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利用定量点印迹分析法（QDB）高通量绝对测定组织水平特定蛋白质含量

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DOI：

10.3791/56885

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2018年8月21日

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1Medicine and Pharmacy Research Center, Binzhou Medical University, 2Yantai Zestern Biotechnique Co. LTD, 3Precision Medicine research center, Binzhou Medical University, 4Department of Chemistry - BMC, Uppsala University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文通过测定三种不同小鼠组织中靶向蛋白——帽状肌动蛋白蛋白、类凝溶胶蛋白（CAPG）的绝对含量，展示了定量点印迹分析（QDB）的详细操作流程。我们介绍了一种高通量、简便且定量的免疫印迹技术，可用于细胞和组织水平上的生物标志物验证。

摘要

缺乏一种便捷、定量且高通量的免疫印迹方法来绝对测定细胞和组织水平特定蛋白质的含量，严重阻碍了蛋白质组学研究的进展。目前可用的免疫印迹技术所得结果均为相对定量，无法实现将独立研究与大规模蛋白质样本分析相结合。在本研究中，我们展示了定量点印迹分析（QDB）的过程，以实现高通量格式下的绝对定量。利用一种 commercially available 蛋白质标准品，我们能够确定从小鼠三种不同组织（肾脏、脾脏和前列腺）制备的蛋白质样品中肌动蛋白帽蛋白、类凝溶胶蛋白（CAPG）的绝对含量，并详细说明了实验操作细节。我们提出QDB分析法作为一种便捷、定量、高通量的免疫印迹方法，可用于在细胞和组织水平对单个蛋白质进行绝对定量。该方法将显著促进生物标志物验证以及在生物和生物医学研究多个领域中的信号通路验证。

引言

近年来，随着基因组学研究取得令人振奋的进展，生物医学研究领域也见证了蛋白质组学研究的显著进步。随着基因组和蛋白质组水平的生物学数据不断积累，利用生物信息学工具分析这些数据已成为可预见的未来生物医学研究的重点。因此，生物信息学研究的成功对生物学和生物医学研究领域提出了更高、更高质量的数据需求，而这一目标只能通过基因组学和蛋白质组学技术水平的提升来实现。

质谱法（MS）和免疫印迹分析是目前蛋白质分析的两种主流技术。近年来，质谱法在蛋白质组学研究中占据主导地位，能够同时分析数千种不同的蛋白质。另一方面，基于免疫印迹的技术，包括Western印迹和点印迹，自发明以来在蛋白质研究中也发挥了重要作用1,2,3,4,5。酶联免疫吸附测定（ELISA）5,6,7和反相蛋白质微阵列（RPPM）8,9可被视为免疫印迹分析的高通量形式。然而，除ELISA外，所有这些免疫测定方法仅能测量特定蛋白质的相对表达水平。这类方法的相对性在群体研究中会成为实际问题，因为分析必须在同一时间完成，从而无法通过多次分析来扩大样本量。此外，这些研究所得结果仅为半定量，因此使数据分析中的生物信息学处理变得复杂。同时，尽管ELISA非常适合蛋白质样本的高通量绝对定量分析，但由于其结合能力较低且多重检测能力有限，该技术在细胞或组织等复杂环境中似乎面临挑战10。

我们开发了一种适用于人群研究的免疫印迹方法，其主要特点是操作简便、通量高、可定量，并可用于蛋白质含量的绝对测定，我们将该技术命名为定量点印迹分析（quantitative dot blot analysis, QDB）11。在本研究中，我们提供了QDB分析的详细实验方案，并通过测定CAPG这一特定蛋白质在小鼠肾脏、脾脏和前列腺三种不同组织中的绝对蛋白含量，展示了该方法的应用。我们认为，该详细方案充分说明了该方法的可行性与便捷性，并为实践中避免潜在问题提供了指导。

