神经元-巨噬细胞共培养以激活分泌促进神经突生长分子因子的巨噬细胞

摘要

本实验方案介绍了刺激培养的巨噬细胞，使其获得释放促进神经突生长的分子因子能力的实验步骤。在神经元-巨噬细胞共培养体系中加入cAMP处理，可诱导巨噬细胞产生具有强效促进神经突生长活性的条件培养基。

摘要

有充分证据表明，巨噬细胞可参与受损神经系统的再生或修复过程。本文介绍了一种诱导巨噬细胞产生促进神经突生长的条件培养基（CM）的实验方案。首先对成年背根神经节（DRG）神经元进行急性分离并接种培养。待神经元稳定贴壁后，将腹腔巨噬细胞接种于细胞培养小室中，并将其置于同一孔板的神经元培养孔上方进行共培养。共培养体系中加入二丁酰环磷酸腺苷（db-cAMP）处理24小时，随后将含有巨噬细胞的培养小室转移至另一新孔中继续培养72小时以收集条件培养基。将该db-cAMP处理后的共培养体系所获得的条件培养基应用于另一独立的成年DRG神经元培养体系时，可显著促进神经突的生长。而由db-cAMP单独处理的单一细胞类型（仅DRG神经元或仅腹腔巨噬细胞）所获得的条件培养基，则未表现出促进神经突生长的活性。这表明，神经元与巨噬细胞之间的相互作用对于激活巨噬细胞、促使其向条件培养基中分泌具有促进神经突生长活性的分子因子至关重要。因此，本共培养模型也可用于研究神经元与巨噬细胞间相互作用中的细胞间信号传导机制，以促进巨噬细胞获得促再生表型。

引言

已有多种研究致力于增强中枢神经系统在脊髓或脑损伤后的轴突再生。神经系统损伤后不可避免地伴随炎症反应，传统观点认为这些炎症反应参与了继发性病理过程，从而导致有害后果^1,2。事实上，能够抑制炎症反应的甲基泼尼松龙是目前唯一被批准用于急性脊髓损伤治疗的疗法³。然而，近期研究提供了证据表明，作为典型炎症细胞的巨噬细胞，可参与受损神经系统的再生或修复过程^4,5,6。例如，晶状体损伤后浸润的巨噬细胞可产生促再生分子，促进视网膜节细胞的再生^7,8。此外，将背根神经节（DRG）神经元移植至经酵母聚糖激活巨噬细胞的区域，可显著增强轴突生长⁹。而且，损伤部位的巨噬细胞可为受损的周围神经创造有利于生长的微环境¹⁰。

我们的研究还提供了强有力的证据，表明巨噬细胞能够促进邻近神经元轴突再生的能力。我们已证明，在背根神经节（DRG）中巨噬细胞的激....

方案

所有涉及动物的实验均经亚洲大学医学院机构动物护理和使用委员会批准。

1. 分离成年背根神经节神经元的培养准备

1. 在准备培养前，用多聚赖氨酸（poly-D-lysine）和层粘连蛋白（laminin）预包被一个6孔板。将6孔板与0.01%的多聚赖氨酸在37°C孵育2小时，或在4°C过夜。然后用蒸馏水洗涤板两次。
2. 将板与浓度为3 µg/mL的层粘连蛋白溶液在室温下孵育2小时，随后用蒸馏水洗涤板两次。在室温下干燥板至少1小时。
3. 使用连接压缩二氧化碳（CO₂）气瓶的透明CO₂安乐死舱对小鼠实施安乐死。用手术刀切开覆盖脊柱的皮肤，并双侧解剖椎旁肌肉以暴露椎骨。使用尖端较窄的手术咬骨钳仔细去除椎骨，直至背根神经节（DRGs）完全暴露。
   注意：成年DRG神经元来源于8至12周龄的成年雄性C57BL6小鼠。
4. 在解剖显微镜下，使用虹膜剪和细尖镊子从S1水平至C1水平双侧取出背根神经节（DRGs）。尽量将神经根从DRGs上完全剪除，以最大限度减少施万细胞或成纤维细胞的污染。
5. 将解剖得到的DRGs置于含有5 mL冷的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）的60 mm培养皿中，并置于冰上，直至收集完所有DRGs。
   注意：必须尽快完成DRGs的解剖。从一只小鼠收集所有DRGs的时间不应超过30分钟。在实施安乐死后30分钟....

