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方法文章

细菌脂蛋白的富集及N端脂肽的制备用于质谱法结构鉴定

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DOI：

10.3791/56842

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2018年5月21日

 , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Pennsylvania State University

本文内容

摘要

本文描述了使用非离子型表面活性剂相分离方法富集细菌脂蛋白，可直接用于Toll样受体（TLR）检测或其他应用。此外，还详细介绍了制备N端胰蛋白酶消化脂肽的后续步骤，以通过质谱法进行结构表征。

摘要

脂蛋白是细菌细胞包膜的重要组成成分，也是哺乳动物先天免疫反应的强效激活剂。尽管脂蛋白在细胞生理学和免疫学中具有重要意义，但关于新型脂蛋白的形式、其合成机制以及不同形式对宿主免疫系统的影响，仍有许多未知之处。为了支持对脂蛋白的深入研究，本实验方案描述了一种用于富集细菌脂蛋白并制备其N端胰蛋白酶切脂肽的方法，以便通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行结构鉴定。该方法在已有Triton X-114相分离技术基础上进行了改进，用于从细菌细胞膜中提取和富集脂蛋白，并新增了去除非脂蛋白污染物的步骤，从而提高了脂蛋白的得率和纯度。由于脂蛋白常被用于Toll样受体（TLR）功能检测，因此首先通过MALDI-TOF MS对其N端结构进行表征至关重要。本文提供了一种方法，可分离出富含N端脂肽的浓缩疏水性肽段，适用于直接进行MALDI-TOF MS/MS分析。经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离的脂蛋白被转移至硝酸纤维素膜上，随后进行酶解 原位 用胰蛋白酶处理后，依次洗涤以去除极性胰蛋白酶肽段，最后用氯仿-甲醇洗脱。当与来自洗涤液的极性较强的胰蛋白酶肽段的质谱分析相结合时，该方法可在单次实验中实现脂蛋白的鉴定及其N末端的表征。有意形成钠加合物也可作为一种手段，以促进产生更具结构信息的碎片谱图。最终，对脂蛋白的富集及其N端结构的确定将有助于对这类广泛存在的细菌蛋白开展更深入的研究。

引言

细菌脂蛋白的特征是其N端含有一个保守的脂质修饰半胱氨酸，该结构将球状蛋白结构域锚定在细胞膜表面。脂蛋白在细菌中普遍存在，占典型基因组中所有细胞基因的2%至5%1。脂蛋白在多种细胞过程中发挥关键作用，包括营养摄取、信号转导、蛋白质复合物的组装以及维持细胞包膜的结构完整性2。在致病性细菌中，脂蛋白可作为毒力因子3,4。在感染过程中，Toll样受体（TLR）2对N端脂肽的识别会引发先天免疫反应，以清除入侵的病原体。根据N端酰化状态的不同，脂蛋白通常被不同的TLR2异源二聚体复合物识别：TLR2-TLR1识别N-酰化脂肽，而TLR2-TLR6则结合游离脂肽的α-氨基末端。一旦结合，信号通路将汇聚并诱导促炎性细胞因子的分泌3,4。

过去认为，革兰氏阳性菌的脂蛋白为二酰化，而革兰氏阴性菌的脂蛋白为三酰化，其差异在于保守的N端半胱氨酸残基上是否存在酰胺键连接的脂肪酸。这一假设得到了基因组序列分析的支持：革兰氏阳性菌基因组中缺乏与革兰氏阴性菌N-酰基转移酶Lnt同源的序列，而Lnt负责形成三酰化脂蛋白5。然而，近期研究发现，在缺乏lnt基因的革兰氏阳性菌厚壁菌门（Firmicutes）中也存在脂蛋白三酰化现象，并且还发现了三种新的N端脂蛋白结构，分别称为肽基（peptidyl）、溶血（lyso）和N-乙酰化形式6,7,8。这些发现提出了新的问题：是否还存在其他尚未被发现的脂蛋白形式？这些新型脂蛋白是如何合成的？不同形式的脂蛋白在生理上具有何种功能或优势？此外，这些发现明确表明，当前基因组学尚无法准确预测脂蛋白的结构。事实上，我们最近从Enterococcus faecalis和Bacillus cereus中鉴定出一类新型脂蛋白N-酰基转移酶，命名为Lit，该酶可生成溶血型脂蛋白9。这说明必须通过实验手段验证脂蛋白结构，但由于脂蛋白具有极强的疏水性，且可用于表征其分子结构的方法有限，实验验证面临较大挑战。

