利用全面的免疫沉淀富集系统鉴定靶蛋白的内源性翻译后修饰谱

摘要

针对目标蛋白的多种内源性翻译后修饰进行研究可能极具挑战性。本文所述技术采用优化的裂解缓冲液和滤膜系统，并结合特异性靶向特定翻译后修饰的亲和基质，利用单一、简化的系统即可检测目标蛋白的乙酰化、泛素化、SUMO化2/3以及酪氨酸磷酸化修饰。

摘要

目前人们已充分认识到，翻译后修饰（PTM）在调控蛋白质的结构与功能中发挥着关键作用，这些修饰可能对特定蛋白质在生理及病理条件下的功能至关重要。在研究目标蛋白的PTM状态时，通常需要对PTM进行富集，因为PTM往往具有瞬时性且丰度较低。在富集目标蛋白的PTM过程中常会遇到诸多困难，例如缓冲液不兼容、目标蛋白抗体不适合免疫沉淀（IP）、PTM信号丢失等。当需要同时研究同一目标蛋白上的多种PTM（如乙酰化、泛素化、SUMO化2/3以及酪氨酸磷酸化）时，实验难度进一步加大。由于不同PTM之间存在广泛且关键的相互调控作用，因此联合研究这些PTM可能是必要的。然而，这些PTM通常需在不同的裂解缓冲液体系中，并添加各自特异的抑制剂组合来进行研究。为简化实验流程，已开发出一种独特的变性裂解体系，可有效分离并稳定保存上述四种PTM，从而能够在单一裂解体系中探究它们之间可能存在的相互作用。同时设计了一种独特的滤膜系统，用于去除裂解液中污染性的基因组DNA——这是变性缓冲液使用过程中常见的问题性副产物。此外，针对这四种PTM分别开发了高效的亲和基质，并与该缓冲体系协同优化，以最大程度地富集和检测这些PTM的内源性状态。这一整套全面的PTM检测工具显著简化了获取关键信息的过程，有助于明确某一蛋白质是否被其中一种或多种PTM所修饰。

引言

翻译后修饰（PTMs）是对蛋白质进行的高度调控的改变，这些修饰以特定方式被添加或去除。PTMs 通常是动态且短暂的变化，能够显著改变蛋白质的结构、与伴侣蛋白的相互作用以及空间定位，最终使蛋白质执行不同的功能^1,2,3,4。PTMs 数量极为丰富，可使独特蛋白质形式（或称蛋白质异构体）的数量从约 30,000 个基因产物增加至超过一百万个蛋白质异构体^5,6。鉴定 PTMs 并明确其对靶蛋白的影响，对于理解蛋白质的生理与病理功能至关重要^{7,8,9,10,11,12,13,14}。针对微管蛋白、p53 和表皮生长因子受体（EGFR）等特定蛋白质的研究已阐明了 PTMs 的调控作用^15,16,17。这些研究揭示了一个事实：这些蛋白质的调控由多种 PTMs 共同介导，在许多情况下，这些修饰协同作用以促进特定功能的实现。新近研究显示，在多种不同蛋白质上均可发生协同性或抑制性的 PTM 串扰^{18,19,20,21,22,23,24,25}。然而，大多数蛋白质的 PTM 图谱来源于使用不同模型和独特条件的多项研究。若能建立一个经过优化的系统，用于在同一系统中研究多种 PTMs，将极大有助于深入理解靶蛋白潜在的 PTM 串扰机制。

在单一系统中研究翻译后修饰（PTMs）的一个挑战在于，不同的特定PTM需要使用不同的裂解缓冲液进行研究。例如，常用于磷酸化或泛素化研究的RIPA或NP-40等缓冲液，在研究诸如小泛素样修饰物（SUMO）化这类不稳定的PTM时可能并不充分²⁶。此外，非变性缓冲液无法有效解离蛋白质相互作用，可能导致PTM的假阳性鉴定²⁷。相比之下，使用变性裂解缓冲液研究PTM可能是更优选择，因为它能更有效地从所有细胞区室中分离蛋白质²⁸，可解离大多数蛋白质间的相互作用，并能抑制改变PTM状态的蛋白酶（如去SUMO化酶）²⁶；然而，变性缓冲液可能会影响某些亲和试剂的完整性，例如基于泛素结合结构域的工具²⁷。因此，开发一种类似变性条件的裂解系统，以在兼容亲和试剂的体系中同时研究蛋白质的多种PTM，将对PTM之间的串扰研究具有重要意义。

