本实验方案介绍了刺激培养的巨噬细胞，使其获得释放促进神经突生长的分子因子能力的实验步骤。在神经元-巨噬细胞共培养体系中加入cAMP处理，可诱导巨噬细胞产生具有强效促进神经突生长活性的条件培养基。
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摘要
摘要
有充分证据表明，巨噬细胞可参与受损神经系统的再生或修复过程。本文介绍了一种诱导巨噬细胞产生促进神经突生长的条件培养基（CM）的实验方案。首先对成年背根神经节（DRG）神经元进行急性分离并接种培养。待神经元稳定贴壁后，将腹腔巨噬细胞接种于细胞培养小室中，并将其置于同一孔板的神经元培养孔上方进行共培养。共培养体系中加入二丁酰环磷酸腺苷（db-cAMP）处理24小时，随后将含有巨噬细胞的培养小室转移至另一新孔中继续培养72小时以收集条件培养基。将该db-cAMP处理后的共培养体系所获得的条件培养基应用于另一独立的成年DRG神经元培养体系时，可显著促进神经突的生长。而由db-cAMP单独处理的单一细胞类型（仅DRG神经元或仅腹腔巨噬细胞）所获得的条件培养基，则未表现出促进神经突生长的活性。这表明，神经元与巨噬细胞之间的相互作用对于激活巨噬细胞、促使其向条件培养基中分泌具有促进神经突生长活性的分子因子至关重要。因此，本共培养模型也可用于研究神经元与巨噬细胞间相互作用中的细胞间信号传导机制，以促进巨噬细胞获得促再生表型。
引言
已有多种研究致力于增强中枢神经系统在脊髓或脑损伤后的轴突再生。神经系统损伤后不可避免地伴随炎症反应，传统观点认为这些炎症反应参与了继发性病理过程，从而导致有害后果1,2。事实上，能够抑制炎症反应的甲基泼尼松龙是目前唯一被批准用于急性脊髓损伤治疗的疗法3。然而，近期研究提供了证据表明，作为典型炎症细胞的巨噬细胞，可参与受损神经系统的再生或修复过程4,5,6。例如，晶状体损伤后浸润的巨噬细胞可产生促再生分子，促进视网膜节细胞的再生7,8。此外，将背根神经节（DRG）神经元移植至经酵母聚糖激活巨噬细胞的区域，可显著增强轴突生长9。而且，损伤部位的巨噬细胞可为受损的周围神经创造有利于生长的微环境10。
我们的研究还提供了强有力的证据，表明巨噬细胞能够促进邻近神经元轴突再生的能力。我们已证明，在背根神经节（DRG）中巨噬细胞的激活，对于外周神经预损伤后DRG感觉神经元再生能力增强至关重要11。另一实验室也独立报道了类似的研究结果12。我们还发现，注射二丁酰环磷酸腺苷（db-cAMP）——一种已知可增强轴突再生能力的分子13——可诱导背根神经节内巨噬细胞的活化。当巨噬细胞被抑制后，db-cAMP对神经突起生长的促进作用即被消除。后续研究进一步确定，神经元在损伤后表达的CCL2是激活具有促再生表型巨噬细胞的信号分子14,15。
根据上述实验结果，我们已建立了一种 体外 模拟背根神经节在预处理损伤模型后发生的分子事件的模型11,14在此模型中，将db-cAMP施加于神经元-巨噬细胞共培养体系，引发细胞间信号传导，从而诱导巨噬细胞活化为具有促再生表型的形态。本文中，我们详细描述了可生成分泌促进神经突生长分子因子的巨噬细胞的实验方案图1）该实验模型阐明了一种概念，即巨噬细胞可在神经系统损伤后被刺激或诱导，以支持轴突再生。我们的模型还将有助于研究导致促再生型巨噬细胞活化的细胞间信号传导机制。
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方案
所有涉及动物的实验均经亚洲大学医学院机构动物护理和使用委员会批准。
1. 分离成年背根神经节神经元的培养准备
- 在准备培养前，用多聚赖氨酸（poly-D-lysine）和层粘连蛋白（laminin）预包被一个6孔板。将6孔板与0.01%的多聚赖氨酸在37°C孵育2小时，或在4°C过夜。然后用蒸馏水洗涤板两次。
- 将板与浓度为3 µg/mL的层粘连蛋白溶液在室温下孵育2小时，随后用蒸馏水洗涤板两次。在室温下干燥板至少1小时。
- 使用连接压缩二氧化碳（CO2）气瓶的透明CO2安乐死舱对小鼠实施安乐死。用手术刀切开覆盖脊柱的皮肤，并双侧解剖椎旁肌肉以暴露椎骨。使用尖端较窄的手术咬骨钳仔细去除椎骨，直至背根神经节（DRGs）完全暴露。
