本文展示了一种标准化急性心肌梗死猪模型采样流程的实验方案，旨在提高该模型在理解心肌缺血/再灌注损伤病理生理机制方面的转化价值，并用于测试新型候选药物。
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摘要
摘要
心肌缺血再灌注（I/R）损伤几乎占心肌梗死后坏死区域的一半。迄今为止，尚无获批药物可用于预防或减轻心肌I/R损伤。研究并深入理解心肌I/R损伤的病理生理机制，对于开发有效的治疗方法至关重要。大型动物实验是转化医学研究中的重要环节。急性心肌梗死的猪模型已被我们及其他研究者建立并详细描述。本研究旨在通过重点关注适用于未来实验的取样技术，进一步提升该模型的应用价值。此外，我们强调了一些看似微小但可能影响最终结果质量的关键步骤。为模拟临床中心肌I/R损伤的情况，将经皮冠状动脉介入治疗（PCI）导管插入麻醉猪的左前降支冠状动脉（LAD）。°°°该模型可模拟人类急性心肌梗死及其PCI治疗过程，并能够准确定位风险区域以及坏死组织和存活的缺血组织。本研究利用该模型探讨了一种环状肽类FXIIa抑制剂的作用效果。该模型亦可进行调整，以延长再灌注时间，用于研究心肌梗死后更晚期的病理变化。
引言
缺血性心脏病，尤其是急性心肌梗死（MI），是发达国家死亡的主要原因1。目前，急性心肌梗死的标准治疗方法是经皮冠状动脉介入治疗（PCI），即球囊导管治疗。影响PCI治疗后患者生活质量和预后的关键因素之一是梗死面积。减小梗死面积可显著改善患者的生存率和预后2。心肌缺血/再灌注（I/R）损伤对梗死面积具有显著影响，因此心血管研究的主要目标之一是预防或减轻心肌I/R损伤3。I/R损伤的确切机制仍在研究之中4。血浆级联反应和内皮细胞的激活是I/R损伤的标志性特征5，其中凝血系统的激活起着明确作用6,7。最近，在脑I/R损伤的FXII基因敲除大鼠模型中已证实，FXII作为凝血级联接触相激活的早期上游肽段发挥了作用8。在猪模型中验证这些结果是实现临床转化的重要一步。因此，我们正在一项初步研究中测试一种新型双环（80 kDa蛋白酶）FXIIa抑制剂在心肌I/R损伤中的作用。
动物模型能够模拟急性心肌梗死（MI）及经皮冠状动脉介入治疗（PCI）的临床情况，对于深入理解心肌缺血/再灌注（I/R）损伤的病理生理机制以及测试新型治疗方案至关重要。猪是研究临床心肌I/R损伤的理想动物模型，不仅因为其心脏在解剖结构和冠状动脉循环方面与人类心脏非常相似，而且在心肌缺血与再灌注过程中表现出与人类相近的病理生理反应9,10。而其他模型如大鼠和小鼠则不符合这些标准，与人类心脏相比存在显著差异11,12；例如，犬类的冠状动脉侧支血管数量远多于人类13。
猪急性心肌梗死模型已广泛应用于心血管研究，以探讨缺血性心脏病，包括心肌缺血/再灌注（I/R）损伤14,15,16,17。后者是一种炎性状态，因此，尽量减少与开胸手术中使用的胸骨切开术或开胸术相关的炎症反应至关重要。采用临床C型臂血管造影设备的闭胸模型可克服这一问题。此外，本研究最关键的要点之一是，我们的方案能够准确区分左心室的缺血区域（风险区域，AAR）与非缺血区域（非风险区域，ANR），从而可精确测定梗死面积（坏死性缺血组织，NIT）。本文旨在明确定义一种可重复的猪心肌I/R损伤模型方法学，特别是关于心肌组织取样的操作流程，以实现对I/R损伤分子机制的更精确分析，并更清晰地评估新型药物治疗的效果。
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方案
1. 动物：
所有动物均按照瑞士国家法律的指导原则进行处理。本研究已获得伯尔尼州当地动物实验委员会的批准（许可编号：BE 25/16）。
选用两种性别的大型白色猪（约30 ± 5 kg）。将动物随机分为两组，一组接受双环（80 kDa蛋白酶）FXIIa抑制剂或所选治疗，另一组接受无活性对照处理。
2. 手术步骤（图1）
- 麻醉与动物准备：
- 实验开始前将动物禁食12小时。
