植物标本标本的鲁棒 DNA 分离与高通量测序库建设

摘要

本文阐述了从植物标本室材料中提取 dna 隔离和高通量测序库的详细协议, 包括抢救异常质量较差的 dna。

摘要

标本室是一种宝贵的植物材料来源, 可用于各种生物研究。植物标本标本的使用与一些挑战, 包括样本保存质量, 退化的 DNA, 和破坏性抽样稀有标本。为了更有效地利用大型测序工程中的植物标本库材料, 需要一种可靠、可伸缩的 DNA 分离和制备方法。本文展示了一种健壮的, 从不需要对单个样本进行修改的标本标本中进行的 DNA 隔离和高通量库构建的鲁棒的起始到端协议。本协议是为低品质干燥的植物材料量身定做的, 利用现有的方法, 优化组织磨削, 修改库尺寸选择, 并为低产量库引入可选的 reamplification 步骤。低产量 DNA 库的 Reamplification 可以拯救来自不可替代和潜在价值的植物标本标本的样本, 否定额外的破坏性取样的需要, 不引入可识别的顺序偏差, 共同系统进化应用。该议定书已在数以百计的草种上进行了测试, 但预计在验证后能适应其他植物血统的使用。这个协议可以受到极退化的 DNA 的限制, 在那里碎片不存在于所需的大小范围内, 而在某些植物材料中存在的次生代谢物会抑制干净的 dna 分离。总的来说, 该协议引入了一种快速而全面的方法, 允许 DNA 隔离和图书馆准备24样本在少于13小时, 只有8小时的主动动手时间与最小的修改。

引言

植物标本集是一个潜在的有价值的物种和基因组多样性的来源的研究, 包括系统学 1, 2, 3, 人口遗传学 4, 5, 保护生物⁶, 入侵物种生物⁷和特征演变⁸。获得丰富多样的物种、种群、地理位置和时间点的能力突出了 "宝箱"⁹ , 即标本馆。从历史上看, 植物标本所衍生的 DNA 退化的性质阻碍了 PCR 的项目, 往往贬低研究人员只使用高拷贝中发现的标记, 如叶绿体基因组的区域或核糖体的内部转录间隔 (其)rna.标本和 DNA 的质量因保存^9、10的方法而有很大的差异, 在干燥过程中使用的热的双绞碎和破碎是最常见的损害形式, 造成所谓的 90% DNA 锁定, 已使基于 PCR 的研究¹¹。除了碎片, 植物标本组学的第二个最普遍的问题是污染, 例如从内生真菌中提取的¹³或真菌在收集后死后被采集, 但在标本室中安装¹²之前, 虽然这个问题可以解决 bioinformatically 给出正确的真菌数据库 (见下文)。第三个和更不常见的问题是通过胞嘧啶脱氨作用 (C/G→T/A⁾14 进行序列修改, 虽然估计在标本^标本11 中的低 (~ 0.03%)。随着高通量测序 (高温超导) 的出现, 碎片问题可以通过短读取和排序深度^12,15来克服, 从而允许从许多质量较低的样本中获取基因组级数据。DNA, 甚至有时允许整个基因组排序¹⁵。

标本室标本越来越多地被使用, 是系统发育项目的一个更大的组成部分¹⁶。目前的挑战是使用植物标本标本为高温超导始终获得足够的双链 DNA, 一个必要的先决条件, 排序协议, 从众多物种及时, 不需要优化的方法, 个别标本.本文介绍了一种利用现有方法进行 DNA 提取和库标本制备的协议, 并对其进行修改, 以实现快速、可复制的结果。该方法允许从标本到24个样本库的完整处理, 在13小时, 具有8小时的动手时间, 或 16 h, 与 9 h 的实际操作时间, 当需要可选的 reamplification 步骤。同时处理更多的样品是可以实现的, 虽然限制因素是离心能力和技术技能。该协议的目的是只需要典型的实验室设备 (thermocycler, 离心机和磁性支架), 而不是专门的设备, 如喷雾器或 sonicator, 为剪切 DNA。

