用于评估结合能力的细胞聚集实验 果蝇 缺口与 转录-配体及其抑制作用 顺式-配体

摘要

复杂性 体内 系统使得区分 Notch 受体的激活与抑制变得困难 转- 和 顺式-配体。在此，我们介绍一种基于 体外 用于定性与半定量评估结合能力的细胞聚集实验 果蝇 Notch 到 转-配体与 顺式-配体。

摘要

Notch 信号通路是一种在进化上保守的细胞间通讯系统，广泛参与动物的发育过程及成体组织的维持。当 Notch 受体与邻近细胞上的配体相互作用时，可诱导该信号通路的激活。转-活化），而与同一细胞上的配体相互作用则会抑制信号传导（顺式-抑制）。适当的平衡 转-激活和 顺式-抑制有助于在动物发育的某些情况下建立最佳的Notch信号水平。由于Notch与其配体在多种细胞类型中存在表达区域的重叠以及反馈机制的存在，研究特定翻译后修饰对 转- 与 顺式Notch 及其配体的相互作用 体内 很困难。在此，我们描述了一种使用 果蝇 S2 细胞在细胞聚集实验中用于评估敲低 Notch 信号通路调控因子对 Notch 与各配体结合的影响 转 以及在 顺式稳定或瞬时转染表达Notch载体的S2细胞与表达各Notch配体的细胞（S2-Delta或S2-Serrate）混合。 转录受体与配体结合导致异型细胞聚集体的形成，其结果以每毫升中由...组成的聚集体数量来衡量 >6 个细胞。为检测抑制作用 顺式-配体，共表达Notch和每种配体的S2细胞与S2-Delta或S2-Serrate细胞混合，聚集体数量的定量方法如上所述。由于存在该配体导致的聚集体数量相对减少程度 顺式-配体提供了一种度量方法 顺式配体介导的抑制作用 转-结合。这些简单的实验可提供关于基因或药物干预对Notch与其配体结合影响的半定量数据，并有助于解析潜在的分子机制 体内 此类操作对 Notch 信号通路的影响。

引言

经典的Notch信号通路是一种短程的细胞间通讯机制，需要相邻细胞之间的直接接触，以促进Notch受体与其配体之间的相互作用¹。Notch受体（位于信号接收细胞表面）与配体（位于信号发送细胞表面）之间的相互作用启动Notch信号通路，该过程被称为反式激活²。相反，Notch与其配体在同一细胞内的相互作用则会抑制Notch通路，被称为顺式抑制³。反式与顺式相互作用之间的平衡对于确保配体依赖性的最佳Notch信号传导至关重要⁴。Drosophila仅具有一个Notch受体和两种配体（Delta和Serrate），而哺乳动物则具有四个Notch受体和五种配体［Jagged 1（JAG1）、JAG2、delta样1（DLL1）、DLL3和DLL4］⁵。由于这种简单性，Drosophila模型便于解析或研究通路调节因子对Notch-配体相互作用以及后续Notch信号通路的影响。在动物发育过程中的某些情况下（包括Drosophila的翅发育），顺式和反式相互作用均参与实现适当的Notch信号传导和细胞命运决定^1,6。在这些背景下，区分Notch通路调节因子对Notch与其配体之间顺式与反式相互作用的不同影响具有重要意义。

我们课题组先前报道过，将一种称为木糖的碳水化合物残基添加到 果蝇 Notch 在某些情况下（包括翅发育过程）对 Notch 信号通路起负向调控作用⁷. 缺失 假手术组 （使Notch发生木糖基化的酶）导致 "翅脉缺失" 表型⁷最近，通过基因剂量实验和克隆分析表明，基因的丢失 假手术组 增强Delta介导的Notch信号传导。为了区分Notch信号增强是由于 假手术组 突变体的表型是由于减少所致 顺式抑制或增加 转-利用幼虫翅成虫盘中Notch配体的异位过表达研究进行激活 dpp-GAL4 进行了驱动实验。这些实验提供的证据表明 Shams 具有调控作用 转- 在不影响 Notch 的情况下通过 Delta 激活 Notch 顺式-配体抑制⁸然而，反馈调节机制以及内源性配体的作用可能会使异位过表达研究的结果解释变得复杂^1,6,9.

