需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

内源生长素与细胞分裂素在吐根节间培养过程中的定量分析

9.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/56902

⸱

2018年3月15日

 ,  , 
1Graduate School of Life Sciences, Toyo University

本文内容

摘要

在不使用植物激素处理的情况下，可诱导吐根茎节间片段产生不定芽。为了评估不定芽形成过程中植物激素的动态变化，我们采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定了茎节间片段中的内源生长素和细胞分裂素含量。

摘要

不定芽的形成是经济作物繁殖和转基因植株再生的重要技术。在大多数植物物种中，不定芽的诱导需要植物激素处理。不定芽能否被诱导取决于生长素与细胞分裂素（CK）水平之间的平衡。研究人员通常需针对不同外植体组织和植物物种，确定最适的植物激素浓度和组合。然而，在吐根（ipecac）中，无需添加植物激素，即可在培养基上的节间片段上诱导产生不定芽。这使得可以评估吐根细胞分化所具有的内在可塑性。为诱导吐根不定芽，我们将节间片段接种于不含植物激素、以0.2%结冷胶固化的B5培养基上，在24 °C、光照强度为15 µmol m−2 s−1、光照周期为14小时光照/10小时黑暗的条件下培养5周。为研究不定芽形成过程中植物激素的动态变化，我们采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定了节间片段中内源性吲哚-3-乙酸和细胞分裂素（CKs）的含量。该方法可简便地分析内源性吲哚-3-乙酸和细胞分裂素的水平，并可用于研究其他植物物种器官发生过程中内源生长素与细胞分裂素的动态变化。

引言

戈特利布·哈伯兰特（Gottlieb Haberlandt，1854–1945）提出了“"全能性"”的概念，即植物细胞即使在成熟植株中已分化为特定细胞类型后，仍具有分裂、分化并再生完整植株的能力1。在组织培养中，能否诱导植株再生取决于培养基中外源添加的植物激素的种类及其浓度组合。斯库格（Skoog）和米勒（Miller）发现，在细胞分裂素（CKs）与生长素比例较高的培养基上，烟草愈伤组织可诱导产生不定芽；而在比例较低的培养基上则可诱导产生不定根2。自该发现以来，组织培养已广泛应用于重要经济作物的繁殖以及转基因植株的再生3。不定芽可从除茎尖分生组织以外的其他组织诱导产生，例如叶片、根和节间。在大多数植物物种中，诱导不定芽的形成需要进行植物激素处理。然而，最适浓度和激素组合因物种及所用外植体组织的不同而有所差异。因此，确定实验所需的最适植物激素浓度和组合需投入大量研究工作。

Carapichea ipecacuanha（Brot.）L. Andersson（吐根）是一种药用植物，其根部主要含有吐根碱（emetine）和吐根酚碱（cephaeline）等生物碱4。根部提取物被用作祛痰剂、催吐剂以及抗阿米巴原虫药物5。尽管吐根天然生长于巴西的热带雨林中，但在人工栽培条件下其结籽困难，且在气候较冷的日本进行种子贮藏时，发芽率会逐渐下降6。因此，通常采用组织培养方式进行繁殖，其中以节间部位诱导不定芽形成是最为高效的方法7,8。有趣的是，该物种无需外源植物激素处理即可诱导产生不定芽8。

节间外植体的顶端区域表皮上直接形成不定芽，不经过愈伤组织阶段，而基部区域则不形成不定芽9这种差异表明节间组织存在极性，这可能受到植物激素的调控。催吐萝芙木培养系统为分析不定芽形成过程中内源植物激素水平的变化提供了独特的机会。本文介绍了我们用于分析一种生长素（吲哚-3-乙酸（IAA））和四种细胞分裂素（异戊烯基腺嘌呤（iP）、异戊烯基腺嘌呤核苷（iPR））内源水平的方法。 转玉米素（tZ），以及 转通过使用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定节间段中玉米素核苷（tZR）的含量。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

注意：本研究使用了吐根（C. ipecacuanha），因为它有助于内源性植物激素的分析。

1. 诱导吐根不定芽的生长条件

  1. 准备pH值调至5.7的无植物激素B5培养基10，并加入0.2%的结冷胶。经高压灭菌后备用。
  2. 将25 mL高压灭菌后的培养基倒入无菌培养皿（90 mm × 20 mm）中。
  3. 在无菌丙烯酸板上，使用装有22号刀片的外科手术刀切取8 mm长的吐根植株节间片段，并将其置于培养基上（图1）。
  4. 在24 °C、光照强度为15 µmol m−2 s−1、光周期为14小时光照/10小时黑暗的条件下，将材料在无植物激素的B5培养基上培养5周。
  5. 识别每个节间片段的I区（顶端）至IV区（基部）（图1B）。每周在显微镜下统计各区域长度> 0.3 mm的不定芽数量。

