利用荧光排阻法及专用微流控装置实现神经元的高分辨率体积成像

摘要

体积是反映细胞生理与病理特征的重要参数。我们介绍一种荧光排阻法，可实现全场范围的体积测量 体外 具有亚微米级轴向分辨率的神经元体积成像，可用于分析神经突及参与神经元生长的动态结构。

摘要

体积是衡量神经元在不同时间尺度下生理与病理特征的重要参数。由于神经元具有高度分支的复杂形态，属于结构独特的细胞类型，因此在体积测量方面带来诸多方法学上的挑战。在特定情况下 体外 神经元生长研究中，所选方法应具备亚微米级轴向分辨率，并能在数分钟至数小时乃至数天的时间尺度上实现全场域观测。与其他方法（如使用共聚焦成像进行细胞形态重建、基于电学的测量或原子力显微镜）相比，近年来发展的荧光排阻法（Fluorescence eXclusion method, FXm）有望满足上述要求。然而，尽管其原理简单，实现用于神经元的高分辨率FXm仍需多项调整并建立专门的方法体系。本文介绍一种结合荧光排阻、低粗糙度多隔室微流控装置以及微图案化技术的方法，以实现 体外 局部神经元体积的测量。该设备提供的高分辨率使我们能够测量神经元突起（neurites）的局部体积，以及参与神经元生长的某些特定结构（如生长锥，GCs）的体积。

引言

近年来，细胞体积的精确认知受到越来越多的关注，这一研究兴趣源于单细胞微生物中的细胞大小稳态问题¹，以及更广泛意义上的有丝分裂细胞中的类似问题²。然而，细胞体积的问题同样适用于终末分化后的细胞，其中神经元即为一个典型的范例。

体积确实是神经元生命过程中不同尺度和时间点上生理与病理事件的重要特征，从与电活动相关的瞬时轴突形变（毫秒级）³，到神经退行性疾病无症状期发生的不可逆神经元肿胀（在人类中可持续数年）⁴，均体现了这一点。然而，最大幅度的体积变化发生在神经元生长期间，时间尺度为数天至数周（取决于所研究的生物体）。神经元复杂而延伸的形态引发了一系列问题，其中就包括细胞大小的调控。体内轴突的长度和直径受到严格调控，其数值因神经元类型而异^5,6。

这些问题错综复杂，难以解决 体内，也可以通过简化的方式解决 体外 为此目的，需采用一种专用于体积测量的方法，其速度足以跟踪生长动态（即 在数分钟的时间尺度内完成，并能够兼容数小时或数天的持续观察。多年来已开发出多种方法，以实现对细胞体积的直接或间接测量 体外共聚焦成像的细胞重建是其中一种方法，但该方法需要进行标记并反复暴露于光照，且轴向分辨率有限，约为500 nm ⁷需要注意的是，一种更为复杂且近期出现的方法——晶格光片显微镜，在一定程度上克服了上述最后两个缺点。 ⁸原子力显微镜已被用于 ⁹ 但这种扫描方法本质上缓慢且繁琐。此外，由于神经元极度柔软，该方法所需的细胞物理接触可能干扰测量结果。 ¹⁰采用阻抗或共振的间接方法已用于不同类型细胞的研究 ¹¹但对于神经元等具有较长黏附性的细胞而言，则显得不足。

最有前景的方法之一是基于测量充满荧光染料的密闭腔室内细胞的排开体积。荧光排阻法（FXm）原理简单，无需标记，适用于对细胞群体进行快速、长期的光学成像，并有望实现亚光学轴向分辨率。更准确地说，z方向的分辨率取决于培养腔室内的最大荧光强度（即无细胞区域）除以相机的动态范围，尽管多种噪声来源限制了这一极限分辨率。该方法在追踪迁移性贴壁细胞的体积变化¹²，或研究哺乳动物细胞有丝分裂过程中的体积变化方面已表现出强大能力，如文献¹³中详尽描述。然而，由于神经元具有广泛延伸至亚微米级突起的复杂分支结构，这对FXm构成了方法学上的挑战。

本文介绍一种用于制备光滑FXm腔室的方法，可高精度测量神经元分支以及生长锥等参与神经元生长的动态结构的体积和高度。

为了优化轴向分辨率，腔室的高度应与待测物体相近。因此，我们设计了多种FXm装置，其特征在于具有三种不同高度的中央测量腔室。最薄的一种（高度为3 µm）专用于神经突的测量：这种低高度设计可排除胞体，使其停留在邻近高度约为15 µm的中间腔室内。较厚的中央腔室（10 和 12 µm）则足够高，可用于追踪整个细胞的生长过程。该装置还在中央腔室两侧设有两个储液池。因此共设置了四个注入孔（IH），具体命名如下：入口和出口用于将细胞悬液引入芯片，另外两个则用于向储液池供液。

我们首先利用已知几何结构的光刻胶结构制备了用于高度测量的校准盖玻片。随后，我们对自由生长的神经元以及被微图案化黏附结构在形态上加以限制的神经元进行了成像。

方案

本研究严格遵循欧洲共同体关于实验动物护理和使用的指导方针（86/609/EEC）。研究目的和实验方案已详细描述于ERCadg项目CellO的伦理附件中，该附件已获得ERCEA的批准，并接受其定期审查。居里研究所动物实验中心已获得许可证号#C75-05-18（2012年4月24日），并隶属于巴黎中心与南部动物实验伦理委员会（国家注册编号：#59）。