尽管在研究翻译后修饰（PTMs）时，变性缓冲液相较于非变性缓冲液具有关键优势，但由于其显著的缺点而较少被使用，例如与常规蛋白质检测方法不兼容、基因组脱氧核糖核酸（DNA）污染严重，以及会破坏免疫沉淀（IP）试剂²⁹。这些缺点可能导致样品制备时间延长，并在剪切基因组DNA时对目标蛋白质造成潜在损伤。目前常用的两种剪切DNA方法包括注射器裂解和超声处理²⁹。这两种方法均需要大量优化，且通常缺乏精确的可重复性。去除基因组DNA的替代方法包括添加DNase酶；然而，这可能需要额外的优化以及缓冲液成分的调整。因此，在使用变性裂解缓冲液进行PTM研究时，若能采用一种简单且可重复的去除基因组DNA污染的方法，将具有重要优势。

该技术的目标是建立一个系统，用于在单一系统中分离和研究泛素化（Ub）、酪氨酸磷酸化（pY）、SUMO化2/3（SUMO 2/3）以及乙酰化（Ac）这四种翻译后修饰（PTM），以更深入地探究目标蛋白的PTM相互作用。该PTM检测系统已被用于在单一系统中快速分析多个目标蛋白的内源性PTM谱，并发现了有关潜在PTM串扰的新见解^30,31。总体而言，本文所述技术在以下三个方面改进了现有的PTM及PTM串扰研究方法：1）开发了一种独特的变性缓冲液，可从所有细胞区室中分离蛋白，同时仍与PTM亲和试剂兼容；2）开发了一种独特的滤膜系统，能够以高重复性快速去除变性裂解液中的基因组DNA污染，且无需特殊设备；3）所使用的高稳定性亲和微珠、裂解系统和抑制剂试剂相互兼容，从而简化了目标蛋白这四种PTM的分离流程，实现PTM富集的最大化，并高效检测潜在的修饰间串扰。

方案

1. 样品制备：细胞培养

1. 在添加了10%胎牛血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养四块150 mm的A431细胞培养板。
   1. 将A431细胞培养至50%汇合度。
   2. 使用无血清DMEM对四块A431细胞培养板进行血清饥饿处理24小时。
   3. 用33.3 mg/mL表皮生长因子处理其中两块A431细胞培养板1小时，另外两块不作处理。
      注意：此处所示的细胞生长和处理条件仅为示例；然而，该方法适用于多种不同类型的细胞和处理条件。
2. 配制含抑制剂的blastR裂解缓冲液和稀释缓冲液（表1）。将2.895 mL blastR裂解缓冲液与15 µL酪氨酸磷酸酶抑制剂、30 µL去泛素化酶和去SUMO化酶抑制剂、30 µL组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂以及30 µL蛋白酶抑制剂混合液混合。
   1. 将9.65 mL blastR稀释缓冲液与50 µL酪氨酸磷酸酶抑制剂、100 µL去泛素化酶和去SUMO化酶抑制剂、100 µL组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂以及100 µL蛋白酶抑制剂混合液混合。
      注意：缓冲液成分和抑制剂信息详见材料表。
3. 倒掉培养基，将细胞置于冰上，然后用10 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。
   1. 在加入blastR裂解缓冲液前，尽可能去除PBS，以最大化细胞裂解效率。
      注意：缓冲液成分详见材料表。
4. 每块150 mm培养板加入600 µL blastR裂解缓冲液。缓冲液体积根据预期蛋白产量确定（表2）。
   1. 使用细胞刮刀裂解细胞。由于细胞核裂解，裂解液将变得黏稠。
5. 使用剪去尖端的1 mL移液器吸头，将粗裂解液转移至已置于15 mL收集管中的blastR滤器中（图1）。此处使用15 mL离心管。
6. 使用配套的滤器推杆完全压紧blastR滤器，将裂解液滤过液（包括任何气泡）收集至15 mL离心管中（图1）。
7. 可选：将澄清后的裂解液转移至1.5 mL微量离心管中，在4 °C下以约10,000 × g离心1分钟。
   1. 将上清液转移至新的15 mL离心管中。
8. 用blastR稀释缓冲液将澄清裂解液稀释至每块150 mm培养板终体积为3 mL。终体积根据预期蛋白产量确定（表2）。
   注意：此步骤至关重要，因为最终缓冲液组成将影响免疫沉淀反应的严谨性。
9. 测定蛋白浓度（第2节）。