2. 植物激素的提取与纯化

  1. 在四个 2 mL 样品管中各放入一颗 5 mm 的氧化锆珠。
  2. 在无菌丙烯酸板上使用外科手术刀片将样品段切割为 I 至 IV 区（每段长 2 mm）。
  3. 将每个区域的八个片段分别收集到不同的样品管中（鲜重 10–30 mg）。
  4. 称重后，将样品在液氮中速冻。
  5. 使用珠磨式均质器破碎冷冻样品。
  6. 在涡旋振荡器中，将破碎后的样品悬浮于 1 mL 含每种内标物（d5-IAA、d5-tZ、d5-tZR、d6-iP、d6-iPR）各 500 pg 的乙腈中。
  7. 4 °C 下静置 1 小时，然后在室温下以 3,500 × g 离心 5 分钟。
  8. 用含 1%（v/v）乙酸的 80%（v/v）乙腈洗涤沉淀物，再次在室温下以 3,500 × g 离心 5 分钟。将上清液（来自步骤 2.7 和 2.8）合并至一次性玻璃试管中。
  9. 向每份合并的上清液中加入含 1%（v/v）乙酸的 600 µL 水，并使用真空浓缩仪蒸发乙腈。
  10. 依次加入 1 mL 乙腈、甲醇以及含 1%（v/v）乙酸的水，对亲水-亲脂平衡（HLB）固相萃取柱进行平衡。
  11. 将一份样品溶液上样至一个已平衡的 HLB 萃取柱中。
  12. 用 1 mL 含 1%（v/v）乙酸的水洗涤萃取柱。
  13. 用 2 mL 含 1%（v/v）乙酸的 80%（v/v）乙腈在玻璃试管中洗脱所有激素。
  14. 使用真空浓缩仪蒸发洗脱液中的乙腈，得到含 1%（v/v）乙酸的水相提取物。
    注意：切勿完全干燥。
  15. 依次加入 1 mL 乙腈、1 mL 甲醇、0.5 mL 0.1 M HCl 以及 1 mL 含 1%（v/v）乙酸的水，对混合模式强阳离子交换（MCX）固相萃取柱进行平衡。
  16. 将一份样品溶液上样至一个已平衡的 MCX 萃取柱中。
  17. 用 1 mL 含 1%（v/v）乙酸的水洗涤萃取柱。
  18. 用 2 mL 含 1%（v/v）乙酸的 30%（v/v）乙腈在玻璃试管中洗脱 IAA。
  19. 用 2 mL 含 1%（v/v）乙酸的 80%（v/v）乙腈洗涤萃取柱。
  20. 依次用 2 mL 水和 1 mL 含 5% 氨水的水溶液洗涤萃取柱。
  21. 用 2 mL 含 5% 氨水的 60%（v/v）乙腈在玻璃试管中洗脱细胞分裂素（CKs）。
  22. 使用真空浓缩仪蒸发各激素组分中的溶剂，并在 −30 °C 下保存，直至进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。

3. IAA 和 CKs 的液相色谱-串联质谱分析

  1. 将每种激素提取物溶解于含有 600 µL 甲醇的离心管中，然后转移至螺口式全回收小瓶。使用真空浓缩仪蒸发溶剂。
  2. 将 IAA 组分溶解于 20 µL 30% (v/v) 乙腈中，将 CK 组分溶解于含有 1% (v/v) 乙酸的 20 µL 水中，均置于螺口式全回收小瓶中。
  3. 在配备 HPLC 系统的三重四极杆质谱系统上以正离子模式分析样品。
    注意：HPLC 条件设置如表 1所列。
    1. IAA 洗脱采用二元梯度，7 分钟内溶剂 B 从 5% 升至 50%，然后升至 98% 溶剂 B 并保持 1 分钟，再通过嵌套进样在 5% 溶剂 B 条件下平衡 2 分钟。
    2. CK 洗脱采用二元梯度，5 分钟内溶剂 B 从 2% 升至 40%，7 分钟内从 40% 升至 70%，然后升至 95% 溶剂 B 并保持 1 分钟，再通过嵌套进样在 2% 溶剂 B 条件下平衡 2 分钟。
    3. 电喷雾电离（ESI）-MS 的离子源参数设置如表 2所列。
  4. 使用表 3中所列每种分析物的多反应监测（MRM）跃迁进行定量。
  5. 根据非标记标准品与氘代标记标准品的比值标准曲线，定量内源性 IAA 和 CK 水平。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

在第1st 周时，未见不定芽形成。在第2nd 周时，出现小芽。在第 3rd 和 4th 周后，芽的数量主要在顶端区域（I 和 II）增加（图2A）。在第5th 周，I 区的芽数量约为 7 个，II 区约为 5 个（图2B相比之下，区域III和IV中仅形成少量芽。