- 使用10 mL注射器，通过颈后部肌肉注射给予动物20 mg/kg的氯胺酮和2 mg/kg的赛拉嗪进行术前给药。记录动物体重和性别。
- 通过耳缘静脉注射0.5 mg/kg 咪达唑仑和0.05 mg/kg 阿托品以诱导麻醉。使用气管插管对动物进行插管。
- 使用呼吸机（O2/空气 1:3，七氟烷 1.5%，7-8 mm 气道导管和过滤器。调节吸入氧浓度（FiO₂）2将氧浓度调整至35%，潮气量调整至6-10 mL/kg。
- 麻醉深度 通过捏鼻后无运动或自主神经反应来判断麻醉效果是否充分。持续监测眼睑反射和下颌张力，以达到下颌松弛且无眼睑反射为目标。 核心体温持续监测，并通过被动加温（隔离毯和暖瓶）确保维持正常体温（38-38.5 °C）。
- 按照 Koudstaal 及其同事先前描述的步骤 3-1 至 3-3 进行游离解剖18双侧颈动脉插管，使用7F鞘管。左颈静脉插管，使用7F鞘管用于静脉采血。
- 通过中心静脉导管推注250 µg芬太尼镇痛药，随后使用输液泵以250 µg/h的速度持续静脉输注。在整个实验过程中，通过三导联心电图（ECG）监测体温、心率和心律，以及动脉压和中心静脉压。
- 使用标准采血管，从静脉通路中采集以下基础血样：将5 mL血液注入枸橼酸钠抗凝管，2.9 mL血液注入EDTA抗凝管。立即在4 °C条件下以2,000 × g离心15分钟。另取2.9 mL血液注入血清管，室温静置30分钟使其充分凝固，随后按上述条件离心。
- 将200 µL血浆或血清分装至500 µL离心管中，所有样品于-80 °C保存，以备后续分析。
- 使用专用血气分析（BGA）注射器从动脉导管中抽取0.5 mL血液，按照制造商说明书操作BGA仪器进行血气分析。
- 使用标准的2 mL注射器从静脉管路中抽取0.5 mL血液，并立即通过30 G针头将其转移至ACT检测杯中。将装有血液的检测杯插入ACT仪，按照制造商说明书测定凝血时间。参见 图2 时间点。
- 使用2 mL注射器将5000 IU未分馏肝素注入静脉管路，随后让动物稳定20分钟，再开始心肌梗死实验。
- 每30-45分钟监测一次ACT，具体操作见2.11。若ACT小于180秒，则静脉注射2500 IU普通肝素。 < 180 秒。
- 心肌梗死实验
- 使用标准C臂X线透视设备（冠状动脉造影程序，角度0°，每秒12帧，约70 kV）或专用的血管造影系统进行冠状动脉介入操作。
- 在X线透视引导下，经左侧颈动脉预先置入的鞘管插入压力导管（5F，120 cm），将其推进至左心室。将压力导管连接至数据采集系统，以记录左心室压力。采集系统需在整个实验过程中持续计算并记录心率、收缩压、左心室最大dP/dt（左心室收缩力）和最小dP/dt（左心室舒张功能）。记录10分钟的基础值。
- 通过先前置入的鞘管，将6F（100 cm，EB3.75）导引导管插入右侧颈动脉。在X线引导下将其送至左冠状动脉，到达左前降支冠状动脉（LAD）。经导引导管使用20 mL注射器注入造影剂，行基线冠状动脉造影。
注意：造影剂注射采用手动加压方式，但也可使用专用的高压注射器系统。 - 根据X线监视器上显示的前降支（LAD）大小，选择合适尺寸的经皮冠状动脉介入治疗（PCI）导管。根据前降支的大小，选用长度为15–25 mm、直径为2–3.5 mm的PCI球囊。组装PCI导管与冠状动脉导引导丝（F 014/J，175 cm）。将PCI导管连接至预先充满造影剂的球囊扩张压力泵。
注意：可根据校准后的显示器上使用标尺直接测量左前降支（LAD）直径，并据此选择合适尺寸的经皮冠状动脉介入（PCI）球囊。 - 将2.2.4中组装好的系统插入引导导管的管腔内。推进导丝进入前降支，直至其超过前降支的第二对角支。
- 在X线透视引导下推进PCI导管，直至其到达前降支（LAD）中段附近。根据冠状动脉解剖结构选择LAD阻断部位，通常位于第二对角支之后，有时位于第一对角支之后。图3以获得左心室（LV）相近的心肌缺血面积百分比。