2. 蛋白质定量分析

注意：采用标准的比色法蛋白质定量检测来确定蛋白质浓度。此处使用 Precision Red Advanced Protein Assay 进行蛋白质定量。

1. 向两个1 mL比色皿中各加入1 mL的Precision Red高级蛋白质检测试剂。
2. 在冰上，将10 µL blastR裂解缓冲液与40 µL blastR稀释缓冲液混合于一个洁净的1.5 mL微量离心管中。
   注意：此混合液用于测定空白蛋白质样品。
3. 向第一个比色皿中加入20 µL裂解/稀释缓冲液混合液（来自步骤2.2），通过倒置混匀2至3次。
4. 向第二个比色皿中加入20 µL稀释后的细胞裂解液（来自实验），混匀方式同上。
5. 将样品在室温下孵育1分钟。
6. 使用裂解/稀释缓冲液混合样品（来自步骤2.3）作为空白对照，校准分光光度计。
7. 在600 nm处测定裂解液样品（来自步骤2.4）的吸光度。
8. 按下述方法确定裂解液蛋白质浓度；
   样品OD₆₀₀读数 × 5 = 蛋白质浓度（mg/mL）
   注意：OD读数低于0.05或高于0.5时，接近蛋白质检测的线性范围极限。对于读数>0.5的样品，可进行稀释；对于读数<0.05的样品，可向Precision Red高级蛋白质检测试剂中加入更多裂解液（最多50 µL）。参见表3中将分光光度计读数转换为mg/mL裂解液蛋白质浓度的换算系数。若单个培养板中蛋白含量不足，建议每个免疫沉淀实验使用2个或更多培养板。在此情况下，将依次收获各板，将最初的300 µL裂解缓冲液在各板之间转移。
9. 根据蛋白质浓度，使用缓冲液混合液（1份blastR裂解缓冲液 : 4份blastR稀释缓冲液）将样品稀释至目标终浓度（通常为1 mg/mL）。
10. 将不立即使用的样品分装后迅速冷冻。
    1. 将样品储存于-70 °C。
    2. 进入第3节继续操作。

3. 免疫沉淀（IP）实验

注意：亲和 beads 的浓度、裂解液浓度和孵育时间仅为推荐的参考值，可能因每种目标蛋白及特定的翻译后修饰（PTM）而异。

1. 反复倒置含有泛素亲和磁珠、磷酸化酪氨酸亲和磁珠、SUMO 2/3 亲和磁珠以及乙酰化亲和磁珠的试剂管，确保磁珠在管内完全重悬。
2. 根据每次免疫沉淀（IP）实验，将磁珠悬液分装至预冷的 1.5 mL 微量离心管（IP 管）中。在此步骤中，分别向各 1.5 mL 微量离心管中加入 20 µL 泛素亲和磁珠、30 µL 磷酸化酪氨酸亲和磁珠、40 µL SUMO化 2/3 亲和磁珠或 50 µL 乙酰化亲和磁珠。
   注意：每种亲和磁珠推荐使用的磁珠悬液体积请参见表 4。
3. 反复倒置含有泛素化 IP 对照磁珠和 IgG 对照磁珠的试剂管，确保磁珠在管内完全重悬。
4. 将对照磁珠按每个对照反应所需量分装至单独的 1.5 mL 微量离心管（对照 IP 管）中，用于检测非特异性结合。在此步骤中，分别向各 1.5 mL 微量离心管中加入 20 µL Ub 对照磁珠、30 µL pY 对照磁珠、40 µL SUMO 2/3 对照磁珠或 50 µL Ac 对照磁珠。
   注意：每种亲和磁珠推荐使用的磁珠悬液体积请参见表 4。
5. 保留少量裂解液（20 µL）作为 Western 印迹上样对照。加入 5 µL 5× 上样缓冲液，并在 95 °C 下煮沸 5 分钟。
   注意：缓冲液成分请参见材料表。
6. 将裂解液分别加入各 IP 管和对照 IP 管中。本实验中，每次 IP 反应和对照反应使用 1 mg 裂解液，共进行 8 次 IP 反应。
   注意：建议每次检测使用 1.0 mg 裂解液作为起始量。所需裂解液的量取决于目标修饰蛋白的丰度。
7. 将各管置于 4 °C 下，使用翻转式旋转仪孵育 2 小时。本实验使用 ATR 管式旋转仪，转速设为 22。
8. 在 4 °C 下以 3,000 - 5,000 ×g 离心 1 分钟，使磁珠沉淀。
9. 尽可能吸除上清液，避免扰动磁珠沉淀。
10. 在 4 °C 下，用 1 mL blastR 洗涤缓冲液在旋转平台上洗涤磁珠 5 分钟（此阶段无需添加抑制剂）。
11. 在 4 °C 下以 3,000 - 5,000 ×g 离心 1 分钟，收集磁珠。
12. 尽可能吸除上清液，避免扰动磁珠沉淀。
13. 重复洗涤步骤（步骤 3.10 - 3.12）两次。
14. 最后一次洗涤后，彻底去除缓冲液上清。允许对磁珠沉淀造成轻微扰动（损失不超过 5%）。使用细孔蛋白加样枪头去除残留上清。
15. 加入 30 µL 磁珠洗脱缓冲液，并通过轻弹或轻敲管壁使磁珠重悬。此阶段切勿使用移液器吹打。
    注意：缓冲液成分请参见材料表。
16. 室温孵育 5 分钟。
17. 将各管中的磁珠悬液轻柔转移至已置于 1.5 mL 微量离心管中的 1.5 mL 微量离心过滤柱中。
    注意：建议剪去移液枪头末端，以便更温和地转移样品。
18. 在室温下以 9,000 - 10,000 ×g 离心 1 分钟，收集 IP 样品。
19. 向每个样品中加入 2 µL 2-巯基乙醇，并充分混匀。
    注意：可将过滤柱盖剪下，用于封闭收集管，便于后续操作。
20. 将样品置于 95 °C 水浴中 5 分钟。随后在室温下以 10,000 ×g 离心 1 分钟收集样品。
21. 如有需要，可将样品储存于 -70 °C 并在此暂停实验，或继续进行 SDS-PAGE 电泳、转膜及 Western 印迹分析（第 4 节）。

