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利用宏阵列对转运RNA进行代谢标记与分析

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DOI：

10.3791/56898

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2018年1月16日

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1Laboratory of tRNA Biology, Department of Biology, College of Charleston, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, MUSC, 3Department of Biology, College of Charleston

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们介绍一种名为SPOt（tRNA简化分析平台，Streamlined Platform for Observing tRNA）的原创性转运RNA分析平台。SPOt可在不到24小时内，仅通过三个步骤，同时测定生物样本中所有tRNA的细胞内水平。

摘要

转运RNA（tRNA）是一类丰度较高的短链非编码RNA，通常由76至90个核苷酸组成。tRNA通过将mRNA中的密码子翻译为氨基酸序列，在蛋白质合成中发挥直接作用。长期以来，tRNA被认为仅是缺乏调控功能的看家分子。然而，越来越多的证据表明，细胞内tRNA的水平会随着细胞类型、环境条件和应激状态等不同情况而发生波动。tRNA表达水平的波动直接影响基因的翻译过程，促进或抑制特定蛋白质的表达。因此，要全面理解蛋白质合成的动态过程，必须开发能够提供高质量tRNA表达谱的方法。本文所介绍的方法名为SPOt（Streamlined Platform for Observing tRNA，即tRNA观测的简化平台）。SPOt包括三个步骤：首先使用放射性正磷酸盐对细胞培养物进行代谢标记，随后采用硫氰酸胍-苯酚-氯仿法提取带放射性的总RNA，最后在实验室自制的大阵列膜上进行杂交。通过定量每个探针点的放射性强度来评估tRNA的表达水平。在本实验方案中，我们对中国非致病性细菌Mycobacterium smegmatis mc2155的tRNA进行了表达谱分析，该菌株常被用作研究结核病的模式生物。

引言

细胞内tRNA的水平会随着细胞类型、环境和应激等条件而变化1,2,3。SPOt（Streamlined Platform for Observing tRNA）是一种原创、可靠且简便的技术，可对实验室培养的生物体中的转运RNA（tRNA）水平进行快速而精确的定量分析。

tRNA 具有异常稳定的二级和三级结构4它们还表现出多种转录后修饰5这些特征代表了在使用标准基准RNA定量技术进行直接且可重复的tRNA分析时存在的重大结构和序列障碍，可能造成偏差，有时甚至完全阻碍分析。6世界各地的研究团队被迫开发出各种富有创意但往往复杂繁琐的技术来评估细胞内tRNA水平。这些方法包括：（1）通过代谢标记tRNA的二维电泳分离，结合Northern印迹进行系统性条带定位1；（2）使用经过严格标准化的放射性DNA探针通过Northern印迹进行个体定量7（3）提取后用花青素荧光染料标记，随后进行微阵列分析3，以及（4） 体外 利用重组去修饰酶去除tRNA修饰，结合逆转录及后续高通量测序8.

SPOt 是两种标准且直接方法的简单而独特的组合：（1）RNA 全长标记，即在生长中的生物体中合成放射性标记的总 RNA；（2）tRNA 宏阵列，一种经过优化用于 tRNA 分离的系统化、微型化基因组工具。

样本从活体生物直接简化至定量平台。提取后直接进行分析，不再进行其他处理，与需要提取后扩增或酶处理的技术相比，显著减少了偏差。SPOt技术具有多功能性，可轻松结合多核糖体分级分离，用于鉴定和定量与正在翻译的核糖体物理结合的tRNA亚群。

本文所述方案已针对Mycobacterium smegmatis进行了优化，并已成功用于Escherichia coli9、Saccharomyces cerevisiae10、小鼠和人类细胞培养物中的tRNA分析11。

