿液或海水污染精子样本。
3. 在腹部使用温和的压力, 并将精子样本收集到15毫升的塑料管用真空泵。精子体积可达6-7 毫升, 取决于雄性。
4. 将精子样本保持在4摄氏度, 至少1小时, 直到进行动力分析。

Results

精子运动时间效应分析

在欧洲鳗鱼的情况下, 静态精子的百分比从十五年代增加到120s 在激活以后 (从24.4% 到 40.7%), 并且移动的进步精子的百分比减少 (从36.9% 到 20.9%)(图 1A和1B)。根据速度, 精子细胞显示速度随着时间的推移 (图 1C和1D) 减少。快速速度的精子比例下降了约 23% (从49.4% 到 26.6%), 中等速度精子的比例增加了约7%。

帧速率和计数室的影响

Discussion

在这个协议中使用的精子分析软件已经被全世界的研究人员用于不同的物种, 包括鱼类。然而, 鱼有一些特定的特点, 可以影响精子评估。在活化的瞬间, 鱼精子表现出很高的速度, 在活化后迅速下降, 并导致短暂的运动时间。此外, 繁殖的温度是物种依赖性的, 在某些情况下, 可能是大约4°c^2,4,8,12。因此, 有必要对提高鱼类精子分析系统的效率进行一些适应。动力参数的基本原理是对运动精子的连续图像进行采集和分析。大多数系统使用标准帧速率 (16、25、30、50或 60 fps), 因为硬件和软件的限制为¹⁷、18、^{19、20.......}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
人绒毛膜促性腺激素	Argent 化学实验室	hCG	激素
苯佐卡因	默克	E1501 Sigma 麻醉
氢钠	默克	S5761 Sigma	P1 培养基
氯化钠	默克	1.06406 EMD 米利波尔	P1 培养基
氯化镁	默克	1374248 USP	P1 培养基
氯化钾	默克	P3911-500G	P1 培养基
氯化钙	默克	C7902-500G	P1 培养基
商业盐	Aqua Medic	Meersalz	活化剂溶液
BSA	Merck	05470 Sigma	活化剂溶液
Falcon 管 15 ml	Merck	T1943-1000EA
Falcon 管支持	Merck	R5651-5EA
Eppendorfs	Merck	T9661-1000EA
微量移液器 20 &微量;l	吉尔森·	皮佩特曼®Classic
Micropipet 10 &微量移液器l	默克	Z683787-1EA
微量移液器吸头 20 和微量移液器;l	默克	Z740030-1000EA
微量移液器 10 &l	默克	Z740028-2000EA
Spermtrack	PROiSER	计数室
TruMorph	PROiSER	TruMorph
显微镜 UB 200i 系列	PROiSER	显微镜
冷却板	PROiSER		原型
冷却器模块	PROiSER		原型
ISAS v1	PROiSER	ISAS	软件