注意：成年DRG神经元来源于8至12周龄的成年雄性C57BL6小鼠。 - 在解剖显微镜下，使用虹膜剪和细尖镊子从S1水平至C1水平双侧取出背根神经节（DRGs）。尽量将神经根从DRGs上完全剪除，以最大限度减少施万细胞或成纤维细胞的污染。
- 将解剖得到的DRGs置于含有5 mL冷的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）的60 mm培养皿中，并置于冰上，直至收集完所有DRGs。
注意：必须尽快完成DRGs的解剖。从一只小鼠收集所有DRGs的时间不应超过30分钟。在实施安乐死后30分钟，即使仍有未收集的DRGs，也应停止收集并进入下一步操作。 - 使用剪去末端的蓝色移液器吸头（1000 µL）将DRGs转移至1.5 mL离心管中。使用小型离心机短暂离心数秒后弃去DMEM。加入1 mL含有125 U/mL XI型胶原酶的DMEM，并将离心管置于37°C培养箱中，在摇床上以35–40 rpm轻柔旋转孵育90分钟。使用胶带将离心管固定在摇床底部。
- 弃去含胶原酶的DMEM，加入1 mL新鲜DMEM。等待漂浮的DRGs完全沉降至管底后，小心吸除含有组织碎片的DMEM。重复此洗涤步骤至少六次。
注意：不要试图完全弃去上清液。注意避免将DRGs随上清DMEM一同移除。 - 使用剪去末端的蓝色移液器吸头（1000 µL）将DRGs转移至15 mL锥形管中。然后使用蓝色吸头（1000 µL）轻柔吹打至少15次，以形成均匀的细胞悬液。避免产生气泡，并尽量不要让移液器吸头接触锥形管底部。
- 以239 × g离心3分钟，小心弃去含有漂浮碎片的上清液。加入1 mL添加了B27（2.0% v/v）的Neurobasal培养基，通过轻柔吹打5至10次重悬细胞沉淀。
- 将细胞悬液通过覆盖在50 mL锥形管上的70 µm细胞筛网过滤。等待2分钟后，使用移液器控制器将Neurobasal/B-27培养基缓慢加至筛网上方。
- 将所有收集的DRG神经元（约相当于一只小鼠来源的2 × 106个DRG神经元）接种至6孔板的两个孔中。一只成年小鼠的DRG神经元可覆盖6孔板中的两个孔。随后将培养板置于37°C的CO2培养箱中，直至进行巨噬细胞共培养。
2. 在细胞培养小室中与原代腹腔巨噬细胞共培养
注意：在解离的背根神经节神经元初次接种后 4 小时建立共培养体系
- 从8至12周龄的成年C57BL6雄性小鼠中分离原代腹腔巨噬细胞。将动物置于CO2麻醉箱中实施安乐死。小心切开腹部皮肤，暴露腹膜，避免划破腹膜以防止灌洗液泄漏。
- 使用带有22G针头的注射器穿刺腹膜，向腹腔内注入10 mL冰上预冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。轻柔按摩腹腔1-2分钟。然后拔出针头，通过穿刺孔挤出PBS，并将灌洗液收集至50 mL锥形管中。
注意：使用前应将注射器置于冰上，以维持PBS的低温状态。 - 将收集的灌洗液在4 °C条件下以239 × g离心10分钟，沉淀细胞成分。用3 mL红细胞裂解缓冲液（RBC lysis buffer）重悬沉淀，在室温下孵育3分钟。随后再次在4 °C条件下以239 × g离心10分钟。用3 mL PBS重悬细胞沉淀，并再次离心以彻底去除残留的红细胞裂解缓冲液。
注意：务必确保完全去除红细胞裂解缓冲液，否则残留物可能对培养的巨噬细胞产生毒性。 - 将细胞沉淀重悬于1 mL Neurobasal/B-27培养基中。将所收集巨噬细胞的一半（总计3 × 106 至 6 × 106 个细胞）接种至细胞培养小室（有效面积为4.2 cm2）上，并将该小室置于已分离的背根神经节（DRG）培养孔上方进行共培养。
注意：在共培养期间，巨噬细胞在Neurobasal/B-27神经元培养基中生长，已证实在此条件下巨噬细胞可良好存活。
3. Db-cAMP 处理及巨噬细胞条件培养基的收集
注意：在神经元-巨噬细胞共培养 4 小时后开始 db-cAMP 处理。
- 向神经元-巨噬细胞共培养体系中加入 2 µL 的 100 µM db-cAMP 溶液。对照实验中加入相同体积的 PBS。