方案

1. 培养与代谢标记

  1. 用18号针头在无菌1.5 mL微量离心管盖中央穿刺一次，以确保适当通气。将5 µL的补充剂添加至500 µL无菌7H9液体培养基中，并接种 M. smegmatis 来自过夜培养的起始菌种12.
    注意：1升7H9液体培养基的配方为：4.7 g商品化7H9粉末，2 mL甘油，1 mL吐温80，0.85 g NaCl，5 g白蛋白，2 g葡萄糖，H2O（加水至总体积为1 L）。
    1. （注意） 遵循标准的放射防护规范，向培养基中加入 20 µCi/mL 的 [32P] Na2HPO4在摇床培养箱中，于37 °C、1,200 rpm振荡条件下培养细菌，摇床培养箱置于9 mm厚的丙烯酸树脂屏蔽板后方。
  2. 在对数中期（O.D.600 nm ~0.5）时，将整个培养物转移至2 mL螺旋盖离心管中，在室温下于10,000 × g离心2分钟，沉淀放射性细菌。将含有未掺入的放射性正磷酸盐的上清液收集至适当的废液容器中。

2. 总RNA的制备

注意：使用商业化的RNA提取试剂（含有硫氰酸胍、苯酚和氯仿），按照制造商提供的说明书从细菌沉淀中提取总RNA。

  1. 在沉淀物中加入1 mL商业RNA提取试剂和约200 µL玻璃珠。盖紧管盖，将细菌在均质器中以最大搅拌强度（所选仪器的5号档位，参见材料表）裂解2分钟。
  2. 在4 °C条件下以12,000 x g离心10分钟。将上清液转移至新的2 mL离心管中，并妥善弃去玻璃珠。加入0.2 mL氯仿，手动剧烈振荡15秒。在4 °C条件下以12,000 x g离心15分钟。
  3. 将离心管倾斜45°，收集样品的水相至新离心管中，避免吸取任何中间层或有机相。加入2 µL有色沉淀剂和0.5 mL 100%异丙醇。手动剧烈振荡5秒。在4 °C条件下以12,000 x g离心10分钟。
  4. 移除管中的上清液，并按适当方式弃去，因为液体部分可能含有微量放射性物质。将沉淀在空气中干燥5分钟，然后重悬于200 µL的2X盐-柠檬酸钠（SSC）缓冲液（含0.1% (w/v) 十二烷基硫酸钠（SDS））中。
    注：20X SSC储备液的组成为3.0 M NaCl、0.3 M柠檬酸钠，pH 7.0。

3. 96孔打印板的制备

注意：tRNA 微阵列使用八针点样仪手动点样，包含四十二个70-mer DNA寡核苷酸，这些寡核苷酸与M. smegmatis tRNA 3'端互补（不包括末端CCA）。DNA寡核苷酸探针的序列以及在微孔板和微阵列中的探针布局分别提供于补充文件1的表1至表3中。

  1. 设计DNA探针时，首先从tRNA数据库（如基因组tRNA数据库13）中获取tRNA序列或编码tRNA的基因序列。如果序列中包含保守的3'端CCA，则将其截除。对所得序列进行反向互补，然后根据前70个核苷酸序列订购探针。
  2. 将干燥的DNA探针溶于水中，调整探针浓度至100 µM。在96孔板中，每孔加入60 µL探针储备液和60 µL 6X SSC、0.01% (w/v) SDS溶液，配制成终浓度为50 µM、3X SSC、0.01% (w/v) SDS的120 µL寡核苷酸溶液。
  3. 用锡箔纸覆盖96孔板以防止蒸发或污染，立即冷冻并保存于-20 °C，待需要时使用。