为促进对脂蛋白诱导宿主免疫反应的研究以及N端结构的测定，我们改进了多种已有报道的实验方案，以纯化细菌脂蛋白并制备N端胰蛋白酶消化的脂肽，用于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析6,10,11,12脂蛋白通过已建立的Triton X-114（下文简称表面活性剂或TX-114）相分离方法进行富集，并经过优化以去除污染性非脂蛋白杂质并提高脂蛋白得率。所获得的脂蛋白可直接用于TLR检测，或进一步通过SDS-PAGE进行纯化。对于MALDI-TOF质谱分析，将脂蛋白转移至硝酸纤维素膜可提供一个高效的支架 原位 胰蛋白酶消化、洗涤以及随后从膜表面洗脱，从而获得高纯度的N端脂肽。硝酸纤维素已被证明可促进样品处理，并提高跨膜蛋白中高度疏水性肽段的序列覆盖率。13,14以及脂蛋白9,10该方法还具有根据肽段极性进行分级分离的额外优势，因此可在单次实验中，利用中间洗涤液同时实现高置信度的蛋白质鉴定与N端结构测定。本实验方案的独特之处在于有意形成钠加合物，以促进母离子在MS/MS过程中向脱氢丙氨酰离子方向发生断裂，从而有助于结构鉴定 N-酰化状态。N端是与Toll样受体（TLR）识别脂蛋白相关的关键且最具变异性的特征。综上所述，本方案为脂蛋白的深入且可重复的研究提供了支持，其纯化及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）结构鉴定的各个步骤可根据实验总体目标灵活调整。

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方案

1. 细胞生长与裂解

  1. 将细菌在15 mL胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）或其他类似的丰富培养基中培养至对数生长后期（OD600为1.0–1.5）。通过离心收集细胞，用Tris缓冲盐水/EDTA（TBSE）洗涤一次，然后继续进行后续操作或冻存备用。
    注意：TBSE成分为20 mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl），pH 8.0，130 mM氯化钠（NaCl）和5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）。脂蛋白的表达与修饰可能受培养条件（例如酸度、盐度、培养基种类）和生长阶段的影响15。细胞培养量可根据需要调整，但建议单次脂蛋白制备使用15 mL培养物，因为过多的生物量可能降低脂蛋白得率。一次15 mL培养物的制备通常可获得足够在标准SDS-PAGE小型凝胶上加载约2–4个泳道的最佳样品量。
  2. 将细胞重悬于800 μL含1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）和0.5 mg/mL溶菌酶的TBSE中。将溶液转移至带螺帽和O型圈的2.0 mL螺口微量离心管中，在37 °C孵育20分钟。
    注意：某些菌种对溶菌酶不敏感。应选用合适的裂解酶以促进细胞裂解。
  3. 向管中加入约800 μL 0.1 mm氧化锆/二氧化硅珠，使用均质器以最大速度（7,000 rpm）振荡5个循环，每个循环30秒，每次循环之间在冰上静置2分钟。
  4. 在4 °C下以3000 × g离心5分钟（使珠子和未破裂细胞沉淀）。将上清液转移至新的2.0 mL微量离心管中，并置于冰上保存。
  5. 向残留的沉淀中加入200 μL TBSE，放回均质器再进行一个裂解循环。离心（条件同上），并将所得上清液与前次上清液合并（总体积应约为800–1000 μL）。