- 24 小时后，在同一 6 孔板中将一个空孔加入 1 mL 巨噬细胞培养基。将神经元-巨噬细胞共培养体系中的细胞培养小室转移至含有巨噬细胞培养基的空孔中。保持相同培养条件，72 小时内不更换培养基。
注意：我们在收集条件培养基（CM）时仅加入 1 mL 巨噬细胞培养基，以获得浓缩的 CM。在收集 CM 过程中，如有需要，可额外添加培养基以完全覆盖插入小室内的巨噬细胞。 - 72 小时后，将巨噬细胞条件培养基在 239 × g 条件下离心 5 分钟，以去除细胞成分。将上清液经 0.2-µm 滤膜过滤，以清除残留的细胞碎片。收集的条件培养基储存于 -70 °C，待后续使用。
4. 利用收集的条件培养基进行神经突生长实验
- 在建立独立的成年大鼠背根神经节（DRG）神经元培养之前，按照 1.1 和 1.2 中所述相同步骤预先包被 8 孔腔室载玻片。
- 使用 1.3 至 1.10 中所述相同方法，在添加 B27 的 Neurobasal 培养基中获取解离的成年 DRG 神经元。每孔接种 5 × 104 个细胞至预先包被的 8 孔腔室载玻片中。
- 将腔室载玻片置于 37 °C 培养箱中孵育 2 小时，使细胞贴附于底部。随后，更换为预热至 37 °C 的解冻条件培养基（CM）。
注意：在移除培养基和加入收集的 CM 时，需小心避免触碰 8 孔腔室载玻片的底部。 - 初次接种后 15 小时，移除培养基，并用 PBS 洗涤细胞一次。然后向各孔加入 200 µL 冰冷的 4% 多聚甲醛溶液，在 4 °C 下固定细胞 20 分钟。
注意：用于轴突发芽实验的 DRG 神经元培养必须精确控制在 15 小时。在此条件下，几乎无明显轴突发芽现象。 - 用冰冷 PBS 洗涤三次，随后用含 0.1% Triton-X 的 10% 正常山羊血清（NGS）在室温下封闭 30 分钟。将固定后的细胞与用 10% NGS 稀释的一抗（抗-Tuj-1）溶液（浓度为 1 µg/mL）在室温孵育 4 小时，或在 4 °C 过夜孵育。
- 用 PBS 洗涤三次，然后在室温下与二抗（山羊抗小鼠）溶液孵育 2 小时。再用 PBS 洗涤两次，使用封片液将培养载玻片用盖玻片（24 × 50 mm）封片。
- 使用荧光显微镜拍摄图像以观察轴突发芽情况。
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结果
我们描述了一种可生成能够分泌具有促进神经突生长活性分子因子的巨噬细胞的实验方案。将db-cAMP处理的共培养体系所获得的巨噬细胞条件培养基（CM）应用于独立的背根神经节（DRG）神经元培养时，可显著促进神经突的生长（图2A）。相比之下，在15小时的培养时间内，来自PBS处理共培养体系的CM未能诱导神经突生长（图2B）。当仅对巨噬细胞单独培养体系施加db-cAMP处理时，所获得的CM亦不能有效支持神经突生长（图2C）。这表明，神经元-巨噬细胞之间的相互作用对于激活巨噬细胞获得促再生能力至关重要。我们还检测了仅用db-cAMP处理神经元的培养体系所获得的CM，结果同样未观察到神经突生长现象（图2D）。
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讨论
该共培养系统的建立包含多个关键步骤。必须确保小鼠背根神经节（DRG）神经元和腹腔巨噬细胞新鲜且状态良好。我们发现，若所有DRG的解剖过程超过30分钟，条件培养基（CM）中神经突的生长活性会明显下降。此外，腹腔巨噬细胞中若混有血液成分，也会导致CM中神经突生长活性降低。为了通过db-cAMP有效诱导神经元与巨噬细胞之间的强烈相互作用，充分洗涤是至关重要的步骤，以彻底清除组织碎片，并去除可能残留的细胞毒性成分（如胶原酶或红细胞裂解缓冲液）。另一个需要再次强调的要点是，应尽可能去除附着在DRG上的神经根残余。残留的根段会增加DRG神经元培养中施万细胞的污染。施万细胞在培养过程中可产生大量神经营养因子，可能干扰实验结果。