1. 模具的制备

注意：该模具包含中央腔室和中间腔室，分别连接一个入口和一个出口，此外在中央腔室两侧还设有两个储液池（及对应的入口）。

1. 使用平头镊子操作直径为 51 mm 的硅片，并将其从一个位置转移至另一位置。
2. 中央腔室硅模具
   1. 用正性光刻胶填充一支 2 mL 塑料移液管。将移液管置于直径为 51 mm 的硅片中心，按压其储液部，使光刻胶覆盖约 75% 的硅片表面。以 3000 rpm 旋涂 30 秒。
   2. 将硅片从旋涂仪转移至表面温度为 100 °C 的加热板上，加热 50 秒。
   3. 将硅片从加热板转移至掩模对准仪的基底夹具（卡盘）上。通过“DRIE 掩模”进行曝光（参见补充文件“masks_neuron_volume_chips.tiff”和“masks_neuron_volume_chips.dxf”）。
   4. 将硅片从卡盘上取下，浸入盛有显影液（去离子水中按 1:4 稀释）的 100 mL 玻璃结晶皿中。释放硅片，并在持续轻柔搅拌结晶皿的条件下保持 1 分钟。
      注意：为节约试剂，结晶皿中液体高度最多填充至 1 cm。
   5. 从显影液中取出硅片，浸入盛有去离子水的 100 mL 结晶皿中约 10 秒。然后将硅片置于吸水纸上，使用氮气吹枪以加压氮气吹干。
   6. 将硅片置于表面温度为 115 °C 的加热板上加热 50 秒。
   7. 采用以下参数进行深反应离子刻蚀（DRIE）（有关 DRIE 技术的更多信息可参见参考文献 ¹⁴ 和 ¹⁵）；钝化步骤：C4F8 流量 50 sccm，He 背压流量 10 sccm，CP 功率 10 W，电感耦合等离子体（ICP）1500 W，总压力 24 mbar，温度 18 °C；刻蚀步骤：SF6 流量 100 sccm，He 背压流量 10 sccm，CP 功率 11 W，ICP 1500 W，总压力 24 mbar，温度 18 °C；钝化时间：4 秒；刻蚀时间：7 秒；总工艺时长：通常 5 分钟可实现约 10 µm 的刻蚀深度。
   8. 将基底浸入盛有丙酮的结晶皿中，溶解光刻胶。
   9. 将硅片浸入 piranha 溶液（2/3 体积的 H₂O₂（30%）和 1/3 体积的 H₂SO₄（95%））中 5 分钟。
      注意：始终先加入 H₂O₂，再加入 H₂SO₄，清洗后需用去离子水至少冲洗 3 次。
3. 按照 表 1-3 所列参数，执行步骤 1.2.1 至 1.2.11，制备对应于中间腔室的模具。
   注意：每张表格对应一种特定器件，其特征为中央观察腔室具有特定高度。
   注意：整个工艺应按光刻胶厚度递增的顺序进行（每种器件依次使用掩模 1 至 3，参见补充文件“masks_neuron_volume_chips.tiff”和“masks_neuron_volume_chips.dxf”）。
   1. 将刻蚀后的硅片放置于旋涂仪的基底夹具上。
      1. 通过检查基底吸附是否有效，确认旋涂仪工作正常（在额定转速下，基底应能稳定旋转并保持位置固定）。
      2. SU-8 的黏度随目标厚度范围的增加而升高。应始终使用 20–30 mL 瓶装储存 SU-8 光刻胶，并在旋涂前将其倾倒于硅片上（SU-8 可能过于黏稠，无法用塑料移液管操作）。
   2. 将负性环氧型光刻胶 SU-8 倾倒于基底中心，直至覆盖约 75% 的硅片表面，然后根据表中“旋涂”行所列参数进行旋涂。
   3. 将涂覆后的硅片置于加热板上，加热时间和温度按表中“软烘”行所列参数执行。
   4. 将刻蚀后的硅片与相应的“SU-8 掩模”安装至掩模对准仪上。
   5. 利用各掩模上设计的专用对准十字（典型尺寸：50 µm × 150 µm）将刻蚀硅片与掩模对准。
      注意：器件每侧两个十字即可满足要求（左下角和右上角各一个）。
   6. 使用掩模对准仪的 I 线（波长 365 nm）进行曝光，曝光剂量按“曝光能量”行所列参数执行。
      注意：曝光时间通过将每种光刻胶特定的曝光能量 E 除以紫外灯的有效功率计算得出，该有效功率需根据掩模吸收率进行调制： × (1 - Absorption_mask)。柔性掩模的吸收率约为 20%，而铬硬掩模的吸收率可忽略不计。
   7. 将涂覆后的硅片置于加热板上，加热时间和温度按表中“后烘”行所列参数执行。
   8. 准备两个 100 mL 玻璃结晶皿，一个盛有显影液，另一个为空皿。将硅片浸入显影液中，时间按“显影”行所列参数执行。在整个显影过程中轻柔搅动结晶皿。
   9. 在空结晶皿上方用异丙醇喷淋硅片约 5 秒。最后将硅片置于吸水纸上，使用氮气吹枪以加压氮气吹干。
   10. 将涂覆后的硅片置于加热板上，加热时间和温度按表中“硬烘”行所列参数执行（可选）。
       注意：此步骤有助于防止光刻胶开裂，并为后续步骤提供均匀平整的表面。
   11. 重复步骤 1.3.1 至 1.3.10，完成 表 1-3 所列全部工艺流程。
   12. 在完成最后一次光刻工艺后，向直径 100 mm 的培养皿中，于母模两侧各滴加两滴 100 µL 的三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷，对由三层负性光刻胶构成的最终母模进行硅烷化处理。用塑料封口膜密封培养皿，在室温（RT）下孵育 20 分钟。
       注意：母模现已制备完成，可多次使用。