注意：阻断位点的选择取决于对角支的长度，进而取决于由相应分支供血的组织区域。若第一对角支较长且呈分叉状，则阻断位点位于该分支之后；若第一对角支较短，则在第二对角支之后进行阻断。 - 移除导丝，然后将扩张装置的压力增加至7-10 bar，使经皮冠状动脉介入（PCI）导管的球囊充气，诱导心肌缺血持续1小时。逐步增加吸入氧浓度（FiO₂）。2 在缺血15至40分钟期间，将血氧饱和度维持在50%至60%之间。潮气量保持在6-10 mL/kg。
注意：该操作将减少期外收缩的发生，并降低心室纤维性颤动的频率。 - 通过引导导管注入造影剂，记录5-10秒的视频序列，以获取经皮冠状动脉介入（PCI）导管球囊就位后即刻的血管造影图像，此时缺血刚被诱发；在缺血10分钟后重复该操作，以确认PCI导管球囊远端左前降支（LAD）完全闭塞。
- 密切监测动物，以便立即发现并治疗（2.2.10）心律失常。期前收缩通常会出现且发生频率增加（>在心肌缺血诱导后20至40分钟内，若心率降至每分钟3次以下，应轻柔按摩双侧下颌下方的颈部区域。大多数情况下，此操作足以恢复规律的心跳，可能是通过刺激颈总动脉上的迷走神经压力感受器所致。
- 如果心律失常进展为心室颤动，应使用体外双相除颤器恢复窦性心律。在电击前，立即使用除颤器电极片进行5-10次胸部按压，以使冠状动脉充盈含氧血液，随后对30 kg动物以150 J能量进行电击。
- 必要时重复操作，并在第3次后将能量增加至175 Jrd 休克。对于较重的动物，使用较高的能量设置。
- 缺血时间结束前5分钟，重复2.1.8–2.1.13中所述的采血步骤。通过中心静脉导管静脉注射待测物质（环状FXIIa抑制剂或对照剂，4 mg/kg，盲法操作），随后用20 mL生理盐水冲洗管路。
- 在2.2.12步骤注射物质后4分钟，采集一份血浆枸橼酸盐样本（如2.1.8和2.1.9所述）。
- 进行血管造影（2.2.3）以确认前降支（LAD）闭塞，随后放空经皮冠状动脉介入（PCI）导管的球囊并将其从前导管中撤出。在放空并撤出PCI导管球囊后立即通过血管造影确认闭塞部位远端前降支的灌注情况，之后10分钟再次确认，每当心电图显示心肌缺血征象持续超过5分钟时进行确认，并在前降支再次闭塞前立即确认。
- 使缺血心肌再灌注2小时。在再灌注开始后10、30、60和115分钟时采集血浆和血清样本（2.1.8和2.1.9）。在60和115分钟时监测血气分析（BGA）（2.1.10）。
- 将PCI导管与导丝一同重新插入，置于与缺血操作时完全相同的位置。再次扩张PCI导管的球囊，并通过血管造影确认前降支（LAD）闭塞（2.2.3）。从左心室撤出压力导管并停止记录。
- 经中心静脉导管注入100 mL含2%伊文思蓝的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）。约30秒后，当整个动物体呈蓝色时，注入40 mL 20% KCl以实施安乐死。 通过心电图信号和脉搏波的消失确认死亡。
3. 取样技术
- 心脏的提取、解剖与取样（图4）
- 进行胸骨切开术以暴露心脏。遵循Koudstaal及其同事先前描述的步骤8-2和8-318。切开心包膜并检查是否存在异常，这些异常可能源于先前的心包炎，并将存在异常的动物排除在进一步评估之外。
- 放气并移除PCI以及引导导管。切除心脏以进行进一步分析。剪断下腔静脉，并使用吸泵清除血液，然后切断所有连接心脏与身体的大血管。
- 用室温生理盐水冲洗心脏内外表面。称量完整心脏的重量。
- 在30–40分钟内，使用锋利的刀具从心尖至二尖瓣的Chordae tendinae，沿垂直于长轴的方向将心脏切成约3–5 mm厚的切片。
- 务必始终将心脏以腹侧朝上的相同方向放置，以保持切片样本的方向一致性（图5）。
- 使用数码单反相机拍摄心脏切片的照片。
- 切除右心室（无需保留，予以弃去）。拍摄左心室切片的照片，并称量所有左心室切片以获得左心室总重量。
- 在所有切片中区分伊文思蓝染色阳性与阴性组织。使用解剖刀将切片分离，以区分缺血组织（伊文思蓝阴性）与非缺血组织（伊文思蓝阳性）。