4. 蛋白质印迹分析：目的蛋白的鉴定

1. 根据标准实验室方案，采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离样品，并将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜³²。
2. 使用一抗检测目标蛋白的翻译后修饰形式。此处使用 PD-L1 抗体检测翻译后修饰的 PD-L1。
3. 使用超敏化学发光检测试剂进行检测。
   注意：化学发光试剂需与可识别一抗的 HRP 标记二抗配合使用。
4. 每张小型凝胶尺寸的转膜（约 8 × 7 cm）使用 2 mL 化学发光试剂。
   1. 与合适的二抗孵育（建议室温孵育 60 分钟）后，用 30 mL 含吐温-20 的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBST）洗涤印迹膜，每次 10 分钟，共洗 6 次。
      注意：缓冲液成分见材料表。
   2. 使用前立即取化学发光试剂 A 和试剂 B 各 1 mL 混匀（足够用于一张 8 cm × 7 cm 的膜）。
   3. 将化学发光试剂加入膜上，室温轻摇孵育 1–5 分钟，随后通过 X 射线胶片或电荷耦合器件（CCD）相机成像检测蛋白信号。
      注意：对于丰度较高的蛋白，可能需要缩短在化学发光试剂中的孵育时间。

结果

这些工具通过有效检测上述4种PTM来研究PTM串扰的能力，在一定程度上依赖于独特的裂解缓冲液系统。blastR变性缓冲液与其他变性缓冲液类似，能够有效分离来自所有细胞区室的蛋白质，从而确保获得完整的蛋白质谱图2A）。此外，该方法可保留不稳定的翻译后修饰信号，如 SUMO 2/3，此类信号在非变性缓冲液（如放射免疫沉淀法缓冲液，RIPA）中会迅速减弱（图2B）。重要的是，在适当稀释后，它不会像其他变性缓冲液那样影响亲和试剂的完整性例如， Laemmli缓冲液）

使用变性缓冲液时的一个重要障碍是有效去除基因组DNA污染的能力。传统降低黏度的方法是通过注射器针头剪切DNA或对样品进行超声处理。图3A展示了A431细胞裂解液经BlastR滤器、注射器针头或超声处理后的基因组DNA污染情况。使用BlastR滤器几乎可完全去除基因组DNA，而传统的注射器针头或超声处理则无法达到此效果。基因组DNA污染会显著影响蛋白质在SDS-丙烯酰胺凝胶中的迁移；然而，经BlastR滤器处理后可去除基因组DNA，从而实现正常的蛋白质迁移（图3B）。由基因组DNA污染引起的迁移异常会显著影响Western印迹结果的解读；例如，未过滤裂解液中出现的EGFR弥散条带模式可能被错误地解释为相对于过滤样品的表达量升高（图3C）。