2. PDMS 芯片的制备

1. 将90 g硅基有机聚合物（聚二甲基硅氧烷：PDMS）倒入100 mL塑料杯中，加入10 g其固化剂（质量比1:10）。使用塑料移液管搅拌混合物2–3分钟。
   注意：制备6个芯片时，需将90 g PDMS与10 g固化剂混合。
2. 将混合物置于真空干燥器中，抽气约30分钟，以去除PDMS中夹带的气泡。
3. 将母模置于P100培养皿中，用注射器将15 mL混合物注入模具上。
   注意：15 mL混合物可使芯片总高度达到1.5 mm。
4. 将PDMS-模具结构放入真空干燥器中抽气，直至PDMS表面不再有气泡破裂为止。
   注意：此步骤约需30分钟。
5. 使用锥形头工具推动培养皿底部的晶圆，以避免晶圆下方产生未利用的PDMS体积。将PDMS-模具装置放入设定为70 °C的烘箱中，加热至少2小时。
6. 在化学通风橱内，使用不锈钢平头刮刀并配合向芯片表面倾倒异丙醇的方式脱模PDMS块，随后将其放置于通风橱内的不锈钢台面上。
7. 使用手术刀沿硅晶圆边缘切割，并将PDMS复制品脱模。
8. 使用手术刀或剃刀沿芯片边缘切割（保留2 mm边距）。
9. 用力按压直径为1.5 mm的打孔器，在芯片上打出进样口，并操作打孔器完成进样孔的切割与成型。在芯片上预留的四个液体注入区域重复相同操作。
10. 通过在微结构面粘贴并撕除胶带的方式清洁芯片，然后在芯片两面喷洒异丙醇，最后使用氮气吹枪以加压氮气吹干芯片。

3. 图案化盖玻片（24 × 24 mm²）的制备

注意：使用弯头镊子操作盖玻片。

1. 多聚鸟氨酸（PLO）图案
   1. 应用 O₂ 在玻璃盖玻片上进行等离子清洗。等离子参数：抽气压力：0.25 mbar；O₂₂ 供气时间：3 min；气体流量：10 sccm；最大偏差：±5 sccm；等离子体处理时间：3 min；设定压力：0.36 mbar；最大偏差：±0.10 mbar；设定功率：50 W；最大偏差：5%；放气时间：45 s。
   2. 将484 µL乙酸与56 µL 3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷混合，用无水乙醇定容至总体积15 mL。
   3. 使用1 mL尖嘴吸头，在每张盖玻片上各加一滴500 µL的溶液，静置2–3分钟，然后使用洁净室用超细纤维擦拭布干燥。
      注意：硅化玻璃盖玻片可在室温下保存于用塑料封口膜密封的塑料盒中，最长可保存1个月。
   4. 将每张盖玻片置于洁净室环境中的旋涂仪上。滴加一滴正性光刻胶，覆盖约75%的盖玻片表面（约500 µL），以4000 rpm旋涂30 s，获得最终厚度为0.45 µm的薄膜。
   5. 将盖玻片置于表面温度为115 °C的加热板上，持续1分钟。
   6. 使用掩模对准器，根据制造商参数，通过专用掩模在435 nm（G线）波长下对每个盖玻片进行曝光（紫外剂量约为50–60 mJ·cm⁻²）^-1)
   7. 准备2个玻璃结晶皿，一个装有显影剂（无需稀释），另一个装有去离子水。
   8. 将每张盖玻片逐一浸入显影液中，持续轻轻搅拌结晶皿，显影1分钟。随后将晶片浸入去离子水中约5秒。将晶片置于吸水纸上，使用压缩氮气枪吹干。
   9. 施加激活 O₂ 与3.1.1中相同参数的血浆
   10. 在培养皿内，于每个P100培养皿中滴加四滴170 µL的100 µg/mL PLO溶液。将盖玻片的图案面朝下置于每滴溶液上。用塑料封口膜密封培养皿以防止干燥。室温下孵育过夜。
       注意：PLO 溶液应通过毛细作用保持附着在盖玻片上。
   11. 准备四个接收器（通常为 P60 培养皿），其中三个加入 PBS，第四个加入去离子水。准备两个玻璃结晶皿，内盛纯乙醇。
   12. 从培养皿中取出每张盖玻片，浸入第一份 PBS 溶液中 10–15 秒，将盖玻片垂直靠在吸水纸上以吸除液体，随后将其插入 例如 将图案面朝上置于乙醇浴中。
       注意：一旦光刻胶溶解完成，将难以定位盖玻片上的图案化侧面。因此，在此阶段务必标记其位置。
   13. 将盛有乙醇的结晶皿置于超声波清洗仪（120 W / 35 kHz）中，超声处理3分钟以溶解光刻胶。
       注意：每处理4个盖玻片后更换一次乙醇浴，以减少PBS的稀释作用，避免影响光刻胶的溶解。
   14. 从乙醇溶液中取出盖玻片，然后将其在第二份 PBS 溶液中浸入数次。反复检查表面状态，直至由残留乙醇液膜形成的油状表面消失为止。
   15. 将盖玻片浸入第三份 PBS 溶液中 5–10 秒，随后立即转移至去离子水浴中。将盖玻片置于吸水纸上，使用氮气吹扫枪以加压氮气吹干。
       注意：最后一次用去离子水清洗是为了避免在干燥过程中形成 PBS 晶体。
2. 用于高度校准的光刻胶结构
   1. 仅使用专用掩膜（光刻胶条掩膜，参见补充文件“Mask_Photoresist-stripes.dxf”）执行步骤3.1.4至3.1.8。