在高通量测序实验中, DNA 质量、片段大小和数量是限制标本标本使用的因素。其他隔离标本室 dna 和创建高通量测序库的方法表明, 使用10的 DNA¹⁶的效用不大;然而, 它们需要实验性地确定图书馆准备所需的最佳 PCR 周期数。当处理极少量可行的双链 DNA (dsDNA) 时, 这种方法变得不切实际, 因为有些标本标本只为单个库的制备提供了足够的 dna。这里提出的方法使用单一数量的周期, 不管样本质量如何, 所以在库优化步骤中没有丢失 DNA。相反, 当库不满足排序所需的最小金额时, 将调用 reamplification 步骤。许多植物标本是罕见的, 并拥有很少的材料, 使得难以证明破坏性抽样在许多情况下。为了对付这一问题, 所提出的协议允许 dsDNA 的输入大小小于1.25 到库的准备过程, 扩大了可行样本的范围, 以高通量测序, 并尽量减少对样本的破坏性抽样的需要。

下面的协议已经为牧草进行了优化, 并在标本室标本上对数以百计的不同物种进行了测试, 尽管我们预计该协议可以应用于许多其他植物群。它包括一个可选的恢复步骤, 可用于保存低质量和/或稀有标本。根据200余种标本标本, 本协议适用于组织投入和质量低的标本, 可通过最小的破坏性抽样保存稀有标本。这里表明, 该协议可以提供高质量的库, 可以为基于 phylogenomics 的项目排序。

方案

1. 开始前

1. 通过添加20克 CTAB, 使新的烷基铵溴化 (CTAB) 缓冲区¹⁷ , 10 克 polyvinylpyrrolidone (PVP) 40, 100.0 毫升1米三 ph 8.0, 40 毫升四乙酸乙二胺酸 (EDTA) ph 0.5, 8.0 毫升的280.0 米氯化钠, 和5毫升的试剂水一起, 并把总容积1升使用试剂级水。将 pH 值调整为8.0。
   注: 附加试剂可添加到 CTAB, 取决于个别分类群中的次生化合物。见艾伦等。¹⁸用于添加试剂的详细列表。
2. 添加10µL 的β巯基乙醇每5毫升的 CTAB 缓冲区。
   注: 这可以分批50毫升, 并储存在室温下3–4周。
   1. 在65摄氏度的水浴中加热 CTAB 溶液。
3. 冷却迫击炮和杵在-20 °c 至少20分钟。
4. 标签4套 2 x n 2 毫升管 (其中 n = 样本数)。把1套标记的管子放在冰上。
5. 在冰上或在-20 摄氏度冰箱中冷却异丙醇。
6. 从冰箱中移除固相可逆固定化 (SPRI) 珠 (参见材料表), 并允许它们平衡室温 (至少30分钟)。
7. 准备80% 乙醇。
8. 选择标本标本提取和检索〜1厘米², 或10毫克, 每标本组织, 最好叶材料。

