本文介绍了一种评估肽类对支气管上皮细胞迁移影响的实验方案。该方法可快速、高度可重复地获得细胞迁移速度和伤口闭合程度的定量数据。
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本文内容
摘要
摘要
本研究旨在展示一种评估某些免疫调节分子（如抗菌肽（AMPs））刺激细胞迁移能力的新方法。重要的是，细胞迁移是伤口愈合过程中重建组织层完整性和正常功能的关键限速步骤。与传统的通过在细胞单层中手动划痕建立损伤模型的方法相比，本方法的优势在于使用特殊的硅胶培养插件，该插件具有两个隔室，可形成宽度明确（500 μm）的无细胞伪伤口区域。此外，借助自动化的图像分析平台，能够快速获得有关伤口闭合速度和细胞迁移的定量数据。具体而言，本文将展示两种来源于蛙皮肤的抗菌肽对支气管上皮细胞迁移的影响。此外，通过使用特异性抑制剂对这些细胞进行预处理，可进一步揭示上述过程所涉及的分子机制。
引言
众所周知，动物的伤口愈合是一种基本的生理过程，可在组织受损后重新建立组织层的完整性和正常功能1。尽管暴露于外部环境的上皮表面（例如，皮肤、呼吸道和胃肠道）能够形成一道抵御物理和化学损伤的保护屏障 ，但伤口仍可能轻易发生，尤其是在手术后或微生物感染的情况下2。例如，机会性细菌病原体Pseudomonas aeruginosa在肺组织中的定植，特别是在囊性纤维化（CF）患者中，会导致呼吸道上皮损伤，并进而引发呼吸衰竭3,4。伤口愈合是一种复杂的宿主修复机制，旨在恢复受损组织的正常结构5。该过程以初期炎症反应为特征，随后进入再生阶段，包括上皮化、血管生成以及伴随胶原蛋白生成和细胞分化的组织重塑6,7,8。为了维持上皮完整性并控制微生物增殖，所有生物体都会产生防御分子，包括抗菌肽（AMPs）9,10。由于缺乏细胞碎片以及不同类型细胞之间....
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方案
1. 细胞制备
- 在 T75 培养瓶中加入 10 mL 添加 2 mM 谷氨酰胺（MEMg）、10% 胎牛血清（FBS）、抗生素（0.1 mg/mL 青霉素和链霉素）及嘌呤霉素（0.5 µg/mL，用于细胞系的筛选与维持）的最低必需培养基（MEM），接种 2.5×106 个细胞。将培养瓶置于 37 °C、5% CO2 条件下培养 2 天。实验开始前，在倒置显微镜下观察细胞融合度。
注意：实验所用细胞为经慢病毒载体转导、具有嘌呤霉素抗性的永生化人支气管上皮细胞，可稳定表达功能性 CFTR14,15。 - 当细胞融合度达到 90–100% 时，在二级生物安全柜内用移液器吸除培养瓶中的培养基，并弃入废液瓶中。用 6 mL 不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（CMF-PBS）洗涤细胞。轻轻手动晃动培养瓶，使液体均匀覆盖，随后弃去 CMF-PBS。
注意：操作时注意不要用移液器触碰细胞单层。 - 加入 10 mL CMF-PBS，将培养瓶置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 10 分钟。
- 吸除 CMF-PBS 并弃去，然后向培养瓶中加入 2 mL 胰蛋白酶/EDTA 溶液。
- 轻轻晃动培养瓶，使溶液充分覆盖细胞表面，置于 37 °C、5% CO....
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结果
本实验方案用于评估 Esc(1-21) 和 Esc(1-21)-1c 对表达功能性 CFTR 的支气管上皮细胞迁移活性的影响，从而确定其促进伤口愈合的效果。在该实验中，将培养插件置于12孔板的孔中，每个腔室接种35,000个细胞，培养基为添加10%胎牛血清（FBS）的MEMg。细胞在24小时内达到完全汇合。随后，生成一个500 μm的间隙，并在每孔中加入含有不同浓度肽段的MEMg培养基。该实验重复了四次。如图2所示，在约20小时内，Esc(1-21)-1c 和 Esc(1-21) 分别在1 μM 和10 μM 的最佳浓度下，诱导细胞单层中形成的假性伤口区域几乎完全闭合。这表明 Esc(1-21)-1c 在促进支气管细胞假性伤口再上皮化方面更具效率。
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讨论
细胞迁移是许多生理和病理事件中的基本过程，包括伤口愈合、胚胎发育以及癌症转移。体外研究细胞迁移的基本步骤包括：（i）形成细胞单层，（ii）在融合的细胞层中制造一个模拟伤口，（iii）在不同时间点拍摄图像，直至伤口闭合，以及（iv）分析图像序列，以定量测定所选细胞的迁移速度。
我们的结果表明，使用培养插件是一种客观且可靠的实验技术，可用于定量评估细胞迁移特性。任何具备基本实验室设备的研究团队均可开展该检测。然而，为确保实验结果的可重复性，应特别注意实验方案中的某些关键步骤。例如，必须通过预实验确定在每个区室中接种的精确细胞数量，以确保所有独立样本达到相同的汇合程度。为此，接种前使细胞处于同步化的细胞周期阶段，并避免细胞聚集成团，是至关重要的。减少细胞聚集的一种可行方法是将细胞悬液轻轻通过注射器针头。然而，增加样本量将显著降低细胞间的变异性。
此外，在所有样品中创建宽度明确的间隙至关重要。为此，硅胶间隔片不应重复使用超过两次。同时，应避免细胞在硅胶隔离壁下方生长。为防止这一问题，可在将间隔片放入培养皿/孔板后，使.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
本工作获得了罗马智慧大学和意大利囊性纤维化研究基金会（项目 FFC#11/2014，由锡耶纳、松德里奥瓦尔基亚文纳、切雷亚“詹妮的微笑”和帕维亚等地的 FFC 代表团资助）的资助。本工作的部分研究还获得了 FILAS 基金会项目协议号 FILAS-RU-2014-1020 的资助。
我们感谢意大利热那亚伊安尼娜·加斯利尼研究所医学遗传科的Loretta Ferrera博士提供了支气管上皮细胞。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 最低必需培养基（MEM） | Euroclone | ECB2071L | 使用前于37 °C水浴中预热 |
| 谷氨酰胺 | Euroclone | ECB3000D | |
| 热灭活胎牛血清（FBS） | Euroclone | ECS0180DH | |
| 青霉素和链霉素 | Euroclone | ECB3001D | |
| 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| 含EDTA的胰蛋白酶1X溶液（溶于PBS） | Euroclone | ECB3052D | 使用前于室温预热 |
| 不含钙和镁的DPBS（CMF-PBS） | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 含钙和镁的DPBS（PBS） | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Ibidi 细胞培养插件 2孔 | Ibidi | 80209 | |
| Wimasis 图像分析软件 | Ibidi | 30002 | |
| PRISM 软件 | GraphPad | 版本 6.0 |
参考文献
- Enyedi, B., Niethammer, P. Mechanisms of epithelial wound detection. Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).
- Kujath, P., Kujath, C. Complicated skin, skin structure and soft tissue infections - are we threatened by multi-resistant pathogens? Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., ....
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重印与许可