方案

所有动物实验均按照滨州医学院动物使用指南进行，并经滨州医学院伦理审查委员会批准。

1. 样品制备

  1. 取50 mg小鼠组织放入1.5 mL离心管中。加入200 µL裂解缓冲液（50 mM Hepes，pH 7.4，137 mM NaCl，5 mM EDTA，5 mM EGTA，1 mM MgCl2，10 mM Na2P2O7，1% Triton X-100，10%甘油），并添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂（100 mM NaF，0.1 mM苯甲基磺酰氟，5 µg/mL胃蛋白酶抑制剂，10 µg/mL亮抑酶肽，5 µg/mL抑肽酶）。
  2. 在冰上使用匀浆器匀浆组织1分钟。
  3. 在4 °C下以8 000 × g离心10分钟。
  4. 将上清液收集至新的1.5 mL离心管中，并取1 µL用于BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。
    注意： 所有常用于Western印迹分析和点印迹分析的裂解缓冲液均可用于QDB分析。

2. 确定抗体的特异性

  1. 按照第1.4节制备样品裂解液（20 µg）、无IgG的牛血清白蛋白（20 µg）和标准蛋白（600 pg），用于Western印迹分析。
    注意：无IgG的牛血清白蛋白用作阴性对照，标准蛋白用作阳性对照。通过Western印迹分析显示一条大小正确的特异性条带，可证明抗体的特异性。

3. 定义QDB分析的线性范围

  1. 用ddH2O溶解标准蛋白，将蛋白稀释至浓度为1,200 pg/µL。
  2. 将第1.4节中制备样品的浓缩蛋白稀释至4 µg/µL。
  3. 用ddH2O溶解BSA，将蛋白分别稀释至1,200 pg/µL和4 µg/µL的浓度。
  4. 根据表1和表2的指导，制备一系列标准蛋白和制备样品的稀释液。
  5. 取10 µL稀释后的标准蛋白或稀释后的制备样品，与10 µL 2x上样缓冲液（120 mM Tris-HCl pH 6.8，20%甘油，4% SDS，0.2%溴酚蓝，200 mM DTT）混合。
S1
(0 pg/µl)		S2 (33.3 pg/µl)S3
(100 pg/µl)		S3
(300 pg/µl)		S5
(600 pg/µl)		S6
(1200 pg/µl)
标准蛋白 (1200 pg/µl)01.394.1712.52550
无 IgG 的 BSA
(4 pg/µl)		5048.6145.8337.5250
总量505050505050

表1. 标准蛋白质曲线的稀释方案。

X1
(0 µg/µl)		X2
(0.25 µg/µl)		X3
(0.5 µg/µl)		X4
(1 µg/µl)		X5
 (2 µg/µl)		X6
 (4 µg/µl)
样品 (4 µg/µl)03.1256.2512.52550
无IgG的BSA (4 µg/µl)5046.87543.7537.5250
总量505050505050