2. DNA 提取

1. 用 prechilled 迫击炮和杵研磨 ~ 1 厘米²预选的标本室组织。加入液氮和30–50镁消毒砂。研磨直到组织变成细粉。
   注:10 毫克或更多的组织是可取的, 但较少也在某些情况下工作。一旦液氮蒸发, 添加更多的需要, 直到组织完全地面。另一个常见的破坏细胞和组织的方法是使用珠搅拌器。然而, 这种方法被发现对这些实验所用的标本没有很好的效果。
2. 将冷冻粉末转移到两个2毫升管 (增加不超过一半的管的体积)。将600µL 的暖 CTAB 溶液加入每管, 并通过反转和涡流彻底混合管。
   注: 由于标本室材料的数量和质量往往很低, 两次重复执行 DNA 分离有助于获得较高的产量。
3. 在65摄氏度水浴中孵化样品, 1–1.5 h, 涡流每15分钟。
4. 离心机样品在 1万 x g 5 分钟. 将上清液转移到一组新的标记管 (~ 500 µL)。使用标准的非氯化处理程序丢弃颗粒。
5. 添加4µL 的 RNase (10 毫克/毫升) 每管和混合通过反转或吹打。在热块或水浴中孵育37摄氏度的样品15分钟。
6. 当管子达到室温后, 添加一个相等体积 (500 µL) 的 25:24:1 phenol:chloroform:isoamyl 酒精混合物。通过吹打和/或反演彻底混合。离心管在 1.2万 x g 15 分钟. 将水层 (上层) 转移到一组新的标记管 (~ 400 µL)。将有机层丢弃到氯化废料容器中。
   注: 如果植物材料中预计有大量的次生化合物, 步骤2.6 可能会重复。
7. 添加等量 (400 µL) 的24:1 氯仿: 异戊醇混合物。通过吹打和/或反演彻底混合。离心管在 1.2万 x g 15 分钟. 将水层 (上层) 转移到一组新的 prechilled, 标记管 (~ 300 µL)。将有机层丢弃到氯化废料容器中。
8. 将 prechilled 异丙醇的等量容积 (~ 300 µL) 和2.5 米醋酸钠的12µL 添加到每个管中。孵育样品在-20 °c 为 30–60 min。
   注: 潜伏期可以延长 (直至夜间孵化), 但 DNA 质量会降低样品孵化的时间。
9. 取出冰箱里的样品, 将管子离心在 1.2万 x g 的15分钟内, 轻轻地取出并丢弃上清液, 不干扰颗粒。用新鲜的70% 乙醇 (大约300–500µL), 用悬浮液清洗颗粒。对于每一个加倍的样品, 把两个单独的小球合并成一个与伴随的乙醇。
   注: 样品应先用乙醇合并成一管, 然后再进行。不需要单独用乙醇清洗每个样品。
10. 离心管在 1.2万 x g 10 分钟去除和丢弃上清, 不干扰颗粒。空气干燥颗粒。
    注: 使用干热块 (不超过65摄氏度) 可快速干燥样品。确保样品不会过度干燥, 因为这样可以降低 DNA 的最终产量。
11. 将分离的 DNA 悬浮在50µL 的 1x TE 中。贮存在-20 °c 冷藏柜中, 用于长期贮存或4°c, 供下星期使用。

3. 质量控制 (QC)

1. 用琼脂糖凝胶进行质量检查。
   1. 通过添加54克三基、27.5 克硼酸和3.75 克 EDTA 二钠盐, 制备1x 三/硼酸/edta (no) 缓冲液, 使总容积达到5升, 使用试剂级水。
   2. 通过添加1克琼脂糖到100毫升 1x, 制备1% 琼脂糖凝胶。微波溶液直到没有琼脂糖可见。添加0.01% 核酸凝胶染色 (请参阅材料表)。让瓶子冷却, 直到它是温暖的触摸。搅拌均匀。将琼脂糖倒入凝胶托盘中, 让它凝固。
   3. 混合3µL 的样品, 2 µL 的试剂级水, 1 µL 6x 的负载染料。将样品装入凝胶基质中, 注意它们的顺序。
   4. 在 60–70 v 的60–70中运行样品, 在紫外光下对凝胶进行正确的曝光和聚焦。
      注意: 存在一个清晰的高分子量带是高质量 dna 的标志, 而涂片通常表明 dna 降解。大多数标本标本都被降解。
2. 运行 dsDNA 量化分析 (见材料表), 以确定双链 DNA 的数量。
   1. 使用2µL 的样品进行分析。
      注: 对标本室材料的定量分析不需要稀释, 因为它们的数量往往很少。成功的图书馆已经从这一步的 dsDNA 总的1.26。

