成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR 相关蛋白 9（CRISPR/Cas9）系统为基因工程提供了有力工具，并实现了外源基因的靶向整合。本文描述了一种基于同源介导的末端连接（HMEJ）的高效DNA靶向整合策略 体内 以及利用CRISPR/Cas9的靶向基因治疗。
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摘要
摘要
作为一种有前景的基因组编辑平台，CRISPR/Cas9 系统在高效遗传操作方面具有巨大潜力，尤其适用于外源基因的靶向整合。然而，由于同源重组（HR）效率较低，以及在非分裂细胞中基于非同源末端连接（NHEJ）策略会产生多种插入缺失突变， 体内 基因组编辑仍然是一项巨大的挑战。在此，我们描述了一种基于同源介导的末端连接（HMEJ）的CRISPR/Cas9系统，用于高效 体内 精确的靶向整合。在该系统中，靶向基因组和包含同源臂（约800 bp）的供体载体在单导向RNA（sgRNA）靶序列的两侧被CRISPR/Cas9切割。这种基于HMEJ的策略可在小鼠受精卵以及肝细胞中实现高效的转基因整合 体内此外，基于HMEJ的策略为富马酰乙酰乙酸水解酶（fumarylacetoacetate hydrolase,法）突变对肝细胞的影响并实现挽救 Fah由缺陷诱导的肝衰竭小鼠。综上所述，该基于HMEJ的策略通过靶向整合，为多种应用提供了有前景的工具，包括基因修饰动物模型的构建和靶向基因治疗。
引言
精确的靶向基因组编辑在构建基因修饰动物模型和临床治疗中常常是必需的。为了实现高效的靶向基因组编辑，人们已开发出多种策略，如锌指核酸酶（ZFN）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）以及CRISPR/Cas9系统。这些策略可在基因组中产生特异性的DNA双链断裂（DSB），并利用细胞内在的DNA修复机制，如同源重组（HR）1,2微同源介导的末端连接（MMEJ）3,4,5，以及非同源末端连接（NHEJ）6,7,8 诱导外源基因的靶向整合1,9基于同源重组（HR）的策略是目前最常用的基因组编辑方法，在细胞系中效率很高，但由于其仅在S期晚期/G2期发生，因此难以应用于非分裂细胞。因此，基于同源重组的策略不适用于 体内 基因组编辑。最近，基于NHEJ的策略被开发用于在小鼠组织中实现高效的基因敲入
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方案
所有涉及动物实验的操作均已获得中国科学院上海生命科学研究院生物医学研究伦理委员会的批准。
1. 供体质粒的设计
- sgRNA 的选择
- 使用在线 CRISPR 设计工具预测目标区域的 sgRNA11,12,13,14,15。针对 Cdx2 基因座，在终止密码子附近设计六个不同的 sgRNA（Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6），优先选择评分较高且潜在脱靶效应较低的序列（图 1A）16。
- 用 BbsI 酶切 2 µg 的 Cas9-CMV-EGFP 表达载体和 sgRNA 载体（20 µL 体系中加入 1 µL BbsI，37 °C 反应 2 h，终浓度为 1 U/µL）。然后使用凝胶纯化试剂盒在 1% 琼脂糖凝胶（1× TAE 缓冲液）中纯化产物。
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结果
基于HMEJ的基因组编辑在小鼠胚胎中的应用：为了确定基于HMEJ方法在小鼠受精卵中的敲入效率，我们将Cas9 mRNA、靶向Cdx2基因的sgRNA以及HMEJ供体递送至小鼠受精卵中，该供体设计用于将p2A-mCherry报告基因融合至Cdx2基因的最后一个密码子（图2A）。注射后的受精卵在体外培养中发育为囊胚。为评估敲入效率，我们使用荧光显微镜检测mCherry荧光信号，发现接受HMEJ供体的囊胚中有12.9%呈mCherry阳性，且mCherry严格表达于滋养外胚层（图2B，2C）。通过对PCR阳性样本进行测序，我们还发现所有检测到的整合事件在5'和3'连接处均为精确的同框整合（图2D）。
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讨论
构建HMEJ供体质粒最关键的步骤是：（1）选择具有高DNA切割效率且sgRNA切割位点与终止密码子距离较短的sgRNA，以及（2）正确构建HMEJ供体质粒。在转基因供体载体（包含sgRNA靶位点和约800 bp同源臂）和靶基因组上均需实现CRISPR/Cas9介导的切割，以实现体内高效且精确的靶向整合。in vivo。采用基于HMEJ的方法制备基因敲入小鼠最关键的步骤是：（1）制备高质量的Cas9 mRNA和sgRNA（Cas9 mRNA和sgRNA无降解），以及（2）制备高质量的HMEJ供体质粒。该质粒对胚胎发育无毒性作用。
最近，已有报道基于NHEJ的方法可实现高效的体内基因组编辑8。然而，如先前研究所述8，通常在连接处会诱导产生多种类型的插入缺失突变（indel突变），从而难以实现精确整合。本文上述基于HMEJ的策略则表现出高度精确的靶向整合，且几乎不产生插入缺失突变。因此，基于HMEJ的策略可成为将突变序列（如点突变）替换为正确序列的理想平台，.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到中国科学院战略性先导科技专项（XDB02050007，XDA01010409）和国家高技术研究发展计划&国家高技术研究发展计划（863 计划；2015AA020307）、国家自然科学基金（NSFC 资助号 31522037、31500825、31571509、31522038）、中国青年千人计划（HY 收取）、中国科学院重点突破项目、上海市科学技术委员会项目（16JC1420202 至 HY）、中华人民共和国科学技术部（MOST；2016YFA0100500）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| pX330 | Addgene | 42230 | |
| pAAV 载体 | Addgene | 37083 | |
| pX260 | Addgene | 42229 | |
| AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40 | Addgene | 97307 | 由EFs启动子驱动的编码人源密码子优化SpCas9的AAV载体 |