表2. 制备样品的稀释方案

  1. 在 85 °C 下加热混合物 5 分钟。

4. QDB 分析流程

  1. 样本应用
    1. 支撑QDB板，避免板的底部接触桌面。例如，可使用空的移液器吸头盒作为支撑物。
    2. 将最多 2 µL 样品加到 QDB 板单个单元底部膜的中心位置。
  2. 干燥培养板
    1. 将加载好的QDB板在室温（RT）下放置1小时，或 alternatively 在通风良好的环境中于37 °C下放置15分钟。
  3. 封闭平板
    1. 将QDB板浸入转移缓冲液（0.039 M甘氨酸，0.048 M Tris，0.37% SDS，20%甲醇）中，轻轻振荡10秒。
    2. 用 TBST（Tris 缓冲盐水，0.1% Tween 20）轻轻冲洗 QDB 板 3 次，然后在持续振荡条件下用 TBST 洗涤 5 分钟。
    3. 用封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST）在恒定振荡条件下封闭QDB板，每孔100 µL，室温孵育1小时。
  4. 一抗孵育
    1. 将一抗用封闭缓冲液按选定浓度（1:500 至 1:5 000）稀释后，每孔加入 100 µL 至标准 96 孔板的各个孔中。将 QDB 板插入 96 孔板内，于室温下振荡孵育 2 小时，或于 4 °C 下振荡孵育过夜。
    2. 或者，将QDB板放入一个盒子中，并加入封闭缓冲液，使液面高出板上膜区域2至3 mm（若整块板使用同一种一抗）。加入选定浓度的一抗，在室温下孵育2小时或4 °C过夜，同时持续振荡。
    3. 用 TBST 轻柔冲洗平板 3 次，随后在持续振荡条件下每次 5 分钟，用 TBST 洗涤 3 次。
  5. 二抗孵育
    1. 将二抗用封闭缓冲液按选定浓度（1:1,000 至 1:50,000）稀释，然后分装至96孔板或按4.4.2节所述置于盒中，每孔加入100 µL；随后将QDB板放入已加样的96孔板或盒中，在室温下恒定振荡孵育1小时。
    2. 用 TBST 轻柔冲洗 QDB 板 3 次，然后在持续振荡条件下，每次用 TBST 洗涤 5 分钟，共洗涤 3 次。
  6. 定量分析
    1. 按照制造商说明书配制增强型化学发光底物（ECL）。
    2. 将ECL底物分装至96孔板（每孔100 µL），将QDB板插入96孔板中，持续振荡孵育2分钟。
    3. 从96孔板中取出QDB板，轻轻振荡以去除多余液体。将该板放置于白色微量滴定板上。
    4. 打开酶标仪，并选择 "带盖培养皿" 在将组合板（QDB板+白色板适配器）放入微孔板读数仪进行定量前，先在用户界面上进行设置。
      注意： 确保使用白色不透明的微量滴定板作为适配器，以避免任何来自板本身的干扰。请务必选择 "带盖培养皿" 为避免将组合板（QDB板+96孔板适配器）放入酶标仪时造成卡板。

结果

测定小鼠组织中包括CAPG蛋白在内的任何蛋白质的绝对含量，均需要特异性抗体和纯化的蛋白质作为标准品。在进行大规模分析之前，还需确定蛋白标准品和裂解液分析的线性范围。抗体的线性范围高度依赖于抗体本身，特定抗体的合适稀释范围需由每个使用者自行验证。

我们首先通过 Western 印迹分析，使用阴性对照（不含 IgG 的 BSA）和阳性对照（市售 CAPG 蛋白），检测 CAPG 抗体在小鼠肾脏、脾脏和前列腺组织中的特异性（图 1A）。抗 CAPG 抗体在小鼠脾脏、心脏、肌肉和前列腺的裂解液中均显示出特异性反应（仅检测到一条条带）。在肾脏和肝脏裂解液中观察到非特异性条带。然而，在肾脏裂解液中，非特异性条带的信号显著弱于特异性条带，表明该抗体适用于肾脏组织的分析。接下来，通过两个并行的剂量曲线实验确定蛋白标准品的线性范围以及用于分析的裂解液用量。根据以往经验，将市售 CAPG 蛋白按 表 1 所示进行系列稀释；同时，根据 BCA 总蛋白定量试剂盒测定的裂解液总蛋白含量，对小鼠肾脏、脾脏和前列腺组织裂解液进行相应稀释。两项剂量实验并行开展，并共同绘制于 图 1B 中。根据微孔板读数仪测得的任意单位下的 QDB 信号，选择合适的小鼠肾脏、脾脏和前列腺裂解液用量。本实验的原始读数见 表 3。

