本文介绍了一种评估肽类对支气管上皮细胞迁移影响的实验方案。该方法可快速、高度可重复地获得细胞迁移速度和伤口闭合程度的定量数据。
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摘要
摘要
本研究旨在展示一种评估某些免疫调节分子（如抗菌肽（AMPs））刺激细胞迁移能力的新方法。重要的是，细胞迁移是伤口愈合过程中重建组织层完整性和正常功能的关键限速步骤。与传统的通过在细胞单层中手动划痕建立损伤模型的方法相比，本方法的优势在于使用特殊的硅胶培养插件，该插件具有两个隔室，可形成宽度明确（500 μm）的无细胞伪伤口区域。此外，借助自动化的图像分析平台，能够快速获得有关伤口闭合速度和细胞迁移的定量数据。具体而言，本文将展示两种来源于蛙皮肤的抗菌肽对支气管上皮细胞迁移的影响。此外，通过使用特异性抑制剂对这些细胞进行预处理，可进一步揭示上述过程所涉及的分子机制。
引言
众所周知，动物的伤口愈合是一种基本的生理过程，可在组织受损后重新建立组织层的完整性和正常功能1。尽管暴露于外部环境的上皮表面（例如，皮肤、呼吸道和胃肠道）能够形成一道抵御物理和化学损伤的保护屏障 ，但伤口仍可能轻易发生，尤其是在手术后或微生物感染的情况下2。例如，机会性细菌病原体Pseudomonas aeruginosa在肺组织中的定植，特别是在囊性纤维化（CF）患者中，会导致呼吸道上皮损伤，并进而引发呼吸衰竭3,4。伤口愈合是一种复杂的宿主修复机制，旨在恢复受损组织的正常结构5。该过程以初期炎症反应为特征，随后进入再生阶段，包括上皮化、血管生成以及伴随胶原蛋白生成和细胞分化的组织重塑6,7,8。为了维持上皮完整性并控制微生物增殖，所有生物体都会产生防御分子，包括抗菌肽（AMPs）9,10。由于缺乏细胞碎片以及不同类型细胞之间的复杂相互作用，体外模拟伤口愈合过程非常困难。然而，一种肽在体外通过促进上皮细胞迁移而加速伪伤口闭合的能力，可提示其修复受损上皮的潜力。事实上，细胞迁移是伤口愈合过程中的限速步骤，研究能够影响细胞迁移的因素将有助于开发靶向治疗策略，以促进伤口愈合。
在此，提供了一种基于特殊硅胶培养插件的高重复性实验方法，用于评估细胞迁移 体外基于在融合的细胞单层上制造一个500 μm的间隙（拟态伤口），位于人工间隙边缘的细胞 "受伤的" 细胞将开始向无细胞区域迁移，并形成新的细胞间连接。该培养插件为快速进行伤口愈合实验提供了一种新工具。插件包含两个由500 μm隔墙分隔的储液区，可准确放置于3 cm培养皿或12孔板的孔中。将细胞悬液分别加入插件的两个腔室后，细胞可在各自指定区域内生长至融合；移除插件后，即可形成宽度约500 μm（与隔墙宽度相同）的清晰无细胞间隙。随后，可向培养皿或孔中加入含有测试化合物的适当细胞培养基。之后，可在倒置显微镜下于不同时间点观察间隙闭合情况，最好使用配备摄像装置的显微镜以获取图像。最后，通过基于网络的自动化图像分析程序测量细胞覆盖面积的变化，即可定量分析伤口闭合速度和细胞迁移能力。总体而言，该方法相较于经典实验具有进步意义——在经典方法中，需使用无菌针头或移液器枪头在融合的单层细胞上人工划痕以制造伤口11确实，最后这一操作步骤可能会破坏培养皿/孔板的塑料底部和表面涂层，导致产生褶皱。此外， "受伤的" 区域在整个划痕长度上没有明确定义的宽度，因为这在很大程度上取决于研究人员对针头/尖端施加的压力。此外，脱落的细胞可能在划痕边缘形成活细胞与死细胞的团块；同时，活细胞会向划痕区域扩散 "受伤的" 区域可能干扰细胞迁移速度，导致结果不可重复12.