为了解决这个问题， 果蝇 S2细胞¹⁰ 被使用，其提供了一种简单的方法 体外 用于Notch-配体相互作用研究的系统^11,12S2 细胞不表达内源性 Notch 受体和 Delta 配体¹¹ 并表达低水平的 Serrate¹³，这不会影响Notch-配体聚集实验⁸因此，可通过稳定或瞬时转染使S2细胞表达Notch和/或单个配体（Delta或Serrate），从而获得仅表达Notch受体、单一配体或二者组合的细胞。将表达Notch的S2细胞与表达配体的S2细胞混合后，可通过受体-配体结合介导形成异型聚集体。^11,12,14聚集体形成的量化提供了衡量指标 转Notch 及其配体之间的结合¹⁵ (图1）。类似地，S2 细胞可与 Notch 及 Delta 或 Serrate 配体共转染（即 顺式-配体） 顺式-ligands 在这些表达 Notch 的 S2 细胞中会阻断 Notch 与 转-配体，导致聚集体形成减少^8,12,14由聚集体形成相对减少所导致的 顺式-配体提供了抑制作用的度量 顺式-配体对Notch与结合的影响 转-配体（图2）。因此，采用细胞聚集实验来检测失去木糖基化对 转- 和 顺式Notch 及其配体之间的相互作用

在此，我们提供了一种用于评估Notch与配体结合能力的细胞聚集实验的详细方案 转-配体及其抑制作用 顺式-配体的使用 果蝇 S2细胞。例如，我们提供了使我们能够确定Notch木糖基化对Notch与配体之间结合影响的数据 转-Δ⁸这些简单的检测方法可对 Notch-配体相互作用进行半定量评估 体外 并有助于确定其潜在的分子机制 体内 Notch 通路调节剂的作用

方案

1. 用于 Shams 基因沉默的双链RNA（dsRNA）的制备

1. PCR扩增产物
   1. 使用野生型 黄色 白色 (y w基因组DNA和 pAc5.1-EGFP 以该模板和以下引物对扩增用于合成dsRNA的DNA片段。采用以下PCR扩增程序：变性（95 °C，30 s）、退火（58 °C，30 s）和延伸（72 °C，1 min）。
      增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) dsRNA 引物（5'-3'）-
      上游引物 - GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
      反向引物- GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG
      Shams dsRNA 引物（5'-3'）-
      上游引物- TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
      反向引物- TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA
      注意： EGFP dsRNA 用作阴性对照。
2. 使用商品化的凝胶回收试剂盒，按照生产商提供的操作说明对聚合酶链式反应（PCR）产物进行凝胶纯化。
3. 执行 体外 使用商业产品，按照制造商方案，从T7启动子进行转录。
4. 使用RNA纯化试剂盒，按照生产商说明书纯化双链RNA，并于-80 °C保存。
5. 评估效率 假手术组 使用以下步骤进行敲低（1.5.1–1.5.5）。
   1. 使用血细胞计数板手动计数细胞，并接种 5 x 10⁵ 6 孔板中每孔加入 1 mL Schneider 培养基，培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）和 100 U/mL 青霉素-链霉素，每孔接种 S2 细胞。
   2. 加入 7.5 µg 的 EGFP- 或 假手术组 将dsRNA加入每孔，25 °C孵育24 h。
   3. 收获对照组（EGFP dsRNA处理）和 假手术组 通过轻柔吹打使经dsRNA处理的S2细胞悬浮，随后在25 °C下以1,000 × g离心5分钟收集细胞沉淀，按照试剂盒说明书使用RNA提取试剂盒进行RNA提取。
   4. 使用分光光度计定量RNA，并取100 ng RNA，采用商用qPCR试剂和引物/探针进行一步法qRT-PCR，PCR扩增程序如下：变性（95 °C，15 s）和退火/延伸（60 °C，1 min）。
      注意：请参见 材料表 有关引物/探针组合及所用仪器的信息 假手术组 以及在这些研究中进行的对照qRT-PCR实验。
   5. 计算相对值 假手术组 使用2的mRNA水平^-ΔΔCT 方法¹⁶.