最后一步中，将系列稀释的 CAPG 蛋白标准品以及来自小鼠肾脏、脾脏和前列腺的裂解液上样至 QDB 板。本实验中，选择对小鼠肾脏和脾脏裂解液上样 0.3 µg/样本，对小鼠前列腺裂解液上样 1 µg/样本，因为在这些上样量下，QDB 读数至少比背景值高出 20 倍，同时仍处于基于裂解液和蛋白标准品剂量曲线所确定的线性检测范围内。随后按照所述 QDB 方案处理微孔板，并直接使用酶标仪进行定量。利用系列稀释的纯化 CAPG 蛋白，可通过现有软件（例如 Microsoft Office Excel）进行简单回归分析，建立剂量-反应曲线、方程及 R² 值。根据所建立的方程，将来自小鼠肾脏、脾脏和前列腺裂解液的 QDB 信号转换为这些裂解液中 CAPG 蛋白的绝对含量，并以总蛋白量进行校正：本实验中，小鼠脾脏和肾脏裂解液为 0.3 µg，小鼠前列腺裂解液为 1 µg，最终得到各组织中 CAPG 蛋白的浓度，单位为 pg/µg。结果如图 1C 所示，原始读数见表 4。

CAPG蛋白分析；Western印迹、发光检测图、组织浓度图表。
图1．通过定量点印迹（QDB）分析测定三种小鼠组织（肾脏、脾脏和前列腺）中CAPG蛋白绝对含量的代表性结果。A. 利用来自脾脏、心脏、肌肉、肾脏、肝脏和前列腺的小鼠组织裂解液，通过Western印迹分析检测兔抗CAPG抗体的特异性，并设置阴性对照（不含IgG的BSA）和阳性对照（市售的CAPG蛋白）。B. 使用前列腺、肾脏和脾脏组织裂解液以及纯化的重组CAPG蛋白标准品，确定兔抗CAPG抗体在QDB分析中的线性范围。结果为三个重复样本的平均值。C. 对从小鼠肾脏、脾脏和前列腺制备的裂解液中CAPG蛋白水平进行绝对定量。每根柱状图代表一只小鼠的单个组织样本。结果为三个重复样本的平均值。请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质定量结果表格；各种裂解液中的CAPG水平，包含统计分析。
表3：使用小鼠脾脏、肾脏和前列腺的连续稀释混合裂解液以及纯化的重组CAPG蛋白进行剂量研究的酶标仪检测结果。

CAPG蛋白浓度表，比较肾脏、脾脏和前列腺样本；包含平均值、标准差和倍数变化。

表4：使用重组CAPG蛋白作为标准品，通过QDB分析测定小鼠肾脏（8个）、脾脏（4个）和前列腺（5个）中绝对CAPG水平的酶标仪检测结果。

讨论

在目前除ELISA外所有可用的蛋白质分析免疫测定技术中，QDB分析是唯一能够在细胞和组织水平上以高通量形式实现特定蛋白质绝对含量测定的方法。尽管使用稳定同位素标记标准品的质谱技术能够实现少数蛋白质的绝对定量，但该方法尚未设计用于高通量分析。在本研究中，我们展示了利用QDB分析法对小鼠肾脏、脾脏和前列腺组织中CAPG蛋白水平进行绝对定量的实验过程。结果显示，小鼠肾脏组织中CAPG水平为200至360 pg/g，脾脏中为460至650 pg/g，前列腺组织中为330至390 pg/g。

与ELISA相比，QDB分析在常规实验室中的建立所需工作量更少。首先，QDB板基于硝酸纤维素膜，从而省去了ELISA中的包被步骤。其次，QDB分析仅需一种特异性抗体，而夹心ELISA则需要两种特异性抗体。第三，与ELISA板表面相比，硝酸纤维素膜具有更高的结合容量，因此能够耐受免疫印迹分析中常用的严格洗涤步骤，从而降低背景干扰。这一特性在分析从细胞和组织制备的复杂裂解液时非常有用。相反，由于ELISA板的结合容量相对较低，在开发过程中分析复杂的细胞和组织裂解液时，降低背景干扰成为一个实际挑战。