通过使用这一优化的翻译后修饰富集与检测系统，可快速确定目标蛋白是否被一种或多种翻译后修饰所修饰。近期利用该技术对PD-L1的翻译后修饰谱进行了研究，结果表明，在EGF刺激下，PD-L1发生了泛素化、乙酰化以及酪氨酸磷酸化修饰（图4）。重要的是，这些数据报告的是内源性PD-L1翻译后修饰的变化，其仅占所鉴定总PD-L1的一小部分。

图 1：使用 BlastR 滤膜从细胞裂解液中去除基因组 DNA。 (A) BlastR 滤膜的图像。 (B) 将裂解液加入已置于 15 mL 收集管中的滤膜中。 (C) 将推杆插入注射器，通过按压使裂解液穿过滤膜。 (D) 通过完全按压收集裂解液，包括所有气泡。 (E) 过滤后的裂解液。

图 2：BlastR 裂解缓冲液与替代裂解缓冲液的比较。 图 2A 改编自 Horita et al. 2017. Biosci. Rep.³¹ (A) 使用 BlastR、RIPA、mPER、IP 裂解、变性（1% SDS）和 Laemmli 裂解缓冲液裂解 A431 细胞。所有变性裂解物均使用 BlastR 滤膜去除基因组 DNA。通过针对各细胞区室标志蛋白的抗体，检测膜、细胞质、线粒体和细胞核标志物蛋白的分离情况。 (B) 使用 BlastR、RIPA 和 1% SDS 变性缓冲液裂解 A431 细胞。裂解物用 SUMO 2/3 或对照 IgG 亲和磁珠进行免疫沉淀。样品经 SDS-PAGE 分离后，使用 SUMO 2/3-辣根过氧化物酶（HRP）抗体进行蛋白质印迹分析。图中显示的是来自 N≥3 次独立实验的代表性印迹结果。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：BlastR 裂解滤膜可有效去除基因组 DNA。 (A) 使用变性裂解缓冲液裂解 A431 细胞，通过 BlastR 滤膜、注射器针头或超声处理（5、10、20 或 30 秒）去除或剪切基因组 DNA。取 2% 裂解液进行溴化乙锭染色，并通过琼脂糖凝胶电泳分析。 (B) A431 细胞经变性缓冲液裂解后，裂解液未经过滤或使用 BlastR 滤膜过滤。样品通过 SDS-PAGE 分离，并用考马斯亮蓝染色显影。 (C) B 组重复样品经 SDS-PAGE 分离后转至 PVDF 膜，使用 EGFR 抗体检测 EGFR 蛋白。图中显示的是 N ≥3 次独立实验的代表性印迹结果。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：EGF诱导的PD-L1翻译后修饰的检测。 图片改编自Horita et al. 2017. Neoplasia³⁰ (A)。血清剥夺的A431细胞在裂解前，未经刺激（UT）或经EGF刺激1小时，使用BlastR裂解缓冲液进行裂解。WCL用于检测PD-L1水平（泳道1,2）。使用泛素结合磁珠（UBA01）免疫沉淀泛素化蛋白（泳道3,4）。使用磷酸酪氨酸结合磁珠（APY03）免疫沉淀酪氨酸磷酸化蛋白（泳道5,6）。使用SUMO 2/3结合磁珠（ASM24）免疫沉淀SUMO化2/3蛋白（泳道7,8）。使用乙酰化赖氨酸结合磁珠（AAC01）免疫沉淀乙酰化蛋白（泳道9,10）。使用IgG结合对照磁珠免疫沉淀非特异性结合蛋白（泳道11,12）。样品经SDS-PAGE分离后，使用PD-L1抗体进行Western印迹分析。图中展示的是N ≥3次独立实验的代表性结果。白色星号用于标记PD-L1 pY和Ac蛋白条带。 请点击此处查看该图的放大版本。

BlastR 裂解缓冲液的配制计算
	1.0 mL	2.0 mL	5.0 mL	10.0 mL
BlastR 裂解缓冲液	965 µL	1930 µL	4.825 mL	9.650 mL
酪氨酸磷酸酶抑制剂	5 µL	10 µL	25 µL	50 µL
去泛素化酶/去SUMO化酶抑制剂	10 µL	20 µL	50 µL	100 µL
HDAC 抑制剂	10 µL	20 µL	50 µL	100 µL
蛋白酶抑制剂混合物	10 µL	20 µL	50 µL	100 µL
BlastR 稀释缓冲液的配制计算
	4.0 mL	8.0 mL	20.0 mL	40.0 mL
BlastR 裂解缓冲液	3.86 mL	7.72 mL	19.3 mL	38.6 mL
酪氨酸磷酸酶抑制剂	20 µL	40 µL	100 µL	200 µL
去泛素化酶/去SUMO化酶抑制剂	40 µL	80 µL	200 µL	400 µL
HDAC 抑制剂	40 µL	80 µL	200 µL	400 µL
蛋白酶抑制剂混合物	40 µL	80 µL	200 µL	400 µL

