监测朊病毒样蛋白聚集体的细胞间传播 黑腹果蝇

摘要

越来越多的证据表明，与神经退行性疾病相关的致病性蛋白质聚集体具有类似朊病毒的特性，可在细胞间传播。本文介绍了一种可在模式生物黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中可视化此类朊病毒样聚集体在细胞间扩散的方法。

摘要

蛋白质聚集是大多数神经退行性疾病的核心特征，包括阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、亨廷顿病（HD）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）。在这些疾病中，蛋白质聚集体与神经病理学密切相关，尽管异常蛋白质聚集破坏正常细胞稳态的确切机制尚不清楚。新兴数据为以下假说提供了有力支持：AD、PD、HD 和 ALS 中的致病性聚集体在许多方面与朊病毒相似，朊病毒是一类仅由蛋白质构成的传染性因子，可引发可传播性海绵状脑病。朊病毒通过模板化诱导天然折叠状态的同种蛋白质发生构象转变而实现自我复制，从而导致聚集表型的扩散。目前，关于朊病毒以及 AD、PD、HD 和 ALS 中朊病毒样蛋白如何在细胞间传播的问题正处于深入研究之中。此处，一个 黑腹果蝇 描述了一种可用于监测与亨廷顿病（HD）相关的突变型亨廷顿蛋白（Htt）聚集体以类朊病毒方式在细胞间传播的模型。该模型利用了多种强大的工具，可对转基因表达进行有效调控 黑腹果蝇 组织，并利用荧光标记的细胞质蛋白直接报告突变型Htt聚集体的朊病毒样转移。重要的是，本文所述方法可用于鉴定介导不同细胞类型间蛋白聚集体扩散的新型基因与通路 体内这些研究获得的信息将拓展对神经退行性疾病潜在致病机制的有限认知，并揭示新的治疗干预机会。

引言

朊病毒假说认为，导致可传播性海绵状脑病（例如，人类的克雅氏病、羊的痒病、鹿和麋鹿的慢性消耗性疾病，以及牛的"疯牛病"）的感染因子仅由蛋白质构成，不含核酸¹。在朊病毒疾病中，细胞型朊病毒蛋白（PrP^C）会转变为一种非天然的、稳定的构象（PrP^Sc），该构象富含β折叠，能够通过转化并招募单体形式的PrP^C分子，形成稳定的淀粉样蛋白聚集体，从而实现自我复制。PrP^Sc聚集体利用这种自我复制机制在机体内的不同细胞间传播，甚至可在不同个体之间传播²。

蛋白质错误折叠和聚集也是大多数神经退行性疾病（阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、亨廷顿病（HD）和肌萎缩侧索硬化症（ALS））的核心特征³。这些疾病中细胞内或细胞外聚集蛋白复合物的形成与细胞毒性密切相关⁴，并随着时间推移在脑内沿高度可重复且疾病特异性的路径进展^5,6。这些扩散模式提示，与这些疾病相关的致病性聚集物具有类朊病毒特性。目前已有充分证据支持与AD、PD、HD和ALS相关的聚集物存在类朊病毒样传播机制....

方案

1. 在Drosophila中耦联Gal4与QF介导的Htt转基因表达

1. 收集和/或构建含有组织特异性 Gal4 或 QF “驱动子”的转基因 Drosophila melanogaster 品系，以及构建在 Gal4-UAS³⁸ 或 QF-QUAS³⁹ 下游含有野生型或突变型 Htt 转基因的品系。确保这些转基因表达的蛋白质与荧光蛋白融合或带有表位标签，以便在同一果蝇中区分突变型和野生型 Htt 转基因产物。参见 图1。
   ​注意：我们通常使用人源 Htt 基因的外显子1片段²⁷。然而，如有需要，也可构建表达更长 Htt 片段或其他基因的转基因果蝇。
2. 设计遗传策略，使突变型和野生型 Htt 转基因在彼此分离、无重叠的细胞群体中表达。
   1. 若存在任何表达重叠，则在同一细胞中合成的突变型和野生型 Htt 蛋白将共同聚集，从而阻碍朊病毒样事件的检测。为避免此情况，可分别使用 Gal4 和 QF 的特异性抑制因子 Gal80 和 QS⁴⁰（参见 图1）。选择发育调控的 Gal4 和/或 QF 驱动子有助于将突变型 Htt 的表....