- 首先分析伊文思蓝阴性部分（即风险区域内的缺血区，AAR）。称量所有该部分组织，并将其全部放入一个塑料容器中。
- 用100–150 mL（根据心脏大小调整）氯化三苯基四氮唑溶液（2 g TTC，16 g 葡聚糖，分子量48000–90000，溶于200 mL PBS中，现配）完全覆盖切片，确保心脏组织可在溶液中自由移动。盖上容器，在37 °C条件下轻轻振荡孵育20分钟。
- 在上述20分钟孵育期间，称量伊文思蓝阳性组织（非风险区域，ANR），取样用于Tissue-Tek包埋（选择距离损伤最远的部分），并在-80 °C下保存以供后续分析。将剩余组织转移至4%甲醛溶液中，室温保存用于组织学切片制备。
- 将AAR组织块从TTC溶液中取出。被染成红色的组织为存活的缺血组织（VIT），未染色的组织为坏死的缺血组织（NIT）。分别从NIT和VIT中各切取两小块（2–3 mm大小的组织块），包埋于Tissue-Tek中，并在-80 °C下保存以供进一步分析。这些样本应具有相同的重量。
- 将剩余的组织块（所有来自AAR的切片）固定：将其平铺于泡沫塑料容器中，完全覆盖4%甲醛溶液，在通风橱中室温固定24小时。组织块应保持平整，以便下一步进行摄影记录。
- 次日，使用高分辨率相机对每块组织的两面进行拍照，保持相同的变焦设置和拍摄距离（即相同的放大倍数）。为所有图片自动添加比例尺。所有比例尺的长度必须一致。
注：高分辨率相机应连接至可自动为每张照片添加比例尺的软件。
- 风险区域（AAR）与梗死面积的计算
- 左心室中AAR的百分比 =（AAR重量（g）/ 左心室重量（g））× 100。
- 使用ImageJ软件，基于照片计算AAR和NIT的总表面积（包括每块组织的两面）。
- 通过角度工具中的直线功能选中比例尺长度，然后从菜单中选择 Analyze > Set Scale，输入已知的距离和单位。选择 "global" 选项，使相同的比例尺应用于所有图片。
- 使用自由手选工具标记整个组织表面以计算AAR。注意不要包含组织侧面（高度）和/或脂肪组织（图6-C）。
- 在 Analyze "area" 和 "display label"。通过 Analyze > Set Measurements 菜单设置测量参数，然后从 Analyze > Measure 中测量表面积。
- 重复步骤3.2.5以测量NIT（仅标记未染色的组织）。注意：在计算NIT时不要包含脂肪组织（图6-D）。在组织的另一面重复此步骤。
- 计算每块组织AAR和NIT的平均值。
- 利用3.2.7中获得的数值，计算NIT占AAR的百分比：%NIT of AAR =（Σ NIT平均表面积（cm2）/ Σ AAR平均表面积（cm2））× 100。
- 应由两位不同的研究人员独立重复上述方法。可接受的差异范围为 < 10%。
- 缺血标志物检测
- 使用先前在-80 °C下保存的EDTA血浆样本（2.1.9），采用单重Luminex类检测法测定心肌肌钙蛋白I水平，方法如前所述19。
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结果
一只动物因技术错误（在给予FXIIa抑制剂或对照肽之前，缺血期间出现血压突然下降）而提前死亡。一只动物被排除在FXIIa抑制剂组之外，原因是其左前降支动脉（LAD）解剖结构异常，未观察到缺血/再灌注损伤。该动物的左心室大部分区域（包括心尖）由回旋支动脉供血。最终纳入分析的动物数量为：双环FXIIa肽抑制剂组n = 2（平均体重27.5 ± 2.5 kg），接受无活性双环对照肽的组n = 3（平均体重29 ± 0.8 kg）。
通过猪心脏的X射线视频成像/冠状动脉造影来观察压力导管的位置，并确定在左前降支（LAD）的哪个位置进行阻断（图3A）。图3B 显示导管位置，阻断第二对角支远端的血流。比较 图3A 与 图3B 还可估算出LAD供血心肌中将...