4. 芯片组装与最终实施

1. 芯片在玻璃底培养皿中的组装
   1. 将PDMS芯片及其将要键合的玻璃培养皿一同放入等离子体腔室中进行表面活化。参数：抽气压力：0.25 mbar；O₂₂ 供气时间：3 分钟；气体流速：10 sccm；最大偏差：±5 sccm；等离子体处理时间：30 秒；设定压力：0.40 mbar；最大偏差：±0.10 mbar；设定功率：50 W；最大偏差：5%；放气时间：45 秒。
   2. 将活化后的PDMS芯片轻轻与玻璃盖玻片接触，并小心地在芯片边缘施加压力，使其与盖玻片粘合。为增强粘合强度，将装置置于70 °C烘箱中加热5至10分钟。
      注意：请勿按压含有支柱的部位，过度压力可能导致其坍塌。
   3. 在操作界面之下（即 在室温下（RT），封合后30分钟内，将装有100 µg/mL PLO溶液的10 µL吸头尖端置于神经接口（IHs）处，然后注入液体。调节注入体积，使每个IHs顶部形成液滴。随后，使用1 mL吸头尖端，在培养皿中芯片周围加入PBS。
   4. 让芯片在室温下孵育，至少2小时。若需过夜孵育，使用塑料封口膜密封培养皿以防止干燥。
      注意：液体不应泄漏到芯片外部，否则必须弃用该芯片。
   5. 用10-µL吸头轻轻按压每个IH中的锥形吸头，吸走多余液体。然后将锥形吸头完全插入出口，吸出剩余液体。
   6. 按照步骤4.1.5（排空）和4.1.3（填充）的说明，将PLO替换为层粘连蛋白（laminin）。室温孵育1小时。
   7. 按照步骤4.1.5（排空）和4.1.3（填充）的说明，用培养基替换层粘连蛋白。培养基成分：MEM 81.8%；100 mM 丙酮酸钠 1%；200 mM Glutamax 1%；马血清 5%；B27添加剂 2%；N2添加剂 1%；庆大霉素 0.2%；使用220 nm滤器过滤该溶液。使用1 mL吸头，同时将芯片周围浸泡的PBS替换为该培养基。
   8. 将芯片放入温度设定为 37 °C、CO₂ 浓度为 5% 的培养箱中₂ 在接种神经元前至少孵育5小时（或过夜）。
2. 使用图案化盖玻片进行芯片组装
   注意：如果图案化盖玻片包含正性光刻胶参考物，则执行步骤 4.2.1 至 4.2.9；否则，仅执行步骤 4.2.3，将 PDMS 装置粘附至 PLO 图案化盖玻片上（如步骤 4.1.2 所示），在芯片内部及周围加入培养基，然后进入步骤 4.2.10。
   1. 在矩形厚显微镜载玻片上滴加一滴水，通过毛细作用将盖玻片粘附于载玻片上（无图案面朝向载玻片）。在显微镜下，使用记号笔在载玻片背面标记光刻胶条纹的位置。
   2. 将带有图案的玻璃盖玻片放置在光刻对准仪的掩模固定架上。利用记号笔所做的标记对准光刻胶参考物，使其居中。
   3. 按照4.1.1节所述，对PDMS芯片进行等离子处理步骤。
   4. 将PDMS芯片放置在光刻对准仪的可移动基底支架（卡盘）上。
      注意：为增强光学对比度，可在PDMS芯片下方放置一片硅片。在对准过程中，硅片应牢固地固定在卡盘上（可使用透明胶带将其粘在卡盘上）。
   5. 将卡盘抬升至机械接触的极限位置，使芯片与盖玻片上光刻胶条阵列对齐。
   6. 通过抬起载物台，直至PDMS微柱表面接触玻璃盖玻片，从而实现芯片与盖玻片之间的机械接触。
   7. 降低卡盘。将已与芯片键合的盖玻片从掩模 holder 上取下。然后将装置放入35 mm培养皿中，并转移至烘箱（温度：70 °C）加热5至10分钟，以增强键合强度。
   8. 按照步骤4.1.3进行操作。
      注意：如果使用PLO模式化盖玻片，可直接从步骤4.2.7进入步骤4.2.9。
   9. 按照步骤4.1.5（排空）和4.1.3（填充）所述程序，用铺板培养基替换PLO。使用1 mL吸头，同时将芯片周围的PBS也替换为该培养基。
   10. 将芯片放入温度控制在37 °C、5% CO₂的培养箱中₂ 直至神经元接种，至少孵育5小时。