2. Notch 受体与反式配体结合能力的评估

1. 制备信号接收细胞（表达Notch受体的S2细胞）。
   1. 使用血细胞计数板手动计数细胞，并接种 5 x 10⁵ 在6孔板的每孔中加入1 mL Schneider培养基，培养基中添加10% FBS和100 U/mL青霉素-链霉素，分别接种S2细胞和稳定的S2-Notch细胞。
      注意：S2-Notch 细胞可从 果蝇 基因组资源中心（DGRC），在培养基中加入200 nM甲氨蝶呤。配制0.5 mM甲氨蝶呤储备液时，首先将甲氨蝶呤溶于250 µL 1 M NaOH中，配制成20 mM溶液；随后用1 M磷酸盐缓冲液将其稀释至0.5 mM，并于-20 °C保存。在S2-Notch细胞中，Notch蛋白的表达由 果蝇 金属硫蛋白启动子在 pMT 载体
   2. 向每个孔中加入 7.5 µg 的 dsRNA，在 25 °C 下孵育 24 小时。
   3. 加入 0.7 mM CuSO₄₄ 诱导 Notch 表达，并在 25 °C 下培养 3 天。
      注意：CuSO₄ 用于诱导由金属硫蛋白启动子控制的蛋白表达。
2. 准备信号发送细胞（表达 Delta 或 Serrate 配体的 S2 细胞）。
   1. 使用血细胞计数板手动计数细胞，并接种约 5 x 10⁶ 稳定的 S2-Delta 或 S2-Serrate^汤姆 6 孔板中每孔加入 1 mL 添加 10% FBS 和 100 U/mL 青霉素-链霉素的 Schneider 培养基，接种细胞。
      注意：S2-Delta 细胞添加 200 nM 甲氨蝶呤，S2-Serrate 细胞添加 100 µg/mL 潮霉素^汤姆 培养基中的细胞。Delta 和 Serrate 的表达^汤姆—一种带有Tomato标签的功能性Serrate蛋白¹²—处于 果蝇 金属硫蛋白启动子在 pMT 载体
   2. 加入 0.7 mM CuSO₄₄ 诱导配体表达，并在25 °C下孵育3小时。
3. 在信号发送细胞与信号接收细胞之间进行聚集。
   1. 通过轻柔吹打收集经dsRNA处理的S2（对照）和S2-Notch细胞，并将2.5 × 10⁵个细胞接种于培养板中⁵ 细胞/孔，接种于24孔板，通过血细胞计数板手动计数后确定。
   2. 加入 5 x 10⁵ 稳定的 S2-Delta 或 S2-Serrate^汤姆 200 µL 含10% 胎牛血清和100 U/mL 青霉素-链霉素的Schneider培养基中的细胞
      注意：所有S2细胞操作（包括铺板、诱导和dsRNA处理）均在生物安全柜中进行。
   3. 将培养板置于转速为150 rpm（942.48 rad/min）的摇床中。
   4. 1分钟后，混匀各孔中的内容物，取出20 µL用于计数聚集体数量。
      1. 在倒置复式显微镜下使用10倍放大倍数（PLL 10/0.25物镜）同时拍摄代表性图像。
      2. 手动计数聚集体（>6 个细胞）使用血细胞计数板。
   5. 将培养板置于摇床中。
   6. 在聚集后5分钟和15分钟时重复进行图像采集和计数。
4. 进行定量分析 转结合
   1. 计算S2细胞与S2-Delta或S2-Serrate之间每毫升的聚集体数量^汤姆 作为背景对照的细胞。
   2. 计算 S2-Notch 与 S2-Delta 或 S2-Serrate 之间的聚集体数量（每毫升）^汤姆 细胞（幅度的） 转-结合）

3. Notch与配体结合抑制作用的评估 转录-配体通过 顺式-配体

1. 制备信号接收细胞。
   1. 接种 5 × 10⁵ 6 孔板中每孔加入 1 mL Schneider 培养基，培养基中添加 10% 胎牛血清和 100 U/mL 青霉素-链霉素，每孔接种 S2 细胞。
   2. 向每个孔中加入 7.5 µg 的 dsRNA，在 25 °C 下孵育 24 小时。
   3. 将经dsRNA处理的细胞共转染 pBluescript 和 pMT-Notch¹¹ （DGRC）单独或与 pMT-Notch 和 pMT-Delta¹¹ （DGRC）或 pMT-Serrate¹⁷ 使用商品化转染试剂，按照生产商说明书操作，使每孔总DNA浓度达到2 µg。
      注意： pBluescript 用作对照。共转染的细胞将称为 S2-Notch&Delta^瞬时的 或 S2-Notch&Serrate^瞬时的 细胞（下文简称细胞）。
   4. 将瞬时转染的S2细胞在25 °C下孵育24小时。
   5. 加入 0.7 mM CuSO₄₄ 诱导 Notch 及其配体的表达，并在 25 °C 下孵育 3 天。
2. 按照2.2节所述制备信号发送细胞。
3. 按照第2.3节所述，进行信号发送细胞与信号接收细胞之间的聚集。
4. 量化抑制作用 转结合 顺式-配体。
   1. 计算S2细胞与S2-Delta或S2-Serrate细胞之间每毫升的聚集体数量，作为背景对照。
   2. 通过定量分析抑制程度 顺式-配体如下。
      1. 定义 A S2-Notch 之间的聚集体数量^瞬时的 和 S2-Delta 细胞。
      2. 定义 B S2细胞瞬时共转染Notch和Delta后形成的聚集体数量（S2-Notch&Delta^瞬时以及 S2-Delta 细胞。
      3. 计算相对聚集度 C = (B ×100)/A
      4. 计算抑制程度 顺式-配体（Delta 或 Serrate）作为 100 – C.
         注意：例如，如果相对聚集率为45%，则 顺式-配体被认为可抑制 转结合率降低55%。