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讨论
心肌缺血/再灌注（I/R）损伤对最终梗死面积具有显著影响，这直接关系到急性心肌梗死患者预后3。了解心肌I/R损伤的病理生理机制是减少或预防该损伤的第一步。心肌I/R损伤是一种急性状态，发生在阻塞血管再灌注后即刻。I/R损伤可激活固有免疫反应，并在再灌注部位及周围组织引起细胞损伤20。最近一项研究显示，在脑I/R损伤的大鼠模型中，使用FXIIa抑制剂可改善神经功能预后8。然而，在本项初步研究中，我们未发现双环FXIIa抑制剂对心肌I/R损伤产生作用。所用的FXIIa抑制剂为新型药物，其在猪体内的药代动力学尚不明确。因此，观察到的无效结果可能是由于给药剂量或给药方式不当所致。这需要在后续研究中进一步探讨。
建立标准化的动物模型对于深入研究心肌缺血/再灌注（I/R）损伤的病理生理机制，并将合适的治疗方案转化为临床应用至关重要。要研究心肌I/R损伤的病理生理机制，必须获取良好且具有代表性的样本，以便深入探讨其潜在的细胞机制。猪的闭胸式心肌I/R损伤...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者谨此感谢 Christian Heinis 教授提供 FXIIa 抑制剂及其相应的对照物。我们还衷心感谢伯尔尼大学生物医学研究系实验外科部门的 Olgica Beslac、Daniel Mettler 博士和 Kay Nettelbeck 在技术方面提供的支持。伯尔尼大学医院（Inselspital）诊断、介入与儿科放射科的 Celine Guillod 和 Matthias Rausch 在 X 射线设备与技术方面提供了协助。本项目由瑞士国家科学基金会资助，项目编号 320030_156193。 我们还要感谢伯尔尼大学医院（Inselspital）传播与市场部的 Reto Haenni 先生为我们实验的视频录制工作提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ABL 90 Flex，血气分析仪 | Radiometer | - | 血气分析（BGA） |
| ACT Plus | Medtronic | - | 活化凝血时间 |
| 阿托品 | Sintetica | - | 硫酸阿托品，0.5 mg/ml |
| 电子秤（20-500 kg） | NAGATA Scale，中国台湾 | HTB/HTR | 可使用替代产品 |
| 电子秤（21-4200 g） | Mettler Toledo，瑞士 | MS4002SDR | 可使用替代产品 |
| 采血管：EDTA、枸橼酸盐和血清管 | S-Monovette，Nümbrecht，德国 | 05.1167.001, 05.1071.001 和 05.1557.001 分别对应 | 可使用替代产品 |
| BV Pulsera 移动C型臂 | Philips | - | 可使用替代产品 |
| 离心机 | Labcare，英国 | ALC PK120R | 可使用替代产品 |
| 除颤仪 Lifepak 12 | Medtronic | - | 可使用替代产品 |
| 右旋糖酐（来源于 Leuconostoc mesenteroides） | Sigma-Aldrich，德国 | D3759 | 平均分子量 48000-90000 |
| 数码单反相机 | Sony，泰国 | DSLR-A500/A550 | 可使用替代产品 |
| 解剖镊 | 可使用替代产品 | ||
| EMPIRA RX PCI 扩张导管 | Cordis，Johnson&Johnson，美国 | 85R15300S | 直径 3 mm，长度 15 mm，可使用替代产品 |
| EMPIRA RX PCI 扩张导管 | Cordis，Johnson&Johnson，美国 | 85R15350S | 直径 3.5 mm，长度 15 mm，可使用替代产品 |
| 伊文思蓝 | Sigma-Aldrich，德国 | E2129 | 有毒 |
| Fabius GS premium 呼吸机 | Dräger，Lübeck，德国 | - | 麻醉工作站，可使用替代产品 |
| 芬太尼 | Inselspital ISPI | - | 芬太尼 2500 mcg/50 ml |
| 甲醛 | 伯尔尼大学病理研究所 | SI148701 | 可使用替代产品 |
| FXIIa 抑制剂 | 由洛桑联邦理工学院 Christian Heinis 教授实验室提供 | 新型双环肽 | |