4. 芯片打印

  1. 在室温下解冻96孔板（约需20分钟）。
  2. 使用金刚石笔标记氨基包被的玻片。将玻片放入定位装置中，并按照网格位置进行以下操作：
    1. 小心地将复制针浸入各孔中。
    2. 轻柔地在玻片上打印阵列，施加最小压力（会感觉到轻微阻力）。在完成A区之前，无需清洗点样针，继续打印。
  3. 准备进入下一个区域时，请按照以下清洗程序操作：
    1. 将点样针浸入5%次氯酸钠溶液中，轻轻摇动。
    2. 将点样针压入吸水纸上。
    3. 将点样针浸入蒸馏水中，轻轻摇动，然后压入纸中。重复此步骤一次。
    4. 将点样针浸入异丙醇中，轻轻摇动，然后压入纸中。
    5. 在风扇下干燥约20秒，然后继续处理96孔板的下一个区域。根据需要重复打印至所需次数。
  4. 让玻片自然干燥，然后使用254 nm紫外交联仪将寡核苷酸交联至玻片表面。
    1. 将能量值设定为999,990 µJ/cm2。
    2. 将玻片面朝上放置于交联仪内的洁净表面上，按下"开始"按钮。
  5. 将芯片置于450 mL封闭液中，在室温下使用磁力搅拌器缓慢振荡封闭过夜。封闭液可收集并重复使用最多四次。
    注：封闭液配方为：125 mM磷酸缓冲液（NaH2PO4/Na2HPO4-），pH 7.2，2.25% SDS（w/v），0.5 mM EDTA，0.5X SSC，1% BSA（w/v）。
  6. 在500 mL蒸馏水中于室温下洗涤玻片两次，每次5分钟。使用基因芯片离心机在室温下离心10秒以干燥玻片。将芯片阵列储存于干燥避光处，最长可达6个月。

5. 芯片杂交

  1. 杂交前，将载玻片在沸水中冲洗，并通过离心干燥（同4.6步骤）。
  2. 将芯片放入杂交盒中，并加入放射性标记的RNA样品。
  3. 运行自动杂交-洗涤仪以获得最佳重复性。
    1. 按以下程序设置步骤：在75 °C条件下对垫圈预处理2分钟，在60 °C引入探针。
      在90 °C下对探针和样品变性5分钟，在60 °C下杂交3小时。
      1. 用2X SSC、0.1% (w/v) SDS溶液在50 °C下洗涤载玻片两次，流洗10秒，停留20秒；再用0.1X SSC、0.1% SDS溶液在42 °C下洗涤两次，流洗10秒，停留20秒；最后用0.1X SSC溶液在42 °C下再次洗涤两次，流洗10秒，停留20秒。
  4. 通过离心干燥载玻片（同4.6步骤）。

6. 芯片定量

  1. 使用一层薄塑料膜包裹载玻片。用盖革计数器在其最敏感的设置下检测载玻片是否存在放射性信号。根据信号强度，将载玻片置于曝光盒中的存储磷屏上，在室温下曝光 10 至 90 小时。
    注意：由于不同仪器的盖革计数器灵敏度存在差异，曝光时间需通过实验经验进行优化。
  2. 使用磷光成像仪以 50 µm 分辨率扫描载玻片。利用免费的 Image J 软件并加载微阵列分析插件，对每个探针位点的放射性强度进行定量并扣除背景值。
  3. 使用电子表格软件整理和处理数据。使用条件格式化工具生成热图。例如，将每个探针信号表示为总探针信号的千分比（‰）。

结果

三个独立的生物学重复实验表明，在测试的生长条件下，所有 M. smegmatis tRNA 的表达水平均高于背景值（图1）。在本实验中，每个探针的观测标准差介于 2%（Arg (TCT)）和 22%（Cys (GCA)）之间，中位数为 5%（图1）。重复样本之间的假性差异显著受到芯片制备和杂交等因素的影响。通过谨慎且一致的芯片打印以及自动化样品杂交，可实现高重复性。tRNA Ile (GAT) 与 tRNA Val (TAC) 的表达量之间相差 5 倍，分别为表达量最高和最低的 tRNA 物种。SPOt 结果显示，tRNA 同工受体的表达并不均一。同工受体是指携带相同氨基酸但具有不同反密码子序列的 tRNA 物种，因此可识别 mRNA 上不同的密码子。例如，所有丙氨酸同工受体的表达水平相近，而表达量最高和最低的精氨酸 tRNA 之间则相差 3 倍。

tRNA 结合微阵列结果；tRNA 斑点分析；M. smegmatis、M. musculus、H. sapiens 的柱状图比较
图 1：代表性 tRNA 宏阵列结果。 (A) 细菌、小鼠和人类宏阵列的扫描图像。M. smegmatis 阵列仅使用 43 个探针，而小鼠和人类阵列使用 48 个探针。因此，细菌阵列显示 40 个空白斑点（每个阵列上探针重复八次），这些斑点与背景融合，主要集中于左上角。(B) M. smegmatis 在最佳生长条件下的 tRNA 表达谱的柱状图与热图表示。探针信号为三次独立实验（包括细菌培养、代谢标记、提取及阵列杂交）的平均值，以占总 tRNA 千分比数值表示。三次重复实验的标准差分别以柱状图上的误差线和热图中的橙色深浅表示。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