在本实验方案中，将分离的巨噬细胞接种在细胞培养小室上，而背根神经节（DRG）神经元则接种在孔板底部，两者通过细胞培养小室隔开。我们之前的研究显示，在直接共培养（允许两种细胞间发生物理接触）与使用细胞培养小室将两种细胞分隔开的共培养体系中，所收集的条件培养基对神经突生长活性的影响程度无显著差异11。该结果表明，神经元与巨噬细胞...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本方案由大韩民国未来创造科学部与信息通信技术部资助，资助编号为 NRF-2015R1A2A1A01003410。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养小室 透明PET膜 0.4μm 孔径大小 | 康宁，Falcon | 353090 | 透明PET膜，孔径0.4-μm 孔径，适用于 6 孔板 |
| 70-μm 尼龙细胞滤网 | 康宁，Falcon | 352350 | |
| 8孔培养板 | Biocoat | 354632 | 使用多聚-D-赖氨酸均匀包被 |
| 红细胞裂解缓冲液 | Qiagen | 158904 | |
| 胶原酶来自 Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
| Neurobasal 培养基 | 赛默飞世尔科技，Gibco | 21103-049 | 含1%谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素 |
| B-27添加剂，无血清 | 赛默飞世尔科技，Gibco | 17504-044 | 细胞外液 |
| Glutamax | 赛默飞世尔科技，Gibco | 35050-061 | |
| 青霉素-链霉素 | 赛默飞世尔科技，Gibco | 15140-122 | |
| 聚-D-赖氨酸氢溴化物 | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| 层粘连蛋白 | 赛默飞世尔科技，英坦科技 | 23017-015 | |
| 腺苷3',5'-单磷酸, N6,O2'-二丁酰基-, 钠盐 | 默克密理博公司，Calbiochem | 28745 | |
| 10% 正常山羊血清 | 赛默飞世尔科技 | 16210072 | |
| Triton-X-100 | 大贞化学金属公司 | 8566-4405 | |
| 抗 β III 微管蛋白（Tuj-1） | 普洛麦格公司 | G7121 | 小鼠单克隆抗体 |
| 山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗 | 赛默飞世尔科技，英坦奇 | A11005 | |
| 血细胞计数板 | 马里恩费尔德-高级 | N/A | |
| 细胞培养 CO2 培养箱 | 松下 | N/A | |
| 体视显微镜 | 卡尔·蔡司 | Stemi DV4 | |
| 摇床振荡器 | FINEPCR | Tw3t | |
| 台式离心机 | Sorvall | N/A | |
| 共聚焦显微镜 | 奥林巴斯美国公司 | IX71 | |
| FBS（胎牛血清） | VWR 国际，Hyclone | SH30919.03 | |
| 弗里德曼-皮尔逊咬骨钳 | FST（Fine Science Tools） | 16021-14 | 不锈钢，14厘米，弯曲，单关节操作 |
| 精细剪刀 - 碳化钨 & ToughCut | FST（Fine Science Tools） | 14558-11 | 锋利，锯齿状 |
| Dumont #7 镊子 | FST（Fine Science Tools） | 11272-30 | Dumoxel，0.07 × 0.04 mm，弯曲型 |
| 万纳斯弹簧剪 | FST（Fine Science Tools） | 15000-00 | 直刃，3 mm 切割边缘，锋利 |
| Qualitron DW-41 微型离心机 | Artisan Technology Group | DW-41 | 输入电压：115VAC |
参考文献
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