| Galeo 冠状动脉导引导丝 | Biotronik，德国 | 125497 | 可使用替代产品 |
| 导引导管 | Boston Scientific，佛罗里达，美国 | 34356-06 | 6F（100 cm，EB3.75），可使用替代产品 |
| 肝素钠 | Drossapharm，巴塞尔，瑞士 | - | Liquemin，25000 U.I./5 ml |
| 高端电外科设备 | BOWA，德国 | ARC 400 | 用于血液吸引的电源，可使用替代产品 |
| Hydro-Guardmini 呼吸过滤器 | Intersurgical，立陶宛 | 1745000 | 过滤器 |
| Image J | 美国国立卫生研究院，美国 | 1.47v | 可使用替代产品 |
| 充盈装置 Atrion QL2530 | Atrion 医疗产品，阿拉巴马，美国 | 96402 | 可使用替代产品 |
| IntelliVue MP 70 | Philips，博宾根，德国 | - | 监护仪（心电图、心率、血压和体温），可使用替代产品 |
| KCl | Sintetica SA | - | 氯化钾 15% |
| 氯胺酮 | Vetoquinol | - | Narketan，1 ml/100 mg |
| LR-ACT | Medtronic | 402-01 | ACT 专用注射器 |
| 咪达唑仑 | Roche | - | Dormicum，5 mg/ml |
| 单极电刀 | 可使用替代产品 | ||
| 持针器 | 可使用替代产品 | ||
| 高分辨率相机，PathStand 大体标本成像支架 | Spotimaging，美国 | 1080 p 高清分辨率，可使用替代产品 | |
| PBS | 本单位自制 | - | 可使用替代产品 |
| 外周静脉套管针，18 G | 可使用替代产品 | ||
| PowerLab 4/35 数据采集系统 | Adinstruments，Spechbach，德国 | - | |
| Rotamax120T | Heidolph，德国 | 544-41200-00 | 摇床，可使用替代产品 |
| Rüschelit-Super Safety Clear Tube | Teleflex，都柏林，爱尔兰 | 112480 | 气道导管，可使用替代产品 |
| Safe Pico 吸引注射器 | Radiometer | 956-622 | BGA 专用注射器 |
| 生理盐水 | Sintetica Bioren | - | NaCl 0.9%，可使用替代产品 |
| 七氟烷 1.5% | AbbVie AG | - | 七氟烷 250 ml 100% |
| 鞘管 | Cordis，Johnson&Johnson，美国 | 504-607 A | AVANTI + / 7 F，可使用替代产品 |
| Space 输液泵 | B.Braun Medical AG，德国 | - | 用于输注芬太尼，可使用替代产品 |
| SPR-350（Millar 导管） | Adinstruments，德克萨斯，美国 | 840-8166 | MIKRO-TIP，5F，120 cm |
| 胸骨锯 | 可使用替代产品 | ||
| 缝合线 | ETHICON，Johnson&Johnson，美国 | Y3110H | Monocryl 3-0 SH-1 Plus，可使用替代产品 |
| 注射器（20、10 和 5 mL） | CODAN，Baar，瑞士 | 62.7602, 62.6616, 62.5607 分别对应 | 用于肌肉注射或直接注入中心静脉通路注射麻醉药物，也可用于注射肝素、FXIIa 或相应对照。可使用替代产品 |
| 胸廓牵开器 | 可使用替代产品 | ||
| Tissue-tek | SAKURA，荷兰 | 4583 | O.C.T. 包埋剂 |
| 血管钳 | 可使用替代产品 | ||
| Xenetix 300 造影剂 | Guerbet，Zürich，瑞士 | - | 碘帕醇，300 mg 碘/ml |
| 赛拉嗪 | Vetoquinol | - | Xylapan，20 mg/1 mL |
| 2,3,5-三苯基氯化四氮唑 | Sigma-Aldrich，奥地利 | T8877 | |
| 500 μL 离心管（Eppendorf） | Trefflab，瑞士 | 96.08185.9.03 | 可使用替代产品 |
参考文献
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