2. 通过TX-114相分离富集脂蛋白

  1. 向 supernatant 中加入 TX-114 表面活性剂，通过加入等体积的 4% (vol/vol) 冰冷 TBSE 配制的表面活性剂，使终浓度达到 2% (vol/vol)，在冰上孵育 1 小时，每约 15 分钟轻轻颠倒混匀一次。
    注意：低温条件下，supernatant 与表面活性剂可混溶。
  2. 将离心管转移至 37 °C 水浴中孵育 10 分钟以诱导相分离。在 室温 下以 10,000 × g 离心 10 分钟，以维持双相分离状态。
  3. 小心用移液器吸除上层水相并弃去。向下层表面活性剂相中加入冰冷的 TBSE，补足至原始体积，轻轻颠倒混匀。在冰上孵育 10 分钟。
  4. 将离心管转移至 37 °C 水浴中孵育 10 分钟以诱导相分离，随后在室温下以 10,000 × g 离心 10 分钟。
  5. 重复步骤 2.3–2.4 一次，共完成 3 次相分离。移除上层水相并弃去。
  6. 向表面活性剂相中加入 1 体积冰冷的 TBSE，以去除提取过程中形成的沉淀蛋白（可见于管底）。在 4 °C 下以 16,000 × g 离心 2 分钟，使不溶性蛋白形成沉淀。
    注意：样品应保持单相状态。若发生相分离，需重新冰浴并再次离心。该沉淀通常由非脂蛋白污染物组成，但也可保留用于进一步分析。
  7. 立即将 supernatant 转移至含有 1250 μL 100% 丙酮的新鲜 2.0 mL 微量离心管中。充分上下吹打，彻底清洗移液器吸头，因样品黏稠。颠倒混匀后，在 -20 °C 过夜孵育以沉淀蛋白。
  8. 在室温下以 16,000 × g 离心 20 分钟，使脂蛋白沉淀，并注意离心管的放置方向。脂蛋白将在管壁外侧形成一层薄而白色的膜状物。
  9. 用 100% 丙酮洗涤沉淀两次。倾去丙酮，让样品自然风干。
  10. 加入 20–40 μL 10 mM Tris-HCl（pH 8.0）或标准 Laemmli SDS-PAGE 上样缓冲液16，通过在管壁反复上下吹打，充分重悬沉淀的脂蛋白。用移液器吸头刮擦管壁以使脂蛋白脱落。
    注意：脂蛋白不会溶解于 Tris 缓冲液中，而是形成悬浮液。
    1. 将脂蛋白储存于 -20 °C，待用。

3. SDS-PAGE、电泳转膜及Ponceau S染色

  1. 使用标准方法通过 SDS-PAGE 分离脂蛋白16。
    注意：凝胶丙烯酰胺的合适百分比将根据其预期用途和脂蛋白的大小而有所不同。此处，E. faecalis 脂蛋白在 10% Tris-甘氨酸凝胶上分离，而较小的 E. coli 脂蛋白 Lpp 则使用 16.5% Tris-三羟甲基氨基甲烷（Tricine）凝胶17。
  2. 使用标准电转印程序将脂蛋白转移至硝酸纤维素转印膜。
    注意：采用半干式转印，在 Bjerrum Schafer-Nielsen 缓冲液中加入 0.1% SDS，于 25 V、1.3 mA 条件下进行 15 分钟18。也可选用聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，但由于其比硝酸纤维素更疏水，可能在后续步骤中降低疏水性脂肽从膜上的有效洗脱效率。
  3. 将硝酸纤维素膜转移至容器中，并用 Ponceau S 溶液（0.2% (w/v) Ponceau S 溶于 5% 乙酸）覆盖。轻轻摇动 5 分钟，直至出现红粉色条带。
  4. 倒掉 Ponceau S 溶液，并用去离子水（dH2O）小心冲洗硝酸纤维素膜，以去除多余的染料。
    注意：Ponceau 染色的条带会迅速褪色。若条带消失，请重复染色过程。
  5. 使用洁净的剃刀切下目标条带，并转移至微量离心管中。用 1 mL 去离子水（dH2O）洗涤三次，彻底去除染料。
    注意：本实验方案可在此暂停。将切下的膜片用去离子水覆盖后，于 -20 °C 保存，待后续使用。
  6. 将膜片转移至洁净表面，用洁净的剃刀将硝酸纤维素条切成约 1 mm × 1 mm 的小片。将碎片收集至 0.5 mL 低蛋白结合微量离心管中。
  7. 用 0.5 mL 新鲜配制的 50 mM 碳酸氢铵（NH4HCO3），pH 7.8（使用高效液相色谱级水）洗涤碎片两次。