5. 神经元培养

1. 在200 mL塑料烧瓶中，将10 mL 10倍浓缩HBSS、2 mL 1 M Hepes与88 mL无菌水混合，配制100 mL解剖液（HH液）。
   注意：HH 培养基可在培养前一天配制。
2. 从经颈椎脱位处死的母鼠（来自 Charles Rivers 的 C57BL/6J 小鼠）体内取出 E18 小鼠胚胎，解剖分离海马体。解剖步骤如下 例如 详细说明在 ¹⁶.
3. 将海马体置于含有胰蛋白酶的塑料管中（0.3 mL 2.5% 胰蛋白酶，无EDTA，加入2.7 mL HH培养基），在37 °C下孵育10分钟，以启动化学解离。
4. 弃去大部分液体，使用一次性塑料移液管加入5至10 mL HH，重复3次。最后一次加入1 mL铺板培养基代替HH。
5. 使用1 mL枪头通过反复吸入和推出全部液体体积来机械解离组织，操作数次，避免产生气泡，且解离次数不超过15–20次。
6. 在另一个500 µL的容器中，将5 µL细胞悬液加入45 µL PBS中，制备成稀释液。使用10 µL移液器吸取1 µL该稀释液，将其注入Malassez计数板中。参照所提供的说明进行操作。 ¹⁷ 以估算细胞数量。
   注意：单个海马体通常可提供约 50 万个神经元。
7. 在室温下以 100 × g 离心 6 分钟。
8. 弃去上清液，并加入适量的铺板培养基，使细胞浓度达到1000万个细胞/mL。使用1 mL吸头反复吸取和排出细胞悬液，以充分重悬细胞。
9. 吸取芯片中的铺板培养基（参见步骤4.1.5）。使用10 µL移液器吸取2–3 µL新鲜重悬液，并将其注入入口（参见步骤4.1.3中所述的注入操作）。立即在出口重复相同操作。
10. 在每个储液槽中注入大致相同体积的铺板培养基（参见步骤 4.1.3）。
    注意：在显微镜下快速观察芯片，检查细胞密度。最佳细胞密度的数量级约为在由4根支柱限定的方形区域（约0.3 mm）内有5-10个细胞。², 即 每平方毫米约15-20个细胞²).
11. 最终，使用0.5–1 µL细胞悬液重复步骤5.10，以达到目标细胞密度。
12. 将接种好的芯片置于37 °C、5% CO₂的培养箱中₂.

6. 荧光排除观察

1. 成像培养基替换原培养基。
   1. 按照4.1.7节的方法制备成像培养基，但改用不含酚红的MEM，并添加荧光葡聚糖。具体操作为：将葡聚糖（分子量10,000 g/mol，储存液为PBS中10 mg/mL）稀释，使其在成像培养基中的终浓度为0.5–1 mg/mL。
      注意：使用吸收/发射峰值为496/524或650/668的葡聚糖偶联物。优先选用前者对0.45 µm高的正性光刻胶结构进行成像（以消除其在红光波段的自发荧光），选用后者对神经元进行成像（毒性较低）。
   2. 使用10 µL移液器排空所有入口，并用成像培养基完全重新填充（培养基更换的具体方法参见步骤4.1.3和4.1.5）。
2. 成像
   1. 将芯片置于配备环境培养室的倒置荧光显微镜下，培养室温度控制在 37 °C，CO₂ 浓度为 5%₂使用40倍、数值孔径（NA）0.8的干镜物镜，激发光强度为满功率的30%（满功率：3 W），曝光时间为30 ms。采集处于焦平面上的细胞图像（对于延时实验，可采集单幅或多幅连续图像）。
3. 图像分析
   1. 使用专用软件中的背景扣除程序对图像进行归一化处理，以获得均匀的背景。参见 ¹³ 有关该软件所包含的图像处理步骤的详细信息。输出图像为 .MAT 格式。
   2. 使用补充材料中提供的程序（conversion_mattotiff.m，该程序调用importfilevol.m），将.MAT文件转换为8位TIFF图像。
   3. 执行导入 > 在 ImageJ 中使用图像序列功能，将 .TIFF 图像合成为视频。
   4. 计算位于柱状结构（参考物体）中心的方形区域的平均强度 P，以及无细胞区域的腔室中方形区域的平均强度 B（背景， 即 高度为零）。参见 ¹⁸ 有关图像处理详细方法的示例。
      注意：用作强度参考的方形区域的边长应约为支柱直径的一半，以获得足够的像素数量，同时避免支柱边缘的光污染。
   5. 利用 P 和 B 值建立从强度的线性转换定律 i 至高度 h:
      
      与 h_c 已知的腔室高度， 和
      注意：PDMS 无明显自发荧光。
   6. 选择感兴趣区域周围的范围，使用 ImageJ 进行强度积分（参见 ¹⁹ 有关更多细节，请应用 6.3.5 中获得的转换定律来测量细胞区室的体积。
      注意：可根据肌动蛋白等亚细胞结构的荧光来选择目标区域， 例如，为在GFP-LifeAct神经元中选择生长锥，请在GFP发射通道中选取感兴趣区域，使用ROI管理工具保存该区域的轮廓，然后在葡聚糖（红色）的发射通道中测量同一区域内包含的细胞体积。

结果

第1和第2节所述制备过程的结果由以下图像展示 图1A-1B 以及曲线的 图1C. 表格的 图1D 显示PDMS芯片两个不同代表性区域的粗糙度值， 即 在中央以及20 µm高的相邻中间腔室中。通过使用蚀刻硅片替代SU-8光刻胶，表面粗糙度降低了约7倍。随后，首先将FXm应用于几何尺寸已知的光刻胶条带上。图2A) 在一个10 µm高的腔室内。经过图像处理及强度到高度的转换后（见图 图2B），沿此条带横截面测得的FXm分布图（图2C) 提供所需的高度轮廓 (图2D). 图 2D 显示了使用机械轮廓测量法和FXm方法获得的轮廓之间的比较。这些轮廓（包括边缘和平台值）非常相似，验证了该方法的可靠性。需要注意的是，FXm数据的散射并不反映该方法的最终分辨率，这一点将在后续评估中进一步说明。 图3 和 图4但结果源于所采用的低强度，以避免光刻胶在GFP通道中可能产生的极弱自发荧光的影响。