结果

我们的体内观察结果表明，木糖基转移酶基因shams的缺失会导致Notch信号通路的增强，这是由于Delta介导的Notch反式激活增加所致，而配体对Notch的顺式抑制不受影响⁸。为了验证这一假设，我们进行了体外细胞聚集实验。首先，使用shams dsRNA在S2细胞中敲低shams的表达，以EGFP dsRNA作为对照。通过实时PCR检测敲低（KD）效率，结果显示敲低效率超过80%⁸。随后，利用聚集实验检测了shams敲低后Notch受体与反式Delta之间的结合情况。将S2-Notch细胞与S2-Delta细胞混合后，在不同时间点观察其聚集情况。以普通S2细胞与S2-Delta细胞之间的聚集作为背景对照。图3展示了混合后不同时间点（1、5、15和30分钟）...

讨论

经典的Notch信号通路依赖于Notch受体与其配体之间的相互作用⁵。尽管大多数关于Notch通路的研究主要关注相邻细胞间Notch与配体的结合（trans），但Notch也能与同一细胞内的配体发生相互作用，这类所谓的cis相互作用可在Notch信号传导中发挥抑制作用^3,4。因此，为了阐明某种调控因子对经典Notch信号通路影响的机制，通常有必要同时研究这两种类型的Notch-配体相互作用（trans和cis）。然而，在动物发育的许多情况下，这两种相互作用及其反馈调控的共同参与使得体内（in vivo）研究变得复杂^1,6。在本实验方案中，我们提供了一种详细的体外（in vitro）细胞聚集实验方法，利用果蝇（Drosophila）S2...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BioWhittaker Schneider's 果蝇培养基，改良	型 Lonza	04-351Q
HyClone 青霉素-链霉素 100X 溶液	GE Healthcare 生命科学
CELLSTAR 6 孔板	Greiner Bio-One	657 160
CELLSTAR 24 孔板	Greiner Bio-One	662160
VWR 迷你摇床	Marshell Sceintific	12520-956
血球计数器	Fisher Sceintific	267110
FuGENE HD 转染试剂	Promega	E2311
MEGAscrip T7 转录试剂盒	Ambion	AM1334
Quick-RNA MiniPrep（RNA 纯化试剂盒）	Zymo Research	R1054
VistaVision 倒置显微镜	VWR
9MP USB2.0 显微镜数码相机 + 高级软件	AmScope	使用 ToupView 软件采集	MU-900
PureLink 快速凝胶提取试剂盒	Invitrogen	K210012
胎牛血清	GenDepot	F0600-050
甲氨蝶呤	Sigma-Aldrich	A6770-10
潮霉素 B	Invitrogen	HY068-L6
硫酸铜	Macron Fine Chemicals	4448-02
S2 细胞	Invitrogen	R69007
S2-SerrateTom cells			来自 R. Fleming 的礼物（Fleming 等人，开发，2013 年）
S2-Delta 细胞	DGRC	152
S2-Notch 细胞	DGRC	154
pMT-Delta 载体	DGRC	1021	来自 S. Artavanis-Tsakonas 的礼物
pMT-Serrate 载体			来自 Ken Irvine 的礼物 （Okajima et al， JBC， 2003）
pMT-Notch 载体	DGRC	1022	来自 S. Artavanis-Tsakonas 的礼物
pAc5.1-EGFP			来自 Hugo Bellen
的礼物 TaqMan RNA-to-Ct 1-Step 试剂盒		Applied Biosystem
TaqMan 基因表达检测试剂盒（假）	Applied Biosystem	Dm02144576_g1	使用 FAM-MGB 染料
用于 CG7939 （RpL32） 的 TaqMan 基因表达检测	FAM-MGB 染料的	Applied Biosystem	Dm02151827_g1
Applied Biosystems 7900HT 快速实时荧光定量 PCR 系统	Applied Biosystem	4351405	96 孔封闭模块