结果

我们描述了一种可生成能够分泌具有促进神经突生长活性分子因子的巨噬细胞的实验方案。将db-cAMP处理的共培养体系所获得的巨噬细胞条件培养基（CM）应用于独立的背根神经节（DRG）神经元培养时，可显著促进神经突的生长（图2A）。相比之下，在15小时的培养时间内，来自PBS处理共培养体系的CM未能诱导神经突生长（图2B）。当仅对巨噬细胞单独培养体系施加db-cAMP处理时，所获得的CM亦不能有效支持神经突生长（图2C）。这表明，神经元-巨噬细胞之间的相互作用对于激活巨噬细胞获得促再生能力至关重要。我们还检测了仅用db-cAMP处理神经元的培养体系所获得的CM，结果同样未观察到神经突生长现象（图2D）。

讨论

该共培养系统的建立包含多个关键步骤。必须确保小鼠背根神经节（DRG）神经元和腹腔巨噬细胞新鲜且状态良好。我们发现，若所有DRG的解剖过程超过30分钟，条件培养基（CM）中神经突的生长活性会明显下降。此外，腹腔巨噬细胞中若混有血液成分，也会导致CM中神经突生长活性降低。为了通过db-cAMP有效诱导神经元与巨噬细胞之间的强烈相互作用，充分洗涤是至关重要的步骤，以彻底清除组织碎片，并去除可能残留的细胞毒性成分（如胶原酶或红细胞裂解缓冲液）。另一个需要再次强调的要点是，应尽可能去除附着在DRG上的神经根残余。残留的根段会增加DRG神经元培养中施万细胞的污染。施万细胞在培养过程中可产生大量神经营养因子，可能干扰实验结果。

在本实验方案中，将分离的巨噬细胞接种在细胞培养小室上，而背根神经节（DRG）神经元则接种在孔板底部，两者通过细胞培养小室隔开。我们之前的研究显示，在直接共培养（允许两种细胞间发生物理接触）与使用细胞培养小室将两种细胞分隔开的共培养体系中，所收集的条件培养基对神经突生长活性的影响程度无显著差异¹¹。该结果表明，神经元与巨噬细胞.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养小室 透明PET膜 0.4μm 孔径大小	康宁，Falcon	353090	透明PET膜，孔径0.4-μm 孔径，适用于 6 孔板
70-μm 尼龙细胞滤网	康宁，Falcon	352350
8孔培养板	Biocoat	354632	使用多聚-D-赖氨酸均匀包被
红细胞裂解缓冲液	Qiagen	158904
胶原酶来自 Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9407-100MG
Neurobasal 培养基	赛默飞世尔科技，Gibco	21103-049	含1%谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素
B-27添加剂，无血清	赛默飞世尔科技，Gibco	17504-044	细胞外液
Glutamax	赛默飞世尔科技，Gibco	35050-061
青霉素-链霉素	赛默飞世尔科技，Gibco	15140-122
聚-D-赖氨酸氢溴化物	Sigma-Aldrich	P6407-5MG
层粘连蛋白	赛默飞世尔科技，英坦科技	23017-015
腺苷3',5'-单磷酸, N6,O2'-二丁酰基-, 钠盐	默克密理博公司，Calbiochem	28745
10% 正常山羊血清	赛默飞世尔科技	16210072
Triton-X-100	大贞化学金属公司	8566-4405
抗 β III 微管蛋白（Tuj-1）	普洛麦格公司	G7121	小鼠单克隆抗体
山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗	赛默飞世尔科技，英坦奇	A11005
血细胞计数板	马里恩费尔德-高级	N/A
细胞培养 CO2 培养箱	松下	N/A
体视显微镜	卡尔·蔡司	Stemi DV4
摇床振荡器	FINEPCR	Tw3t
台式离心机	Sorvall	N/A
共聚焦显微镜	奥林巴斯美国公司	IX71
FBS（胎牛血清）	VWR 国际，Hyclone	SH30919.03
弗里德曼-皮尔逊咬骨钳	FST（Fine Science Tools）	16021-14	不锈钢，14厘米，弯曲，单关节操作
精细剪刀 - 碳化钨 & ToughCut	FST（Fine Science Tools）	14558-11	锋利，锯齿状
Dumont #7 镊子	FST（Fine Science Tools）	11272-30	Dumoxel，0.07 × 0.04 mm，弯曲型
万纳斯弹簧剪	FST（Fine Science Tools）	15000-00	直刃，3 mm 切割边缘，锋利
Qualitron DW-41 微型离心机	Artisan Technology Group	DW-41	输入电压：115VAC