表1： 裂解与稀释缓冲液配制表。 本表格提供了在配制用于细胞裂解的裂解缓冲液和稀释缓冲液时，针对特定体积所需添加的抑制剂浓度。

培养皿蛋白质含量	推荐的 BlastR 裂解缓冲液体积	推荐的 BlastR 稀释缓冲液体积
< 1 mg	合并多个培养皿的蛋白质	调整至终体积为 1.5 mL
1–2 mg	300 µL	调整至终体积为 1.5 mL
2–4 mg	600 µL	调整至终体积为 3 mL
4–6 mg	900 µL	调整至终体积为 4.5 mL

表2： BlastR 裂解/稀释缓冲液用量表。 提供在制备裂解液时推荐使用的裂解缓冲液和稀释缓冲液体积的对照表。

加入 1 ml 精确红蛋白检测试剂的细胞裂解物体积（µL）	样本吸光度 OD600 读数所用乘数
10	10
20	5
30	3.3
40	2.5
50	2

表3： 将分光光度计读数转换为 mg/mL 裂解液的换算系数。 该图表提供换算数值，以帮助计算蛋白质浓度。

亲和 beads	bead 悬液/IP 体积 (mL)
泛素化	20
磷酸化酪氨酸	30
SUMO化 2/3	40
乙酰化	50
对照 beads	bead 悬液/IP 体积 (mL)
泛素化对照 beads	20
磷酸化酪氨酸对照 beads	30
SUMO化 2/3 对照 beads	40
乙酰化对照 beads	50

表4：每项免疫沉淀反应推荐使用的磁珠体积对照表。 本对照表提供了每次免疫沉淀反应推荐使用的亲和磁珠用量。

讨论

确定目标蛋白是否发生翻译后修饰的初步方法可采用目标蛋白特异性抗体进行免疫沉淀，随后使用翻译后修饰特异性抗体进行蛋白质印迹检测例如，抗乙酰化赖氨酸），或使用PTM抗体进行免疫沉淀，随后用靶蛋白特异性抗体进行蛋白质印迹检测^30,31,33虽然这两种方法在理论上均可行，但使用靶蛋白特异性抗体存在更多潜在缺陷，例如该抗体可能不适合用于免疫沉淀（IP），或者较大的翻译后修饰（PTM）可能遮蔽靶蛋白上的抗体识别位点。^34,35PTM 亲和 beads 的优势在于抗体或结合结构域可特异性识别目标 PTM；因此，靶蛋白的修饰不应影响亲和 beads 对其识别。例如，利用本文所述技术鉴定出 PD-L1 的泛素化修饰，并检测到内源性的单泛素化和多泛素化形式（图4）。Lim最近发表的一篇论文 等已使用 体外 Ub 技术用于研究 PD-L1 的泛素化，结果与图中所示结果非常相似 图4³⁶有趣的是，他们还使用 PD-L1 抗体进行了免疫沉淀，以从细胞裂解液中富集 PD-L1，其中 Ub 过表达并添加了 MG-132 以增强信号。然而，Ub 条带较弱，且与预期结果明显不同 体外 泛素化模式。在Lim的细胞培养模型中，未对内源性PD-L1的泛素化进行研究。 等报告以阐明其细胞培养与其他方法之间的差异 体外 数据

由于蛋白质翻译后修饰（PTM）丰度较低且具有瞬时性，检测某种蛋白质是否发生PTM修饰具有挑战性^37,38，通常需要通过免疫沉淀（IP）进行富集。有效的PTM免疫沉淀需要对多个关键步骤和试剂进行优化，例如裂解缓冲液和亲和试剂。在研究目标蛋白的多种PTM修饰时，所需的优化工作可能进一步增加。在本实验方案中，使用blastR裂解系统是关键步骤，该系统在保持强大免疫沉淀能力的同时，能够在同一系统中实现对磷酸化酪氨酸（pY）、SUMO 2/3、泛素（Ub）和乙酰化（Ac）这四种PTM的检测。该技术优化了确定特定目标蛋白是否受到这四种PTM修饰所需的时间和资源，并且相较于使用多种裂解系统分别进行PTM检测，可能更有利于揭示不同PTM之间的相互作用。已有研究对blastR裂解系统与糖基化等其他PTM的兼容性进行了探索；然而，该系统尚未针对所有类型的PTM进行全面验证。