4. DNA 剪切

注意: 这是商业双绞 fragmentase 协议的优化版本 (请参见材料表)。

1. 将 dsDNA 碎片酶放在涡流后的冰上3秒。
2. 在无菌0.2 毫升聚合酶链反应 (PCR) 管, 混合1–16µL 分离的 DNA 与2µL 伴随的碎片反应缓冲。通过添加核酸酶自由水, 将总体积提高到18µL。添加2µL dsDNA 破碎酶和涡旋的混合物为 3 s。
   注: 所需 dna 数量因 dna 浓度而异 (瞄准管中的 200)。
3. 将样品孵化37摄氏度, 8.5 分钟。然后添加5µL 0.5 米 EDTA 的管。
   注意: 此步骤需要在潜伏期结束后立即执行, 以终止反应并防止 DNA 样品过度剪切。

5. 珠清理

1. 融汇 SPRI 珠涡流。
2. 通过添加25µL 核酸酶游离水, 将被剪切 DNA 的总体积提高到50µL。添加45µL 室温 SPRI 珠 (90% 卷) 到50µL 的剪切 DNA, 并彻底混合吹打上下。
   注: 在总试样体积的90% 处添加珠子是为了去除最小的 DNA 片段, 通常低于200基对。
3. 让样品孵化5分钟. 把管子放在磁板上, 让它们坐5分钟. 小心地取出并丢弃上清。
   注意: 小心不要打扰珠子, 因为它们含有所需的 DNA 目标。
4. 在磁性支架上加入200µL 新鲜80% 乙醇的管子。在室温下孵化三十年代, 然后仔细去除并丢弃上清。重复此步骤一次。空气干燥的珠子5分钟, 而管是在磁性立场与它的盖子打开。
   注意: 避免过度干燥的珠子。这可能导致 DNA 的回收率降低。
5. 把管子从磁铁上取下。洗脱的 DNA 从珠子变成55µL 的 0.1x TE, 并彻底混合吹打上下。在室温下孵育5分钟, 将管子放在磁性支架上, 等待溶液转晴 (~ 2 分钟)。
6. 把上清的52µL。对样品进行 DNA 定量分析, 以检查回收和进入图书馆准备的初始浓度。
   注: 图书馆的总 dsDNA 估计不到1.25 吴, 但在每种情况下 reamplification 是必需的。