然后，我们观察了3 µm和10 µm高培养室中的神经突图3）。经过强度到高度的转换和背景校正后，背景噪声的标准偏差约为18 nm。该值略高于在硅表面铸造的PDMS表面的物理粗糙度（12 nm，见下表） 图1D）但远低于在SU-8模具制备的PDMS上测得的粗糙度。这些结果凸显了在硅片上钻孔以制备微柱，相较于在SU-8光刻胶上开孔的优势。如此低的粗糙度可实现高信噪比，从而获得清晰的三维图像，如图中所示。 图3A. 作为可从此类图像中获取数据的一个示例，我们计算了1.6 µm（即 10像素宽的神经突片段（见图表） 图3B）。使用这些数据的一阶线性拟合可得到平均神经突高度值约为 400 nm，可与之比较的是 例如 胼胝体中10日龄幼鼠发现的500 nm轴突直径 ⁵我们还将FXm与黏附微图案结合使用，该微图案由一系列长30 µm、宽2 µm和6 µm交替相接的条带组成。我们的目的是研究神经突宽度对其三维形态的影响。 图3C 显示了一个在10 µm高腔室中获得的完整神经元图像的伪彩色三维表征。神经突生长在2 µm和6 µm宽的条带上，而胞体位于最宽条带的末端。在三个不同横截面处绘制了高度轮廓图。与所示图表一致 图3A，横截面所积分的表面积随神经突宽度的增加而增大（图3D).

我们还关注了生长锥（GC）的三维结构。图4A-B展示了在3 µm高的腔室内获得的两种不同的GC轮廓，突出了其分支状的亚结构。此外，我们进行了延时实验，以追踪在12 µm高腔室内GC体积的动态变化。图4C显示了一个特定GC在数十分钟时间尺度内经历的收缩与再激活循环。得益于使用了GFP-lifeact小鼠，生长锥因其富含肌动蛋白而在GFP发射波长（510 nm）处被定位。利用该波长下识别出的表面区域，对647 nm处的葡聚糖发射波长信号进行积分，从而计算GC的体积。图4D最终展示了三个不同神经元上多个时间点和位置处GC体积的分布情况，其体积集中在约6 µm³左右。

图1：FXm PDMS腔室。 (A) 微加工四个主要步骤的示意图，最终形成模具。图中显示了入口、出口和储液池的位置。比例尺：1 mm。(B) 使用光学轮廓仪获得的PDMS FXm腔室图像。该图像显示了中央腔室，内含3排高10 µm的柱状结构，以及高度分别为20、50和90 µm的中间腔室。比例尺：500 µm。(C) 沿(B)图中两条虚线位置的芯片横截面视图。黄色/金色：沿柱状结构的横截面；蓝色：柱间区域的横截面。(D) 在硅基底上以及20 µm高的SU-8中间腔室上成型的PDMS表面粗糙度的平均值，测量区域为50 × 50 µm²（箭头指示这些区域的位置）。平均值来自三个不同区域的测量结果。请点击此处查看该图的高清版本。

图 2：使用光刻胶条带作为目标物体对 FXm 方法进行校准。 (A) 在高度为 10 µm 的腔室内拍摄的 GFP 荧光图像，腔室内含有在 488 nm 处吸收的 10,000 MW 右旋糖酐，浓度为 1 mg/mL。（B：背景，P：支柱）。使用干式 40X NA 0.8 物镜观察。比例尺：50 µm。 (B) 根据 (A) 中两个彩色矩形区域的平均强度获得的线性校准曲线。 (C) 沿 (A) 中蓝色虚线位置获取的荧光强度剖面图，穿过光刻胶条带（高度为 0.45 µm 的正性光刻胶）。 (D) 机械轮廓仪测得的剖面（黑点）与将 (B) 数据经强度到高度转换后由 FXm 获得的剖面（蓝点）的比较。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：神经突体积成像 （A） 神经突从位于相邻15 µm宽中间腔内的胞体延伸进入中央3 µm高的腔室。成像使用在488 nm处吸收的10,000 MW葡聚糖及40倍、数值孔径0.8的干式物镜完成。插图为经背景扣除程序处理后获得，用以突出显示两条神经突，并用于绘制右侧图表。比例尺：30 µm.（B） 神经突切片体积随神经突宽度的变化关系，数据来自22个轮廓（基于10个像素的平均值）， 即 在（A）中所示的1.6 µm“神经突切片”上。实线表示一条通过原点、斜率为0.4 µm的线性拟合。 (C) 在由交替的2 µm和6 µm宽凸起（以白色表示）构成的粘附条带上培养的图案化神经元的伪彩色图像。实验在高度为10 µm的腔室中进行，腔室内充满吸收波长为647 nm的10,000 MW葡聚糖，并使用40倍NA 0.8干式物镜进行测量。 （D） 与 (C) 中所示彩色虚线相对应的高度轮廓，保持相同的颜色编码。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图4：静态与动态生长锥成像。 (A-B) 在3 µm高腔室中，沿相关图像中黄色线条所示位置进行光强转高度换算后获得的生长锥高度分布图。实验使用吸收波长为488 nm的10,000 MW葡聚糖填充腔室，并采用40倍、数值孔径（NA）0.8的干式物镜进行观察。 (C) 在12 µm高且填充了吸收波长为647 nm的10,000 MW葡聚糖的腔室中对整个神经元进行成像。实验在两个荧光通道中完成：GFP通道用于定位生长锥（虚线黄色轮廓），CY5通道用于通过荧光排阻法计算生长锥（GC）体积。以虚线黄色轮廓所包围的表面积为基础计算GC体积。图中显示了GC体积随时间的变化情况，以及在两个代表性时间点上GFP和CY5通道中的相应形态。所有数据均使用40倍、NA 0.8干式物镜每3分钟采集一次。比例尺：10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