此外，得益于划痕图像分析平台，用户无需获取额外软件，即可在数分钟内快速获得所选细胞迁移行为的定量数据。该平台能够分析低倍（~5X）、中倍（~10X）和高倍（~20X）的相差显微镜图像。上传包含图像的压缩文件（支持 *.jpg、*.jpeg、*.jp2、*.png、*.gif、*.tiff 格式）后，系统将自动进行分析，生成一份汇总文件，显示在不同时间点细胞覆盖区域和划痕区域的百分比，以及细胞迁移速度。
本研究中，通过使用一种蛙皮抗菌肽衍生物， 即 Esc(1-21) 及其非对映异构体 Esc(1-21)-1c13以及一种表达功能性囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR）的支气管细胞系14,15，提供了肽诱导细胞迁移的示例，与未处理（对照）样本进行比较。请注意，气道上皮和CFTR在维持肺功能和伤口修复中起着关键作用16此外，通过使用选择性抑制剂（例如， AG147817 表皮生长因子受体（EGFR）的，上述肽诱导支气管细胞迁移涉及EGFR活化的证据12,18 据报道称。
总之，本实验的目的是展示如何利用此类硅胶培养插件作为一种快速且易于操作的检测方法，以准确测定贴壁细胞的迁移能力例如， 支气管上皮细胞）以及调控这些事件的分子机制。
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方案
1. 细胞制备
- 在 T75 培养瓶中加入 10 mL 添加 2 mM 谷氨酰胺（MEMg）、10% 胎牛血清（FBS）、抗生素（0.1 mg/mL 青霉素和链霉素）及嘌呤霉素（0.5 µg/mL，用于细胞系的筛选与维持）的最低必需培养基（MEM），接种 2.5×106 个细胞。将培养瓶置于 37 °C、5% CO2 条件下培养 2 天。实验开始前，在倒置显微镜下观察细胞融合度。
注意：实验所用细胞为经慢病毒载体转导、具有嘌呤霉素抗性的永生化人支气管上皮细胞，可稳定表达功能性 CFTR14,15。 - 当细胞融合度达到 90–100% 时，在二级生物安全柜内用移液器吸除培养瓶中的培养基，并弃入废液瓶中。用 6 mL 不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（CMF-PBS）洗涤细胞。轻轻手动晃动培养瓶，使液体均匀覆盖，随后弃去 CMF-PBS。
注意：操作时注意不要用移液器触碰细胞单层。 - 加入 10 mL CMF-PBS，将培养瓶置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 10 分钟。
- 吸除 CMF-PBS 并弃去，然后向培养瓶中加入 2 mL 胰蛋白酶/EDTA 溶液。
- 轻轻晃动培养瓶，使溶液充分覆盖细胞表面，置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 10 分钟，直至在显微镜下观察到细胞明显脱落。
注意：孵育结束时，细胞应呈现圆形且脱离塑料表面。若细胞未充分脱落，可进行手动震荡辅助。 - 加入 10 mL 含 10% FBS 的 MEMg 以中和胰蛋白酶活性，并通过冲洗培养瓶底部收集细胞。将全部液体转移至一个 50 mL 圆锥形离心管中。
- 以 80 × g 离心 5 分钟。
- 吸除上清液，用 6 mL 含 10% FBS 的 MEMg 重悬细胞沉淀。反复吹打以充分分散细胞团块。
- 用微量移液器吸取 10 µL 细胞悬液，注入已覆盖于血球计数板（Burker 或 Neubauer 计数室）上的盖玻片边缘下方。
- 计数细胞数量。
2. 在培养插件中接种细胞
- 用无菌镊子将培养小室转移至12孔板的每个孔中（图1）。用镊子沿小室边缘按压，以使其固定在板表面。
注意：小室底部具有黏性，可实现黏附。
图1：硅胶培养插件正确置入12孔板孔中的示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 用含10%胎牛血清的MEMg培养基适当稀释细胞悬液。向插入式培养小室的每个区室中加入70 µL细胞悬液（约3.5×104 个细胞/室）。
注意：每个区室中接种的细胞密度取决于细胞类型。建议采用能够在24小时内达到完全汇合的细胞密度。 - 在显微镜下检查细胞是否从插入式小室的区室中泄漏，并将12孔板在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。
3. 假性伤口愈合实验
- 孵育后，在倒置显微镜下观察细胞，确认已形成融合的单层细胞。
- 将待测化合物（例如，抗菌肽，AMPs）用 1 mL MEMg 重悬。
注意：从储存于 -20 °C 的母液开始，现用现配 AMPs 的稀释液。 - 用无菌镊子轻轻取出插入物，注意避免破坏单层细胞。将插入物转移至吸水纸上。
注意：若需重复使用同一插入物，应将其在 70% 乙醇中灭菌至少 3 小时。建议之后将其丢弃。 - 为去除未贴壁细胞，使用移液器向每孔加入 1 mL MEMg。盖上培养板并轻轻摇动。
注意：避免将培养基直接加在单层细胞上方，以防破坏细胞层。 - 吸除培养基，并更换为每孔 1 mL MEMg。盖上培养板，在倒置显微镜下（配备摄像系统，4倍放大）观察由插入物形成的无细胞区域。在零时点（T0）采集图像，并以 .jpg 格式保存。
- 从各孔中移除培养基，用 1 mL PBS 洗涤后弃去。
- 向各孔中加入第 3.2 步制备的待测化合物。对于未处理的对照样品，加入 1 mL MEMg。将培养板置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育。
- 处理 15、20 和 24 小时后，在显微镜下以 4 倍放大观察细胞迁移情况，并采集图像。
注意：此步骤中应尽量在与 T0 相同的区域采集图像。图像采集的时间间隔选择取决于细胞迁移速度。 - 为研究某些特异性抑制剂（例如 AG1478）对细胞迁移的影响，在取出插入物前，先吸除各插入室中的培养基。
- 用新鲜 MEMg 洗涤每个室，并加入 70 µL 含 AG1478 的 MEMg。
- 在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 30 分钟后，按第 3.3 步所述操作。
注意：在洗涤及用特异性抑制剂预处理单层细胞过程中，注意不要取出插入物。
4. 图像分析
- 实验结束后，选取各实验组最具代表性的样本图像，并创建一个压缩文件，包含 T0、T15、T20 和 T24 h 的单张图像。
注意：对所有样本在选定的时间间隔拍摄单张图像。每次实验均设置三个重复，并至少独立重复三次。最终，对于所有实验组，每组至少获得3张图像（“a”、“b”、“c”） 等等。在每个时间点分析来自各独立实验的样本数据。 - 将压缩文件上传至图像分析软件，该软件将自动通过电子邮件提供一份电子表格摘要文件，其中包含在选定时间点的细胞覆盖面积和划痕面积（以百分比表示）的实验数据。
注意：前沿和间隙区域的识别主要基于边缘检测方法（旨在识别图像亮度发生急剧变化的点）。 - 保存数据并进行收集。以时间为零时的平均值为基准，对所有数据进行归一化处理。计算每个时间点所有重复样本归一化数据的平均值及相对标准误差（SEM）。使用双因素方差分析（ANOVA），借助适当的统计学软件进行统计分析。不同时间点肽处理组与对照组之间的差异，当满足以下条件时被认为具有统计学显著性： p<0.05.