6. 图书馆准备工作

注意: 这是一个商业上可用的库套件的修改版本 (请参见材料目录协议)。

1. 结束准备
   1. 添加3µL 的限制性和磷酸盐尾矿酶, 和7µL 的伴随反应缓冲50µL 清洗, 剪切 DNA。通过上下吹打彻底混合。旋转管子以除去气泡。
      注: 总容积应为60µL。
   2. 将样品放在 thermocycler 中, 以下列程序:30 分钟在20°c, 30 分钟在65°c, 然后举行在4°c。
      注: 加热盖设置为≥75°c
2. 适配器结扎
   1. 稀释适配器25–50折叠 (工作适配器集中的0.6–0.3 µM)。添加30µL 结扎主混合, 1 µL 结扎增强器, 2.5 µL 适配器的高通量短读测序的管。
      注: 总容积应为93.5 µL。
   2. 通过上下吹打彻底混合。旋转管子以除去气泡。将试管孵化20摄氏度, 15 分钟。
   3. 添加3µL 的商业混合物的尿 dna glycosylase (UDG) 和 DNA glycosylase 裂解酶限制性 VIII (见材料表) 的管。确保总容积为96.5 µL. 混合彻底和孵化37摄氏度15分钟使用 thermocycler。
      注: 盖子应设置为≥47°c。原始版本的商业协议有大小选择后, 适配器结扎步骤, 其次是珠清理作为最后一步。该协议实现了更高的收益率, 切换这些步骤的顺序, 并实现大小选择作为最后一步。
3. 清除酶和小碎片
   1. 融汇磁珠由涡流。
   2. 添加78µL SPRI 磁性珠 (80% 卷), 并彻底混合吹打上下。
      注: 在总试样体积的80% 处添加珠子, 以去除最小的 DNA 片段, 这些碎片通常少于250基对。更严格地去除小的 DNA 片断是 (i) 去除多余的适配器和 (ii) 在以下步骤强调放大更大的片断。
   3. 让样品孵化5分钟. 把管子放在磁板上5分钟. 小心地移除并丢弃含有所需尺寸范围外的 DNA 的上清。
      注意: 注意不要干扰含有所需 DNA 靶的珠子。
   4. 在磁性支架上加入200µL 新鲜80% 乙醇的管子。在室温下孵化三十年代, 然后仔细去除并丢弃上清。重复此步骤一次。空气干燥的珠子5分钟, 而管是在磁性立场与盖子打开。
      注意: 避免过度干燥的珠子。这可能导致 DNA 的回收率降低。
   5. 把管子从磁铁上取下。洗脱通过添加17µL 0.1x TE, 并通过上下吹打彻底混合, 将 DNA 目标从珠子中提取出来。
   6. 在室温下孵育5分钟, 将管子放在磁性支架上, 等待溶液转晴 (~ 2 分钟)。
   7. 把上清的15µL。
4. PCR 扩增
   1. 添加25µL 高保真 PCR 主混合, 5 µL 高吞吐量短读测序库准备 5 ' 底漆, 5 µL 的高通量短读测序库准备 3 ' 底漆, 到15µL 清洗适配器-结扎 DNA。
      注: 总容积应为50µL。
   2. 和涡流混合。使用在表 1中找到的设置将示例放入 thermocycler 中: thermocycler 放大设置。
      注: 由于输入 DNA 数量少, 需要大量的循环。

循环步骤	临时.	时间	周期
初始变性	98°c	三十年代	1
变性	98°c	十年代	12
退火/延伸	65°c	七十五年代	12
最终扩展名	65°c	5分钟	1
举行	4°c