步骤	掩模 1：8 µm 层	掩模 2：30 µm 层	掩模 3：40 µm 层
SU-8 类型	2007	2025	2050
旋涂	30 秒 @ 2000 rpm	30 秒 @ 3050 rpm	30 秒 @ 3250 rpm
前烘	3 分钟 @ 95 °C	2 分钟 @ 65 °C + 6 分钟 @ 95 °C	3 分钟 @ 65 °C + 7 分钟 @ 95 °C
曝光能量	110 mJ/cm2	155 mJ/cm2	170 mJ/cm2
曝光后烘烤	4 分钟 @ 95 °C	1 分钟 @ 65 °C + 6 分钟 @ 95 °C	2 分钟 @ 65 °C + 7 分钟 @ 95 °C
显影	2 分 30 秒	5 分钟	6 分钟
坚膜烘烤（可选）	3–5 分钟 @ 200 °C	3–5 分钟 @ 200 °C	3–5 分钟 @ 200 °C

表1：用于制备包含12 μm高度中央腔室的装置的光刻步骤。 中间腔室的高度：20、50 和 90 µm。

步骤	掩模 1：10 µm 层	掩模 2：30 µm 层	掩模 3：40 µm 层
SU-8 类型	2007	2025	2050
旋涂	30 秒 @ 1500 rpm	30 秒 @ 3050 rpm	30 秒 @ 3250 rpm
前烘	3 分钟 @ 95 °C	2 分钟 @ 65 °C + 6 分钟 @ 95 °C	3 分钟 @ 65 °C + 7 分钟 @ 95 °C
曝光能量	125 mJ/cm2	155 mJ/cm2	170 mJ/cm2
曝光后烘烤	4 分钟 @ 95 °C	1 分钟 @ 65 °C + 6 分钟 @ 95 °C	2 分钟 @ 65 °C + 7 分钟 @ 95 °C
显影	2 分 30 秒	5 分钟	6 分钟
坚膜烘烤（可选）	3–5 分钟 @ 200 °C	3–5 分钟 @ 200 °C	3–5 分钟 @ 200 °C

表2：用于构建包含10 μm高度中央腔室的装置的光刻步骤。 中间腔室的高度：20、50 和 90 µm。

步骤	掩模 1：12 µm 层	掩模 2：32 µm 层	掩模 3：40 µm 层
SU-8 类型	2015	2025	2050
旋涂	30 秒 @ 3250 rpm	30 秒 @ 2500 rpm	30 秒 @ 3250 rpm
前烘	3 分钟 @ 95 °C	2 分钟 @ 65 °C + 5 分钟 @ 95 °C	3 分钟 @ 65 °C + 7 分钟 @ 95 °C
曝光时间	140 mJ/cm2	157 mJ/cm2	170 mJ/cm2
曝光后烘烤	4 分钟 @ 95 °C	1 分钟 @ 65 °C + 5 分钟 @ 95 °C	2 分钟 @ 65 °C + 7 分钟 @ 95 °C
显影	3 分钟	5 分钟	6 分钟
坚膜烘烤（可选）	3–5 分钟 @ 200 °C	3–5 分钟 @ 200 °C	3–5 分钟 @ 200 °C

表3：用于构建包含3 μm高中心腔室的装置的光刻步骤。 中间腔室的高度：18、50 和 90 µm。

补充数据 1：masks_neuron_volume_chips.tiff。用于制备 PDMS 装置的掩模示意图（DRIE 掩模及掩模 1-3）。请点击此处下载该文件。

补充数据 2： 文件“masks_neuron_volume_chips.dxf”。该电子文件可用于制备 DRIE 掩模以及掩模 1-3。请点击此处下载该文件。

补充数据 3：“Mask_Photoresist-stripes.dxf”。用于制备光刻胶条纹光刻所用掩模的电子文件。请点击此处下载该文件。

补充数据 4： 文件 conversion_mattotiff.m 请点击此处下载该文件。

补充数据 5： 文件 importfilevol.m 请点击此处下载该文件。

讨论

由于神经元细胞具有细长的突起，对其进行体积成像对FXm技术而言是一项挑战。本方案描述了专用于神经元成像的同一类型微流控装置的多种变体。

除了微流控设计的各个方面外，物镜的选择对于荧光排阻成像至关重要，并且需要在横向分辨率和图像清晰度之间进行权衡。文献¹³已表明，当数值孔径（NA）较高，导致焦深小于腔室高度时，只要在焦点处成像，并且在感兴趣对象的轮廓与积分表面边界之间留有足够的余量，就不会影响体积测量的精度。然而，若腔室高度远大于焦深，则会因光子扩散而降低图像清晰度，使感兴趣对象的边缘变得模糊。制造高度为3 µm的腔室可显著减少这种横向模糊，即使使用高数值孔径（0.8）的40倍物镜以实现高横向分辨率观察神经元分支，也能获得极为清晰的荧光排阻图像。

芯片组装是一个关键步骤，特别是对于3 µm高的腔室而言，但按照4.1.2节所述进行仔细操作可避免顶板塌陷。由于这些薄腔室具有较高的表面积与体积比，也引发了葡聚糖浓度随时间变化的稳定性问题。我们已验证，葡聚糖在过夜孵育后的表面吸附可忽略不计：在用PBS替换葡聚糖后，柱状结构与背景之间的强度差值约为存在葡聚糖时两者初始强度对比度的千分之一。需要注意的是，神经元可能既会贴附在底部盖玻片上，也会贴附在PDMS顶板上。使用图案化盖玻片时，该现象会消失。即 当我们不在PDMS腔室内孵育粘附分子时），由于涂层仅严格局限于腔室底部。

