细菌脂蛋白的富集及N端脂肽的制备用于质谱法结构鉴定

摘要

本文描述了使用非离子型表面活性剂相分离方法富集细菌脂蛋白，可直接用于Toll样受体（TLR）检测或其他应用。此外，还详细介绍了制备N端胰蛋白酶消化脂肽的后续步骤，以通过质谱法进行结构表征。

摘要

脂蛋白是细菌细胞包膜的重要组成成分，也是哺乳动物先天免疫反应的强效激活剂。尽管脂蛋白在细胞生理学和免疫学中具有重要意义，但关于新型脂蛋白的形式、其合成机制以及不同形式对宿主免疫系统的影响，仍有许多未知之处。为了支持对脂蛋白的深入研究，本实验方案描述了一种用于富集细菌脂蛋白并制备其N端胰蛋白酶切脂肽的方法，以便通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行结构鉴定。该方法在已有Triton X-114相分离技术基础上进行了改进，用于从细菌细胞膜中提取和富集脂蛋白，并新增了去除非脂蛋白污染物的步骤，从而提高了脂蛋白的得率和纯度。由于脂蛋白常被用于Toll样受体（TLR）功能检测，因此首先通过MALDI-TOF MS对其N端结构进行表征至关重要。本文提供了一种方法，可分离出富含N端脂肽的浓缩疏水性肽段，适用于直接进行MALDI-TOF MS/MS分析。经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离的脂蛋白被转移至硝酸纤维素膜上，随后进行酶解 原位 用胰蛋白酶处理后，依次洗涤以去除极性胰蛋白酶肽段，最后用氯仿-甲醇洗脱。当与来自洗涤液的极性较强的胰蛋白酶肽段的质谱分析相结合时，该方法可在单次实验中实现脂蛋白的鉴定及其N末端的表征。有意形成钠加合物也可作为一种手段，以促进产生更具结构信息的碎片谱图。最终，对脂蛋白的富集及其N端结构的确定将有助于对这类广泛存在的细菌蛋白开展更深入的研究。

引言

细菌脂蛋白的特征是其N端含有一个保守的脂质修饰半胱氨酸，该结构将球状蛋白结构域锚定在细胞膜表面。脂蛋白在细菌中普遍存在，占典型基因组中所有细胞基因的2%至5%¹。脂蛋白在多种细胞过程中发挥关键作用，包括营养摄取、信号转导、蛋白质复合物的组装以及维持细胞包膜的结构完整性²。在致病性细菌中，脂蛋白可作为毒力因子^3,4。在感染过程中，Toll样受体（TLR）2对N端脂肽的识别会引发先天免疫反应，以清除入侵的病原体。根据N端酰化状态的不同，脂蛋白通常被不同的TLR2异源二聚体复合物识别：TLR2-TLR1识别N-酰化脂肽，而TLR2-TLR6则结合游离脂肽的α-氨基末端。一旦结合，信号通路将汇聚并诱导促炎性细胞因子的分泌^3,4。

过去认为，革兰氏阳性菌的脂蛋白为二酰化，而革兰氏阴性菌的脂蛋白为三酰化，其差异在于保守的N端半胱氨酸残基上是否存在酰胺键连接的脂肪酸。这一假设得到了基因组序列分析的支持：革兰氏阳性菌基因组中缺乏与革兰氏阴性菌N-酰基转移酶Lnt同源的序列，而Lnt负责形成三酰化脂蛋白⁵。然而，近期研究....

方案

1. 细胞生长与裂解

1. 将细菌在15 mL胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）或其他类似的丰富培养基中培养至对数生长后期（OD₆₀₀为1.0–1.5）。通过离心收集细胞，用Tris缓冲盐水/EDTA（TBSE）洗涤一次，然后继续进行后续操作或冻存备用。
   注意：TBSE成分为20 mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl），pH 8.0，130 mM氯化钠（NaCl）和5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）。脂蛋白的表达与修饰可能受培养条件（例如酸度、盐度、培养基种类）和生长阶段的影响¹⁵。细胞培养量可根据需要调整，但建议单次脂蛋白制备使用15 mL培养物，因为过多的生物量可能降低脂蛋白得率。一次15 mL培养物的制备通常可获得足够在标准SDS-PAGE小型凝胶上加载约2–4个泳道的最佳样品量。
2. 将细胞重悬于800 μL含1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）和0.5 mg/mL溶菌酶的TBSE中。将溶液转移至带螺帽和O型圈的2.0 mL螺口微量离心管中，在37 °C孵育20分钟。
   注意：某些菌种对溶菌酶不敏感。应选用合适的裂解酶以促进细胞裂解。
3. 向管中加入约800 μL 0.1 mm氧化锆/二氧化硅珠，使用均质器以最大速度（7,000 rpm）振荡5个循环，每个循环30秒，每次循环之间在冰上静置2分钟。
4. 在4 °C下以3000 × g离心5分钟（使珠子和....