β粒子辐射具有已知的抑菌和杀菌作用14，但在测试范围内，辐射对细胞适应性无显著影响。闪烁计数显示，放射性物质被整合到总细胞提取物的25%中，随后出现在纯化的总RNA的1%中。

探针具有相同的长度、相似的熔解温度和GC含量，结合统一的宏阵列点样、杂交和定量操作流程，使得能够直接通过信号点强度无偏地测定tRNA水平。

SPOt 具有可重复性和特异性。其宽广的动态范围和易于调节的阈值使得仅通过延长芯片曝光时间即可对丰度较低的物种（如与多聚核糖体相关的 tRNA）进行分析9。在完成必要设备的初期投入后，每个样本的运行成本（包括耗材）平均为 15 美元。

SPOt 技术适用于任何基因组可用于探针设计的生物体。适用于培养的模式生物 体外 是进行代谢标记的理想候选对象。由于哺乳动物基因组通常编码大量同工解码tRNA（即具有相同反密码子但在序列主体上存在微小差异的tRNAs），探针需要进行部分简并化设计，以保持对相近tRNA物种的均一杂交。最后，贴壁培养的哺乳动物细胞所获得的总RNA量通常低于悬浮培养的生物体 M. smegmatis因此需要大幅扩大培养规模。

致谢

本工作获得了美国国立卫生研究院普通医学科学研究所 SC INBRE 项目基金（P20GM103499，授予 R.G.）以及基金 CA555536 的资助 & CA154664，由美国国家癌症研究所资助给 P.H.H。本项目部分得到了霍华德·休斯医学研究所通过预科科学教育计划向查尔斯顿学院提供的资助支持 & 本科科学教育项目，以及美国国立卫生研究院下属的国家研究资源中心（5 P20 RR016461）和国家普通医学科学研究所（8 P20 GM103499）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
玻璃载片索引系统V&P Scientific, Inc.VP 470
玻璃载片阵列复制仪V&P Scientific, Inc.VP 478
96孔微孔板索引系统V&P Scientific, Inc.VP 472
洗涤与吸干工作站V&P Scientific, Inc.VP 475
复制针干燥器V&P Scientific, Inc.VP 474
氨基涂层载片Molecular DevicesK2615
杂交仪 / 自动化杂交与洗涤工作站DigilabHyb10022
摇床孵育器Eppendorf Themomixer05-400-200
螺口盖2 ml离心管Thermo Scientific21-403-201
[32P] Na2HPO4Perkin ElmerNEX011001MC
硫氰酸胍-苯酚-氯仿（Trizol）Invitrogen15596026
0.5 mm玻璃珠Research Products International Corp.9831
微型珠磨机VWR25-020
储存式磷屏FujifilmBAS-IP SR 0813
磷光成像仪GE HealthcareTyphoon FLA7000
DNA寡核苷酸IDTN/A
紫外交联仪SpectrolineSelect series 254 nm
微阵列离心机Arrayit CorporationMHC110V
Mycobacterium smegmatisATCC700084
一次性针头BD (Becton Dickinson)305185
2 ml离心管Fisherbrand14-666-317
沉淀剂（GlucoBlue）InvitrogenAM9516
7H9肉汤培养基Difco271310
氯仿Fisher ChemicalsC298-500
异丙醇Fisher ChemicalsA451-4
20 X SSCLonza51205
SDSFisher BioreagentsBP166-100
杂交盒GE Healthcare63-0035-44
甘油Fisher ScientificBP229-1
Tween 80AmrescoM126-100ML
NaClFisher ScientificBP358-212
白蛋白Spectrum ChemicalsA3611
葡萄糖Fisher ChemicalsD16-1
EDTA（乙二胺四乙酸）Fisher BioreagentsBP2482-500
0.5 M 磷酸盐缓冲液 pH 7.2Alfa AesarAAJ63974AP

参考文献

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