4. 硝酸纤维素膜上脂肽的胰蛋白酶消化、提取、点样至MALDI靶板及数据采集

  1. 将硝酸纤维素碎片重悬于 20 μL 含 20 μg/mL 胰蛋白酶的溶液中，该溶液由 50 mM NH4HCO3（pH 7.8）溶于 HPLC 级水配制而成。涡旋混匀后短暂离心，确保所有碎片均被胰蛋白酶溶液完全覆盖。用石蜡膜封住管盖以防止蒸发，并在 37 °C 下孵育过夜进行消化。
  2. 以 16,000 × g 离心 30 秒，然后用移液器移除上清液。
    注：此步骤可去除经胰蛋白酶处理后产生的亲水性肽段，后续可通过 MALDI-TOF 质谱进行蛋白鉴定分析。
  3. 加入 50 μL 含 0.5% 三氟乙酸（TFA）的 HPLC 级水溶液。涡旋混匀后短暂离心，确保所有碎片均被溶液覆盖。室温孵育 10 分钟，然后用移液器移除液体。
    注意：TFA 吸入有害。操作时应谨慎，并在化学通风橱中使用，避免接触皮肤。
  4. 用 50 μL 含 10% 乙腈的 HPLC 级水溶液重复步骤 4.3。
    注意：乙腈吸入有害。操作时应谨慎，并在化学通风橱中使用，避免接触皮肤。
  5. 用 50 μL 含 20% 乙腈的 HPLC 级水溶液重复步骤 4.3。
    注：此步骤可去除任何弱结合于硝酸纤维素上的中等疏水性肽段。
  6. 为洗脱紧密结合的脂肽，加入 15 μL 新鲜配制的 CHCA 基质溶液（10 mg/mL α-氰基-4-羟基肉桂酸溶于氯仿-甲醇（2:1, v/v）），室温孵育 10 分钟，期间间歇性涡旋。
    1. 也可选择：加入 15 μL 氯仿-甲醇溶液洗脱脂肽，基质可在后续步骤中另行加入。若针对特定脂肽组分使用 CHCA 效果不理想，可测试其他基质（如 2,5-二羟基苯甲酸（DHB））作为替代方案。
      注意：氯仿和甲醇吸入均有害。操作时应谨慎，并在化学通风橱中使用，避免接触皮肤。
    2. 可选步骤：为促进钠加合物的形成，可在氯仿-甲醇中的 CHCA 溶液中添加水相碳酸氢钠（NaHCO3），使终浓度达到 1 mM。
  7. 短暂离心样品。用移液器小心将上清液转移至新的低蛋白吸附微量离心管中。该溶液将含有大部分 N 端脂肽。
    注：硝酸纤维素可能在氯仿-甲醇溶液中部分或完全溶解。这不会对质谱结果产生负面影响，且可作为提高脂肽回收率的替代方法。聚偏氟乙烯（PVDF）膜则不会以相同方式溶解。
  8. 取 1 μL 含 CHCA 的洗脱脂肽溶液，点样至抛光钢制 MALDI 靶板上。
    注：氯仿-甲醇会迅速挥发，留下结晶的 CHCA 与脂肽。可选地，可将第二份 1 μL 样品点在同一位置以提高样品浓度。由于氯仿-甲醇点样后可能显著扩散，应注意避免靶板上样品间的交叉混合。建议对每个样品点多个点并分别检测。
  9. 立即进行质谱分析。扫描整个靶点区域以检测脂肽信号，尤其当靶点含有两层样品时，因第二层可能将脂肽推至靶点外缘。
    注：建议起始激光强度设为 25%，但可能需要提高强度以获得信号，并累加多个谱图（20 次或更多扫描）以达到足够的信噪比。本实验在 MALDI-TOF-TOF 仪器（参见材料表）上采集谱图，采用出厂配置的反射正离子检测模式，检测范围为 700–3500 m/z。仪器使用牛血清白蛋白（BSA）胰蛋白酶肽混合物进行校准。