大量的基因组DNA可能会干扰使用比色法或Nanodrop方法进行的蛋白质定量，影响蛋白质在SDS丙烯酰胺凝胶中的迁移，并在免疫沉淀（IP）实验中阻碍蛋白质与亲和基质的结合。本方案中所描述的方法利用一种特制滤器，可有效去除基因组DNA污染，这是本实验流程中的另一个关键步骤。为强调这一点，我们在blastR滤器处理前后进行了黏度测试，结果显示样品黏度由高黏度降低至与水相当的水平（数据未显示）。这一黏度变化得到了以下结果的支持： 图3，表明几乎所有的基因组DNA均已被去除。重要的是，该方法不会剪切DNA，因为任何已剪切的DNA片段均无法被滤膜捕获（数据未显示）。该工具优于传统的剪切方法（如超声处理或注射器剪切DNA），因为它无需特殊设备、具有高度可重复性，并且是去除DNA而非将其剪切。此外，该方法不会降解裂解液中的蛋白质，而传统方法可能会导致蛋白质降解²⁹. 使用该滤器每个样本需要5至30秒，而其他方法中有效降解DNA可能需要数分钟即，注射器剪切）可能导致样品不均一，因为DNA污染物仍会残留在裂解液中。对blastR过滤前后的裂解液进行了全面分析，通过考马斯亮蓝染色、靶蛋白特异性Western blot以及总蛋白和靶蛋白特异性PTM分析均未观察到蛋白谱的明显差异；因此，过滤去除基因组DNA可能并未影响蛋白谱的完整性。最终，该过滤系统适用于任何存在基因组DNA并可能影响蛋白分析结果解读的Western blot或免疫沉淀（IP）应用。

需要注意的是，使用该技术可能存在假阴性检测结果的风险，部分原因可能包括亲和磁珠饱和、结合位点干扰或翻译后修饰（PTM）被掩盖。例如，某种特定靶蛋白可能仅在极低水平上发生乙酰化修饰（Ac），因此当广谱乙酰化赖氨酸亲和磁珠被更大量乙酰化修饰的靶蛋白饱和后，该低丰度靶蛋白可能无法被有效富集。目前正在进行的研究旨在评估本实验方案所用亲和试剂的检测灵敏度，但最近一项发表的研究表明其检测限非常灵敏。数据显示，该技术每细胞可检测到少至17个乙酰化靶蛋白分子³¹。然而，某些特定情况，如细胞类型的特异性、在特定刺激下瞬时发生的翻译后修饰，或由于蛋白质相互作用导致的翻译后修饰被掩盖，均可能导致假阴性结果。这些问题不仅是该技术的潜在局限，也普遍存在于大多数翻译后修饰免疫沉淀（IP）方法中。因此，建议通过多种方法验证实验结果。