只要有特定抗体，QDB 分析即可在任何实验室中轻松采用。然而需要指出的是，抗体的特异性是一个相对概念，其受限于物种、组织类型和细胞类型等因素。如图1A所示，在分析小鼠肾脏、脾脏和前列腺的裂解液时，CAPG 抗体具有特异性，但在分析小鼠肝脏时则失去特异性。事实上，我们通常发现一种抗体对某一组织类型具有特异性，但并不总是对同一种物种的其他组织类型具有特异性。因此，进行 QDB 分析前必须先通过 Western 印迹分析来确认抗体的特异性。实际上，抗体的相对特异性可能是导致 ELISA 分析中常出现假阳性或假阴性结果的原因之一，因为无论生产公司投入多少努力来确保检测的特异性，他们也无法穷尽用户可能使用其 ELISA 产品分析的所有类型的样本。

与所有免疫测定方法一样，QDB 分析方法的一个潜在问题是商用抗体质量缺乏一致性。即使使用同一家公司生产的抗体（相同的目录号等），也可能由于批次间的差异，导致不同采购批次之间存在显著差异。因此，除非能够完全确信所用抗体的质量，否则每次采购后对抗体进行重新表征至关重要。

综上所述，本文提供了一个使用QDB分析方法在组织水平上实现特定蛋白质绝对定量的详细实验方案及实例。我们证明，QDB分析方法是一种适用于高通量、定量免疫印迹分析的便捷工具。该方法能够在细胞和组织水平上实现特定蛋白质含量的绝对定量，从而使其区别于传统的免疫印迹技术。这一特性使得多个分析结果的整合与比较成为可能，尤其在大规模人群研究中至关重要，并有望在未来实现蛋白质水平上的相关性关联研究。

披露

作者 Yunyun Zhang、Wenfeng Zhang 和 Jiandi Zhang 就职于 Zestern Biotechniques 公司，该公司生产本文所使用的 QDB 平板。Wenfeng Zhang 和 Yunyun Zhang 声明存在利益冲突，Jiandi Zhang 已提交专利申请。其余作者声明无竞争利益。

致谢

本工作得到泰山学者建设工程（G.T.）、山东省优秀青年科学家奖励计划（ZR2016JL026 至 G.T.）、国家自然科学基金（31771284、3167070448 和 81641108）、山东省自然科学基金（ZR2016JL026、2017GSF18103）、山东省科技计划（J14LE01 和 J15LK03）、烟台市科技计划（2015ZH083）以及滨州医学院科研基金（BY2013KYQD17、BY2013KYQD18）、瑞典研究理事会资助项目（621-2011-4423 和 2015-4870）的支持。本工作还受到“烟台市双百人才计划”和“烟台高新区蓝海人才计划”的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
酶标仪TecanTecan Infinite 200 PRO
QDB 板烟台泽斯特尔有限公司如需验证，可通过电子邮件或访问 www.zestern.net 网站申请获取该板。
辣根过氧化物酶标记驴抗兔 IgG (H+L) 抗体（最小交叉反应：牛、鸡、山羊、豚鼠、叙利亚仓鼠、马、人、小鼠、大鼠、绵羊血清蛋白）jackson 711-035-152
增强型化学发光底物Thermo32134
兔抗 CAPG 抗体 义翘神州公司14213-T52
CAPG 蛋白义翘神州公司14213-HNAE
HepesSigmaH4034
Nacl天津瑞吉金特种化学有限公司10461220
Mgcl2天津致远化学试剂有限公司20120802
EDTASigmaE9884-500G
EGTASigmaBNN1913
Na2P2O7海拓中药检测20160914
Triton X-100SigmaT9284
甘油SigmaG7757
苯甲基磺酰氟SigmaP7626-5G
胃蛋白酶抑制剂SigmaZ290033
亮抑蛋白酶肽SigmaL2884
抑肽酶SigmaA3428
Tris-HclSigmaT6455
SDSSigmaL5750-500G
DTTSigma43815-1G
溴酚蓝SigmaB-0126
NaFSigmaS7920

参考文献

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