- 将获得的数据绘制成直方图，以显示所有样本组的细胞覆盖面积百分比 与 选定的时间间隔
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结果
本实验方案用于评估 Esc(1-21) 和 Esc(1-21)-1c 对表达功能性 CFTR 的支气管上皮细胞迁移活性的影响，从而确定其促进伤口愈合的效果。在该实验中，将培养插件置于12孔板的孔中，每个腔室接种35,000个细胞，培养基为添加10%胎牛血清（FBS）的MEMg。细胞在24小时内达到完全汇合。随后，生成一个500 μm的间隙，并在每孔中加入含有不同浓度肽段的MEMg培养基。该实验重复了四次。如图2所示，在约20小时内，Esc(1-21)-1c 和 Esc(1-21) 分别在1 μM 和10 μM 的最佳浓度下，诱导细胞单层中形成的假性伤口区域几乎完全闭合。这表明 Esc(1-21)-1c 在促进支气管细胞假性伤口再上皮化方面更具效率。
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讨论
细胞迁移是许多生理和病理事件中的基本过程，包括伤口愈合、胚胎发育以及癌症转移。体外研究细胞迁移的基本步骤包括：（i）形成细胞单层，（ii）在融合的细胞层中制造一个模拟伤口，（iii）在不同时间点拍摄图像，直至伤口闭合，以及（iv）分析图像序列，以定量测定所选细胞的迁移速度。
我们的结果表明，使用培养插件是一种客观且可靠的实验技术，可用于定量评估细胞迁移特性。任何具备基本实验室设备的研究团队均可开展该检测。然而，为确保实验结果的可重复性，应特别注意实验方案中的某些关键步骤。例如，必须通过预实验确定在每个区室中接种的精确细胞数量，以确保所有独立样本达到相同的汇合程度。为此，接种前使细胞处于同步化的细胞周期阶段，并避免细胞聚集成团，是至关重要的。减少细胞聚集的一种可行方法是将细胞悬液轻轻通过注射器针头。然而，增加样本量将显著降低细胞间的变异性。
此外，在所有样品中创建宽度明确的间隙至关重要。为此，硅胶间隔片不应重复使用超过两次。同时，应避免细胞在硅胶隔离壁下方生长。为防止这一问题，可在将间隔片放入培养皿/孔板后，使...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
本工作获得了罗马智慧大学和意大利囊性纤维化研究基金会（项目 FFC#11/2014，由锡耶纳、松德里奥瓦尔基亚文纳、切雷亚“詹妮的微笑”和帕维亚等地的 FFC 代表团资助）的资助。本工作的部分研究还获得了 FILAS 基金会项目协议号 FILAS-RU-2014-1020 的资助。
我们感谢意大利热那亚伊安尼娜·加斯利尼研究所医学遗传科的Loretta Ferrera博士提供了支气管上皮细胞。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 最低必需培养基（MEM） | Euroclone | ECB2071L | 使用前于37 °C水浴中预热 |
| 谷氨酰胺 | Euroclone | ECB3000D | |
| 热灭活胎牛血清（FBS） | Euroclone | ECS0180DH | |
| 青霉素和链霉素 | Euroclone | ECB3001D | |
| 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| 含EDTA的胰蛋白酶1X溶液（溶于PBS） | Euroclone | ECB3052D | 使用前于室温预热 |
| 不含钙和镁的DPBS（CMF-PBS） | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 含钙和镁的DPBS（PBS） | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Ibidi 细胞培养插件 2孔 | Ibidi | 80209 | |
| Wimasis 图像分析软件 | Ibidi | 30002 | |
| PRISM 软件 | GraphPad | 版本 6.0 |
参考文献
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