表 1: PCR 协议变性、退火和延长时间和温度.对本协议中的试剂进行了温度和时间的优化。如果试剂被改变, 温度和时间应该再优化。

5. 所需库大小的大小选择
   注: 此珠子步骤将删除目标范围上方和下方的碎片。
   1. 融汇 SPRI 珠涡流。
   2. 添加25µL (50% 体积) 室温磁性珠, 并彻底混合吹打上下。让样品孵化5分钟. 把管子放在磁板上, 让它们坐5分钟. 小心地移除和转移上清到一组新的标记管。
      注意: 此卷可以根据所需的库大小进行调整。上清含有所需大小的 DNA 片段。在第一个珠孵化, 珠子是绑定较大的库片段。它们被移除, 以集中于400–600基对范围中的那些。上清中含有较小的碎片。
   3. 添加6µL 室温 SPRI 珠到上清, 并彻底混合吹打上下。让样品孵化5分钟. 把管子放在磁板上, 让它们坐5分钟。
      注意: 该卷可以根据所需的库大小进行调整, 按照步骤6.5.2。
   4. 小心取出并丢弃上清。
      注意: 注意不要干扰含有所需 DNA 的珠子。在第二个珠孵化, 珠子是绑定到留下的碎片后, 最初删除的最大的 DNA 片段。这组片段通常在所需的大小范围内。
   5. 在磁性支架上加入200µL 新鲜80% 乙醇的管子。在室温下孵化三十年代, 然后仔细去除并丢弃上清。重复.空气干燥的珠子5分钟, 而管是在磁性立场与盖子打开。
      注意: 避免过度干燥的珠子。这可能导致 DNA 的回收率降低。
   6. 把管子从磁铁上取下。洗脱的 DNA 目标从珠子成33µL 0.1x TE, 并彻底混合吹打上下。
   7. 在室温下孵育5分钟, 将管子放在磁性支架上, 等待溶液转晴 (~ 2 分钟)。拉出30µL 的上清, 转移到2毫升管 (参见材料表) 进行存储。
      注意: 图书馆可以保存在-20 ˚C, 用于长期存储。
6. 质量控制
   1. 在 DNA 库上运行质量控制测试。请参阅步骤3.1 和3.2。
      注: 对于 DNA 库, 在 96 v 上运行凝胶45分钟。
7. 库 reamplification: 如果库数量不足, 则可选。
   注意: 使用以下步骤可以 reamplified 10 nM 以下的样本库浓度。低浓度库的 Reamplification 可以实现排序的可行结果, 但 Reamplification 可能导致基本组成多样性的适度转移, 尽管收集的数据 (表 3) 表明, 对于某些度量标准来说, 这是微不足道的。.
   1. 用 0.1x reamplification 稀释普通的引物10倍。
   2. 添加25µL 高保真 PCR 主混合, 5 µL 稀释通用 reamplification 底漆 1 (AATGATACGGCGACCACCGA), 5 µL 稀释通用 reamplification 底漆 2 (CAAGCAGAAGACGGCATACGA) 到15µL 低浓度的图书馆。注: 总容积应为50µL。
   3. 和涡流混合。使用在表 1中找到的设置将示例放入 thermocycler 中: thermocycler 放大设置
      注: 由于输入 DNA 数量少, 需要大量的循环。
   4. 珠清理
   5. 融汇 SPRI 珠涡流。添加45µL 室温 SPRI 珠 (90% 卷), 并彻底混合吹打上下。
   6. 让样品孵化5分钟. 把管子放在磁板上5分钟。
   7. 小心地除去并丢弃含有不需要的 DNA 的上清。
      注意: 注意不要干扰含有所需 DNA 靶的珠子。
   8. 在磁性支架上加入200µL 新鲜80% 乙醇的管子。在室温下孵化三十年代, 然后仔细去除并丢弃上清。重复此步骤一次。
   9. 空气干燥的珠子5分钟, 而管是在磁性立场与它的盖子打开。
      注意: 避免过度干燥的珠子。这可能导致 DNA 目标的恢复降低。
   10. 把管子从磁铁上取下。洗脱的 DNA 目标从珠子成33µL 0.1x TE, 并彻底混合吹打上下。
   11. 在室温下孵育5分钟, 将管子放在磁性支架上, 等待溶液转晴 (~ 2 分钟)。
   12. 把上清的30µL。这些库可以存储在-20 摄氏度, 用于长期存储。
8. 质量控制
   1. 在 DNA 库上运行质量控制测试。请参阅步骤3.1 和3.2。对于 DNA 库, 在 96 v 上运行凝胶45分钟。
      注: 如果在凝胶中看到双带, 这可能是从 reamplification 步骤的底漆耗尽的后果。可以通过重复6.9 移除带区, 但在表 1中描述的 PCR 程序中只使用一个周期。

结果

DNA 分离与最终图书馆产量
在这项研究中, 使用五十种不同的样本, 从1920年和2012年最年轻的人 (表 2) 中, 证明了隔离标本室 DNA 和恢复高质量测序库的协议的有效性。对于每个样品, 大约10毫克的叶组织被用于 DNA 分离。绿色的叶子组织是有利的, 如果有, 并且没有被选择的有明显的真菌污染的组织。成功的隔离可以使用黄色或褐色的组织, 虽然产量应预期较低。从最初的隔离中提取的双链 DNA (dsDNA) 的总数从 3.56 ng 到2610。如所料, 从植物标本标本获得的 DNA 高度退化 (图 1A,补充图 1)。这些隔离的一部分用于酶剪切 (1.26–464)。虽然标本室 DNA 已经通过保存过程进行了剪切, 但是优化该协议需要额外的剪切来提高整个库的产量。dsDNA 后的总回收率从 < 1% 到51% 的输入 dsDN...