除了其复杂的形态外，神经元由于该方法的主要局限性之一，反而较适合进行FXm分析， 即 葡聚糖内吞作用在这些细胞中非常有限。我们选用10 kDa的制剂，以在长时间（数小时）内抑制任何可见的内吞现象。

总之，FXm 的概念简单性伴随着一系列实验问题，而本方案已解决了这些问题，例如纳米级 PDMS 粗糙度和微米级腔室高度，或通过背景校正来修正柱状结构之间 PDMS 顶壁的不平整。然而，使用封闭式微流控腔室来限制荧光介质会带来一些特定限制，例如需要支撑柱，这会降低细胞黏附的有效表面积；以及必须将细胞胞体排除在中央腔室之外，以最清晰地观察神经突起，从而限制了可进行高分辨率观察的细胞区域。该方法的一个可能发展方向是摒弃这种物理限制，转而采用光学限制。未来，光片显微镜的新进展可能会与 FXm 有利地结合使用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
设备
Plasmalab System 100	Oxford Instruments		用于执行DRIE
MJB4 掩模对准器	SUSS MicroTec		SU-8 光刻
NXQ 4006 掩模对准器	Neutronix Quintel		与DRIE相关的光刻
等离子清洗机	Diener Electronic	Pico PCCE
细胞培养罩	ADS Laminaire	Optimale 12
离心机	Thermo Fisher Scientific	Heraeus Multifuge X1R
37 °C 5% CO2 培养箱	Panasonic	MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 培养箱
落射荧光显微镜	Leica	DMi8
65 至 80 °C 的PDMS烘箱	Memmert
机械轮廓仪	Veeco	Dektak 6M Stylus Profiler
光学轮廓仪	Veeco	Wyko NT9100
真空干燥器	Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware)	230KAR	直径 200 mm
超声波清洗机	Labo Moderne	SHE1000	清洗槽体积：0.8 升
加热板	Stuart SD162	SD162
掩模
DRIE			补充数据
Su8 掩模 1			补充数据
Su8 掩模 2			补充数据
Su8 掩模 3			补充数据
S1805 校准条纹			补充数据
小型实验设备
1.5 mm 打孔器	Sigma-Aldrich	29002519 (美国货号)
手术刀或剃须刀片
9" 带勺不锈钢扁铲	VWR International	82027-532	用于脱模PDMS
顶部夹持晶圆操作工具	VWR International	63042-096
弯头镊子	FST	Dumont #7 镊子 - 标准 / Dumoxel	用于操作玻璃盖玻片
基底材料
硅片	Prolog Semicor Ltd
24x24 mm 玻璃盖玻片	VWR	631-0127
光刻胶及显影剂
AZ 1518 正性光刻胶	Microchemicals GmbH		DRIE工艺前使用，厚度为1.8 µm
AZ 351B 显影剂	Microchemicals GmbH		用于显影正性AZ 1518光刻胶
SU-8 2007	MicroChem
SU-8 2025	MicroChem
SU-8 2050	MicroChem
PGMA 显影剂	Technic		用于显影SU-8负性光刻胶
Microposit S1805 光刻胶	Chimie Tech Services		用于获得0.5µm 高的结构的正性光刻胶
MF 26A 显影剂	Chimie Tech Services		用于显影正性S1805光刻胶
实验耗材
一次性塑料移液管 3 mL	LifeTechnologies - ThermoFisher
P100 培养皿	TPP	93100
20 mL 注射器	Terumo	SS+20ES1
透明胶带
方形擦拭布	VWR	115-2148
Parafilm	DUTSCHER	90260	塑料石蜡膜
化学品
(3-甲基丙烯酰氧基丙基)三氯硅烷	abcr	AB 109004
PDMS及固化剂 Sylgard 184	Sigma-Aldrich	761036
异丙醇		W292907
多聚鸟氨酸	Sigma-Aldrich	P4957 - 50 mL
无水乙醇	Sigma-aldrich	02865	99.8%
3-甲基丙烯酰氧基丙基-三甲氧基硅烷	Sigma-aldrich	M6514-25ML	(C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3
乙酸	Sigma-aldrich	71251-5ML-F
与Alexa488偶联的10kW葡聚糖	LifeTechnologies - ThermoFisher	D22910	在488 nm处有吸收峰
与Alexa647偶联的10kW葡聚糖	LifeTechnologies - ThermoFisher	D22914	在647 nm处有吸收峰
培养基
MEM	LifeTechnologies - ThermoFisher	21090-022
马血清	LifeTechnologies - ThermoFisher	26050088
B27	LifeTechnologies - ThermoFisher	12587-010
Glutamax 200 mM	LifeTechnologies - ThermoFisher	35050-061
丙酮酸钠 GIBCO 100 mM	LifeTechnologies - ThermoFisher	11360-070
庆大霉素	LifeTechnologies - ThermoFisher	15710-049
PBS	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
HBSS 10x	LifeTechnologies - ThermoFisher	14180-046
Hepes 1M	LifeTechnologies - ThermoFisher	15630-056
胰蛋白酶-EDTA	Sigma-Aldrich	59418C-100ML
Neurobasal	LifeTechnologies - ThermoFisher	21103-049
不含酚红的Neurobasal	LifeTechnologies - ThermoFisher	12348-017
软件
Matlab中用于背景归一化的程序	Quantacell	联系 Victor Racine：victor.racine@quantacell.com
ImageJ			用于选择图像分析的特定感兴趣区域
程序	ImageJ		补充数据
程序	Matlab		补充数据