研究表明，糖基化和磷酸化等修饰会竞争相同的氨基酸位点^39,40，而泛素化和磷酸化等其他翻译后修饰（PTM）则被发现可依次发挥作用，共同调控蛋白质功能^17,41。近期针对神经病理蛋白Tau的研究突显了PTM之间相互作用的重要性，其中Tau蛋白的过度磷酸化与SUMO化修饰可相互增强⁴²。此外，该研究团队发现Tau的SUMO化修饰可抑制其多泛素化修饰及后续降解过程，可能导致Tau蛋白聚集。这只是PTM间调控性相互作用的众多实例之一，而本技术的应用将有助于阐明PTM及其相互作用在健康与疾病状态下对关键蛋白质调控的重要意义。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞裂解/基因组DNA去除与分析
1x 磷酸盐缓冲液（PBS）	常用缓冲液		配方：NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4
BlastR 裂解缓冲液	Cytoskeleton 公司	BLST01	专有混合物，含去垢剂、盐类及其他缓冲液添加剂
放射免疫沉淀分析缓冲液（RIPA）	常用缓冲液		配方：Tris-HCl、NaCl、SDS、脱氧胆酸钠、Igepal
哺乳动物蛋白提取试剂（mPER）	Thermofisher	78503	专有混合物，含去垢剂、盐类及其他缓冲液添加剂
免疫沉淀（IP）裂解液	Pierce	87787	专有混合物，含去垢剂、盐类及其他缓冲液添加剂
1% 十二烷基硫酸钠（SDS）变性缓冲液	常用缓冲液		配方：PBS、SDS、EDTA、EGTA
Laemmli 缓冲液	常用缓冲液		配方：Tris-HCl、SDS、甘油、溴酚蓝
BlastR 稀释缓冲液	Cytoskeleton 公司	BDB01	专有混合物，含去垢剂、盐类及其他缓冲液添加剂
蛋白酶抑制剂混合物	Cytoskeleton 公司	PIC02
N-乙基马来酰亚胺（NEM）& N,N,N′,N′-四(2-吡啶基甲基)乙二胺（TPEN）	Cytoskeleton 公司	NEM09BB
曲古抑菌素A（TSA）& 烟酰胺	Cytoskeleton 公司	TSA01
活化正钒酸钠（Na3VO4)	Cytoskeleton 公司	PYI01
细胞刮刀	Costar	3008
BlastR 滤膜	Cytoskeleton 公司	BLR02
BD 胰岛素注射器针头	BD	08290-3284-11
超声破碎仪（Branson Sonifier）	Branson	Sonifier 450
Precision Red 高级蛋白检测试剂	Cytoskeleton 公司	ADV02
1 mL 比色皿	Fisher	14955127
分光光度计（Genesys20）	Thermofisher	4001	其他分光光度计也可用于测定蛋白浓度
琼脂糖	Fisher	BP1356-500
1kb 脱氧核糖核酸（DNA）ladder	NEB	N3232L
DNA 凝胶电泳槽	Thermofisher	7312 B1A
Tris/硼酸/EDTA（TBE）缓冲液	常用缓冲液		配方：Tris-HCl、硼酸、EDTA
PTM 免疫沉淀
磷酸化酪氨酸磁珠	Cytoskeleton 公司	APY03-beads
泛素化磁珠	Cytoskeleton 公司	UBA01-beads
SUMO化 2/3 磁珠	Cytoskeleton 公司	ASM24-beads
乙酰化磁珠	Cytoskeleton 公司	AAC04-beads
磷酸化酪氨酸对照磁珠	Cytoskeleton 公司	CIG01-beads
泛素化对照磁珠	Cytoskeleton 公司	CUB02-beads
SUMO化 2/3 对照磁珠	Cytoskeleton 公司	CIG01-beads
乙酰化对照磁珠	Cytoskeleton 公司	CIG02-beads
BlastR 洗涤缓冲液	Cytoskeleton 公司	BWB02	专有混合物，含去垢剂、盐类及其他缓冲液添加剂
磁珠洗脱缓冲液	Cytoskeleton 公司	BEB01	专有混合物，含去垢剂、盐类及其他缓冲液添加剂
微量离心机	Eppendorf	5417	其他微量离心机也可使用
管式旋转混合仪	ATR	RKVSD	其他翻转式管式旋转仪也可使用
蛋白加样吸头	VWR	37001-150
离心柱	Cytoskeleton 公司	SPN22
95 °C 恒温金属浴	Benchmark	BSH1002
SDS-PAGE/转膜/蛋白印迹分析
5x 上样缓冲液	常用缓冲液		配方：溴酚蓝、二硫苏糖醇（DTT）、甘油、SDS、Tris-HCl
Novex wedge well 4-20% Tris-甘氨酸凝胶	Invitrogen	XP04200BOX	大孔径wedge well适用于大体积样品上样
1x 电泳缓冲液	常用缓冲液		配方：Tris-HCl、甘氨酸、SDS
SeeBlue 蛋白ladder	Life Technologies	LC5625
电泳槽	Invitrogen	Xcell surelock 电泳槽	其他电泳槽也可使用，但此型号与Novex wedge well凝胶兼容
电源	Biorad	PowerPac HC	其他电源也可使用
1x 转膜缓冲液	常用缓冲液		配方：Tris-HCl、甘氨酸、甲醇
转膜装置	Biorad	mini trans-blot 转膜仪	其他转膜装置也可使用
Immobilon-P 膜（PVDF）	Millipore	IPVH 304F0
脱脂奶粉	Thrive	813503015095
含Tween的Tris缓冲盐水（TBST）	常用缓冲液		配方：Tris-HCl、NaCl、Tween 20
化学发光检测试剂	Cytoskeleton 公司	CLRA/CLRB
细胞培养与处理
杜尔贝科改良伊格尔培养基	ATCC	30-2002
胎牛血清	ATLAS	F-0500-A
表皮生长因子	Cytoskeleton 公司	CN02-A
150 mm 细胞培养皿	Corning	430599