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结果

方案的示意图如下所示 图1富含脂蛋白的组分提取自 粪肠球菌 ATCC 19433 经 TX-114 处理的结果如图所示 图2作为对照，还展示了沉淀蛋白质组分的条带模式。MALDI-MS 验实该组分中的蛋白质为非脂蛋白的高丰度污染蛋白表1）。质谱图中的 图3 展示胰蛋白酶肽离子谱的 E. faecalis 脂蛋白PnrA，其在用极性逐渐增强的溶剂对硝酸纤维素结合的PnrA进行后续洗涤时出现（峰归属列于 表 2). 图4 显示 N通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS/MS）对PnrA进行的末端结构表征，揭示了具有诊断意义的特征 N-脱酰基脱氢丙氨酰峰，与溶菌型脂蛋白形式一致。 ...

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讨论

本方案描述了脂蛋白表征的两个不同阶段：通过TX-114相分离法富集脂蛋白，以及通过MALDI-TOF质谱进行结构鉴定。在TX-114提取过程中，额外的离心步骤可去除在此过程中沉淀的污染蛋白，随后通过丙酮沉淀获得高度富集的脂蛋白。通过将每次制备的样品量限制在相当于15 mL细胞的规模，可同时平行处理多个样品，并在方案结束时根据需要进行合并。

用于质谱法进行结构分析时，将脂蛋白转移至硝酸纤维素膜上有助于胰蛋白酶消化、洗涤以及后续从膜上洗脱。据我们经验，该方法优于通过去垢剂从传统的聚丙烯酰胺凝胶块中提取脂蛋白的方法，因为脂蛋白结合在硝酸纤维素膜表面，而非嵌入聚丙烯酰胺凝胶内部。脂蛋白与硝酸纤维素膜表面的结合也大大避免了疏水性肽段非特异性吸附到容器表面的常见问题。通过逐步洗脱硝酸纤维素膜片段，可分离出更多亲水性的内部胰蛋白酶消化肽段，这些肽段可通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行分析，从而实现高置信度的蛋白质鉴定；而最后的洗脱步骤则可重复性地获得浓缩的脂肽，洗脱体积小，且基本不含干扰性盐类及抑制离子化的污染物。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

Meredith 实验室的研究工作得到了宾夕法尼亚州立大学伊伯利科学学院提供的启动资金支持。我们感谢宾夕法尼亚州立大学帕克校区蛋白质组学与质谱核心技术实验室的 Tatiana Laremore 博士提供的专业技术指导以及仪器设备的使用机会，质谱分析工作在该实验室完成。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
材料
0.01 mm 氧化锆/二氧化硅珠BioSpec Products110791012
乙酸EMDAX0073-9
丙酮EMDAX0116-6
乙腈EMDAX0142-6
碳酸氢铵Fluka Analytical09830
BioTrace NT 硝酸纤维素膜PALL Life Sciences66485
牛血清白蛋白（BSA）消化标准品ProteaPS-204-1
氯仿Acros Organics423550025
乙二胺四乙酸（EDTA）Fisher ScientificBP118
高效液相色谱级水EMDWX0008-1
溶菌酶Fisher ScientificBP535-1
甲醇Sigma-Aldrich34860
苯甲基磺酰氟（PMSF）Amresco0754
Pierce 胰蛋白酶Thermo Scientific90057
丽春红 SAcros Organics161470100
蛋白低吸附管 0.5 mLEppendorf022431064
碳酸氢钠Sigma-Aldrich792519
氯化钠Macron Fine Chemicals7581-06
三氟乙酸（TFA）Sigma-Aldrich299537
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（HCl）Fisher ScientificBP152
Triton X-114Sigma-Aldrich93422
胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）BD211822
α-氰基-4-羟基肉桂酸（质谱级）Sigma-AldrichC8982
名称公司目录编号备注
设备
MagNALyserRoche
Trans-Blot Turbo 转膜系统Bio-Rad
MALDI-TOF 靶板Bruker Daltonics
Ultraflextreme MALDI-TOF-TOFBruker Daltonics配备 355 nm 倍频 Nd:YAG smartbeam-II 激光器

参考文献

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