讨论

本协议是一种综合可靠的方法, 用于 DNA 分离和测序库的干燥标本的制备。该方法的一致性和最小的需要改变它的基础上标本质量, 使它可伸缩的大型植物标本的排序项目。为低收益库包含一个可选的 reamplification 步骤, 允许包含低质量、低数量、稀有或历史上重要的样本, 否则将不适合排序。

初始 DNA 产量的重要性
标本室衍生的 dna 通常被降级为最初的标本保存¹¹, 与300岁以下的标本 dna 降解为从动物遗骸分离的 dna, 是数以千年的历史^31,32. 因此, 初始 DNA 产量的优化对于获得足够高品质的 dsDNA 为成功的测序库准备至关重要。对于草种, 最佳产量是通过在初始研磨步骤中结合使用灭菌的沙子和液氮来实现的, 从而更彻底地破坏细胞壁和释放核酸。此方法增加了可取的较大 dsDNA 和不需要的较小片段 (

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Veriti 热循环仪	Applied Biosystems	4452300	96 孔
凝胶成像系统	Azure Biosystems	c300
Microfuge 20系列	Beckman Coulter	B30137
数字干浴	Benchmark Scientific	BSH1001
电泳系统	EasyCast	B2
PURELAB flex 2 （超纯水）	ELGA	89204-092
DNA LoBind LoBind 软管	Eppendorf	30108078	2 ml
迷你离心机	Fisher Scientific	12-006-901
Vortex-Genie 2	Fisher Scientific	12-812
研钵	Fisher Scientific	S02591	瓷
研杵	fisher Scientific	S02595	瓷器
管	fisher Scientific	21-403-161
微波	Kenmore	405.7309231
Qubit 检测管	Invitrogen	Q32856
0.2 ml PCR 联管和盖	VWR	20170-004
Qubit 2.0 荧光计	Invitrogen	Q32866
天平	梅特勒-托利多	PM2000
液氮短期储存	Nalgene	F9401
磁环支架	赛默飞世尔科技	AM10050	96 孔
水浴	VWR	89032-210
热板搅拌器	VWR	97042-754
液氮	空气气体	UN1977
1 x TE 缓冲液	Ambion	AM9849	pH 8.0
CTAB	AMRESCO	0833-500G
2-巯基乙醇	AMRESCO	0482-200ML
核糖核酸酶 A	AMRESCO	E866-5ML	10 mg/ml 溶液
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63882
氯化钠	bio WORLD	705744
异丙醇	bio WORLD	40970004-1
无核酸酶水	bio WORLD	42300012-2
异戊醇	Fisher Scientific	A393-500
乙酸钠三水合	Fisher Scientific	s608-500
LE 琼脂糖	GeneMate	E-3120-500
100bp PLUS DNA 分子量标准	Gold Biotechnology	D003-500
EDTA、二钠盐	IBI Scientific	IB70182
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒	Life Technologies	Q32854
TRIS	MP Biomedicals	103133	超纯
凝胶上样染料紫色 （6 X）	New England BioLabs	B7024S
NEBNext dsDNA 片段酶	England BioLabs	M0348L
NEBNext Ultra II Illumina DNA 文库制备试剂盒	New England BioLabs	E7645L
NEBNext 多重寡核苷酸，用于 Illumina	New England BioLabs	E7600S	双索引引物套装 1
NEBNext Q5 热启动 HiFi PCR 预混液	New England BioLabs	M0543L
Mag-Bind RXNPure Plus	Omega bio-tek	M1386-02
GelRed 10000 X	Pheonix Research	41003-1
苯酚溶液	SIGMA Life Science	P4557-400ml
PVP40	SIGMA-Aldrich	PVP40-50G
氯仿	VWR	EM8.22265.2500
乙醇	Koptec	V1016	200 证明
硅砂	VWR	14808-60-7
再扩增引物	Integrated DNA Technologies	见正文
Sequencher v.5.0.1	基因编码