培养前，区域 I 的 IAA 水平（4.1 pg/mg，鲜重（FW））略高于区域 II–IV（约 2.5 pg/mg FW）； 图3）。在第1st 周时，IAA 水平在区域 IV 显著升高（11.4 pg/mg FW），...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

为了确定参与器官发生的植物激素的分布情况，使用在不含植物激素的培养基上能够观察到器官发生的植物材料至关重要。因为当外源施加植物激素以诱导愈伤组织形成芽或根时，这些激素会影响整个外植体，从而难以评估植物在细胞分化和器官发生方面的内在可塑性。在其他植物物种中，例如 Dianthus caryophyllus L.11、Aegle marmelos (L.) Corrêa12、Bacopa monnieri (L.) Pennell13、Celastrus paniculatus Willd.14 和 Kalanchoë blossfeldiana Poelln.15，可在不含植物激素的培养基上诱导产生不定芽。该实验方案有可能应用于这些植物物种。

我们使用乙腈提取...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

我们感谢东洋大学应用生物科学系的村上明先生以及群马县农业技术中心的谷口光大先生提供的技术支持。同时感谢东洋大学的柏田昌佐教授和Uma Maheswari Rajagopalan博士提出的宝贵建议。本研究部分由东洋大学生命与环境科学研究中⼼资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
[2H5]吲哚-3-乙酸Olchemlm Ltd031 1531LC-MS/MS内标物
[2H5]反式玉米素Olchemlm Ltd030 0301LC-MS/MS内标物
[2H5]反式玉米素核苷Olchemlm Ltd030 0311LC-MS/MS内标物
[2H6]N6-异戊烯基腺嘌呤Olchemlm Ltd030 0161LC-MS/MS内标物
[2H6]N6-异戊烯基腺苷Olchemlm Ltd030 0171LC-MS/MS内标物
吲哚-3-乙酸Wako098 00181LC-MS/MS标准品
反式玉米素SIGMA-ALDRICHZ0876 5MGLC-MS/MS标准品
反式玉米素核苷Wako262 01081LC-MS/MS标准品
N6-异戊烯基腺嘌呤SIGMA-ALDRICHD7674 1GLC-MS/MS标准品
N6-异戊烯基腺苷ACROS ORGANICS22648 1000LC-MS/MS标准品
LC-MS用超纯乙腈 LiChrosolvMERCK1.00029.1000LC-MS/MS溶剂
色谱用水 LiChrosolvMERCK1.15333.1000LC-MS/MS溶剂
HPLCSHIMADZUProminence
MSSciex3200QTRAP
Oasis HLB 30 mg/1 ccWatersWAT094225固相萃取小柱
Oasis MCX 30 mg/1 ccWaters186000252固相萃取小柱
螺旋口全回收小瓶Waters186002805
蓝色，12 x 32 mm 螺旋口盖及聚四氟乙烯/硅胶隔垫Waters186000274
Acquity UPLC BEH C18, 2.1x100 mmWaters186002350UPLC色谱柱
Proshell 120 EC-C18, 2.1x50 mmAgilent699775-902UPLC色谱柱
数码显微镜LeicaDHS1000
TissueLyser IIQIAGEN85300
手术刀片FeatherNo. 22
手术刀柄FeatherNo. 4
Savant SpeedVac/制冷式蒸气捕集器Thermo Fisher ScientificSPD111/RVT4104真空浓缩仪
一次性玻璃试管 (13x100 mm)IWAKI9832-1310
无菌培养皿INA OPTICAI-90-20

参考文献

  1. Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).
  2. Skoog, F., Miller, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).
  3. Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N. Transgenic plants and crops. Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. , CRC Press. Ch. 4 69-84 (2002).
  4. Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).
  5. Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research. Atal, C. K., Kapur, B. M. , Jammu-Tawi, India. 295-301 (1982).
  6. Bajaj, Y. P. S. Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 87-103 (1993).
  7. Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).
  8. Yoshimatsu, K., Shimomura, K. Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard. Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).
  9. Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac. J. Plant Growth Regul. , (2017).
  10. Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).
  11. Watad, A. A., et al. Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures. Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).
  12. Ajithkumar, D., Seeni, S. Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree. Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).
  13. Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).
  14. Rao, M. S., Purohit, S. D. In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd. Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).
  15. Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).
  16. Yoshimoto, K., et al. Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis. Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).
  17. Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development. Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

细胞分裂素分析液相色谱-串联质谱法不定芽形成吐根茎节培养植物激素动态植物组织培养激素定量结冷胶培养基真空浓缩仪
内源生长素与细胞分裂素在吐根节间培养过程中的定量分析
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。