| AAV_Actb HMEJ 供体质粒_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA | Addgene | 97308 | 用于将 p2A-mCherry 报告基因融合至小鼠 Actb 基因的 HMEJ 供体质粒。该质粒包含由 EF1a 启动子驱动的 EGFP 以及由 U6 启动子驱动的靶向 Actb 的 sgRNA。AAV 载体骨架。 |
| AAV_Cdx2 HMEJ 供体质粒 | Addgene | 97319 | 用于将 p2A-mCherry 报告基因融合至小鼠 Cdx2 的 HMEJ 供体质粒。 |
| Lipofectamine 3000 转染试剂 | Life Technology | L3000015 | |
| 无核酸酶水 | Life Technologies | AM9930 | |
| Bbs I | New England Biolabs | R0539S | |
| NEB缓冲液2 | New England Biolabs | B7002S | |
| T7 内切酶 I | New England Biolabs | M0302L | |
| NEBuilder HiFi DNA 组装预混液 | New England Biolabs | E2621L | |
| 质粒EndoFree-Midi试剂盒 | Qiagen | 12143 | |
| MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA | Life Technologies | AM1345 | |
| MEGACLEAR 试剂盒 20 次反应 | Life Technologies | AM1908 | |
| MEGASHORTSCRIPT T7 试剂盒 25 次反应 | Life Technologies | AM1354 | |
| 弗拉明/布朗微量移液器拉制仪 | Sutter Instrument | P-97 | 微量移液器拉制仪（参数：加热，74；拉力，60；速度，80；时间/延迟，200；压力，300） |
| 硼硅酸盐玻璃 | Sutter Instrument | B100-78-10 | 毛细管类型（外径 1.0 mm，内径 0.78 mm，带纤维丝） |
| FemtoJet 微注射仪 | Eppendorf | ||
| 冷冻切片机 | Leica | CM1950-冷冻切片机 | 厚度 的 40 μm 用于 脑 10 μm 用于 肝脏 |
| 兔抗mCherry | GeneTex | ||
| Cy3-AffiniPure 山羊抗兔 IgG | 杰克逊免疫研究实验室 | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Gibco | 10099141 | |
| 非必需氨基酸 | Gibco | 11140050 | |
| 青霉素, 链霉素, 谷氨酰胺 | Gibco | 10378016 | |
| 凝胶回收试剂盒 | Omega | D2500-02 | |
| FACS | BD AriaII | ||
| PMSG | 宁波三生药业 | S141004 | |
| HCG | 宁波三生医药 | B141002 | |
| 细胞松弛素B | Sigma | 货号 C6762 | |
| 含D-葡萄糖和酚红的KSOM+AA | Millipore | CAT#MR-106-D | |
| 含酚红的M2培养基 | Millipore | 货号：MR-015-D | |
| 矿物油 | Sigma |
参考文献
- Yang, H., et al. Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells usin....
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy
Posted by JoVE Editors on 3/10/2021. Citeable Link.
An erratum was issued for: Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells. The phrases "surveyor assay" and "Surveyor Nuclease" have been updated to "T7E1 assay" to " T7 endonuclease I" respectively.
Step 1.2 in the Protocol has been updated from:
- Surveyor nuclease assay of sgRNA
NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by surveyor nuclease assay (also known as T7 endonuclease I (T7EI) assay)17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.
to:
- T7 endonuclease assay of sgRNA
NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by T7 endonuclease (T7EI) assay17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.
Figure 1 in the Representative Results has been updated from:
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro.
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for surveyor assay. (C) Surveyor assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for surveyor assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro.
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for T7EI assay. (C) T7EI assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for T7EI assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10. Please click here to view a larger version of this figure.