结果

方案的示意图如下所示 图1富含脂蛋白的组分提取自 粪肠球菌 ATCC 19433 经 TX-114 处理的结果如图所示 图2作为对照，还展示了沉淀蛋白质组分的条带模式。MALDI-MS 验实该组分中的蛋白质为非脂蛋白的高丰度污染蛋白表1）。质谱图中的 图3 展示胰蛋白酶肽离子谱的 E. faecalis 脂蛋白PnrA，其在用极性逐渐增强的溶剂对硝酸纤维素结合的PnrA进行后续洗涤时出现（峰归属列于 表 2). 图4 显示 N通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS/MS）对PnrA进行的末端结构表征，揭示了具有诊断意义的特征 N-脱酰基脱氢丙氨酰峰，与溶菌型脂蛋白形式一致。 .......

讨论

本方案描述了脂蛋白表征的两个不同阶段：通过TX-114相分离法富集脂蛋白，以及通过MALDI-TOF质谱进行结构鉴定。在TX-114提取过程中，额外的离心步骤可去除在此过程中沉淀的污染蛋白，随后通过丙酮沉淀获得高度富集的脂蛋白。通过将每次制备的样品量限制在相当于15 mL细胞的规模，可同时平行处理多个样品，并在方案结束时根据需要进行合并。

用于质谱法进行结构分析时，将脂蛋白转移至硝酸纤维素膜上有助于胰蛋白酶消化、洗涤以及后续从膜上洗脱。据我们经验，该方法优于通过去垢剂从传统的聚丙烯酰胺凝胶块中提取脂蛋白的方法，因为脂蛋白结合在硝酸纤维素膜表面，而非嵌入聚丙烯酰胺凝胶内部。脂蛋白与硝酸纤维素膜表面的结合也大大避免了疏水性肽段非特异性吸附到容器表面的常见问题。通过逐步洗脱硝酸纤维素膜片段，可分离出更多亲水性的内部胰蛋白酶消化肽段，这些肽段可通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行分析，从而实现高置信度的蛋白质鉴定；而最后的洗脱步骤则可重复性地获得浓缩的脂肽，洗脱体积小，且基本不含干扰性盐类及抑制离子化的污染物。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
0.01 mm 氧化锆/二氧化硅珠	BioSpec Products	110791012
乙酸	EMD	AX0073-9
丙酮	EMD	AX0116-6
乙腈	EMD	AX0142-6
碳酸氢铵	Fluka Analytical	09830
BioTrace NT 硝酸纤维素膜	PALL Life Sciences	66485
牛血清白蛋白（BSA）消化标准品	Protea	PS-204-1
氯仿	Acros Organics	423550025
乙二胺四乙酸（EDTA）	Fisher Scientific	BP118
高效液相色谱级水	EMD	WX0008-1
溶菌酶	Fisher Scientific	BP535-1
甲醇	Sigma-Aldrich	34860
苯甲基磺酰氟（PMSF）	Amresco	0754
Pierce 胰蛋白酶	Thermo Scientific	90057
丽春红 S	Acros Organics	161470100
蛋白低吸附管 0.5 mL	Eppendorf	022431064
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	792519
氯化钠	Macron Fine Chemicals	7581-06
三氟乙酸（TFA）	Sigma-Aldrich	299537
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（HCl）	Fisher Scientific	BP152
Triton X-114	Sigma-Aldrich	93422
胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）	BD	211822
α-氰基-4-羟基肉桂酸（质谱级）	Sigma-Aldrich	C8982
名称	公司	目录编号	备注
设备
MagNALyser	Roche
Trans-Blot Turbo 转膜系统	Bio-Rad
MALDI-TOF 靶板	Bruker Daltonics
Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF	Bruker Daltonics		配备 355 nm 倍频 Nd:YAG smartbeam-II 激光器