结果

此处描述的方法可产生可靠的数据，证明在完整的果蝇中枢神经系统中，Htt蛋白聚集体能够以类朊病毒方式从一个细胞群体转移到另一个细胞群体。当供体嗅觉受体神经元（ORNs）表达HttQ91-mCherry时，受体胶质细胞中野生型Htt蛋白会由弥散状态转变为点状聚集，这一转化可通过该YFP融合蛋白的直接荧光观察到。图2A-C 和 图4A，B）。准确报告这两种细胞群之间类朊病毒样的转移事件，需要仔细选择转基因果蝇品系及Gal4/QF驱动系统，以在发育期及成体阶段实现突变型和野生型Htt转基因的高水平表达，同时避免表达区域的重叠。此外，对荧光蛋白-Htt融合转基因的合理设计可支持强大的下游分析。例如，突变型和野生型Htt聚集体可作为点状结构通过人工方式定量分析（图2C 和

讨论

随着神经退行性疾病患者人数持续增加，迫切需要加深对这些疾病分子发病机制的理解，以开发更有效的治疗方法。本文描述了在模式生物中监测致病性蛋白质聚集体在不同细胞类型之间类朊病毒传播的方法， 黑腹果蝇我们最近利用该方法证明了突变型Htt聚集体的朊病毒样传播 体内 并鉴定介导这些聚集体从神经元向胶质细胞传播的吞噬受体²⁷我们的方法利用了使用中的若干优势 黑腹果蝇 研究人类遗传性疾病：其生命周期短且拥有丰富的遗传工具集，可加速发现具有治疗相关性的基础生物学信息。

本文所述方法相较于其他现有的动物和细胞培养模型在研究朊病毒样传播方面具有两大优势：（1）聚集性致病因子（例如，突变型 Htt）由完整组织中的细胞产生；（2）在另一群独立的细胞中表达同一蛋白的正常折叠形式（例如，野生型 Htt），可作为易于检测的"报告系统"，用于监测朊病毒样事件。我们利用在Drosophila⁴⁰中已.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲液（PBS），10X，pH 7.4	ThermoFisher Scientific	AM9625	稀释至1X
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-1L
Kimwipes 擦镜纸	Thomas Scientific	2904F24
20% 多聚甲醛（PFA）	Electron Microscopy Sciences	15713-S
正常山羊血清（NGS），过滤	Lampire Biological Laboratories	7332500	收到后分装并冷冻保存
鸡抗-GFP 抗体	Aves Labs	GFP-1020	使用稀释比例为1:500
兔抗-DsRed 抗体	Clontech	632496	使用稀释比例为1:2000；可识别基于DsRed的荧光蛋白（例如 mCherry、mStrawberry、tdTomato 等）
小鼠抗-Bruchpilot 抗体	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	使用稀释比例为1:100；可标记果蝇大脑中所有活跃的突触前结构
FITC 标记的抗鸡IgG抗体	ThermoFisher Scientific	SA1-7200	使用稀释比例为1:250
Alexa Fluor 568 标记的抗兔IgG抗体	Life Technologies	A11011	使用稀释比例为1:250
Alexa Fluor 647 标记的抗小鼠IgG抗体	Life Technologies	A21235	使用稀释比例为1:250
Slowfade Gold 抗荧光淬灭封片剂	Life Technologies	S36936
显微镜载玻片（25 × 75 × 1.0 mm）	Fisher Scientific	12-550-143
盖玻片（22 × 22 mm）	Globe Scientific	1404-15
Dumont 生物级镊子，型号 3	Ted Pella	503	用于非优势手
Dumont 生物级镊子，型号 5	Ted Pella	505	用于优势手
LAS X 图像分析软件	Leica
Imaris 图像分析软件	Bitplane